Biz Mark Lucanic ve Hwai-Jong Cheng, bu video sunulan tüm hipokampal dilim düşük büyütme görüntüleri almak yardım için teşekkür etmek istiyorum. Biz Sarah Parrish de eşlik eden metin, video ile yardım için teşekkür etmek istiyorum.

Biyolistik Transfeksiyon İÇİN PROTOKOL Mermi yapma Bullets 6 aya kadar iyi, ama 2-3 ay sonra transfeksiyon verimliliği azalmaya başlayabilir. Bullets Dessicant pelet varlığında 4 ° C&#39;de muhafaza edilmelidir. Flakon açılmadan önce oda sıcaklığına mermi depolandığı sintilasyon şişeleri, her zaman izin verin. Başlamadan önce hazır olması: <ul><li> Spermidin (0.05M) </li><li> CaCl 2 (1M) </li><li> EtOH (% 100 yüksek dereceli açılmamış şişe) </li><li> Otoklavlı H 2 0 </li><li> Transfekte olarak DNA </li><li> Polyvinylpyrrolidone (PVP-20 mg / ml stok) </li><li> 2 X 15 ml konik (2/bullet set) </li><li> Boru (1 oyulmuş X ~ 30 inç / bullet seti) </li><li> Sintilasyon şişeleri (1/bullet seti) </li><li> Kuruma pelet </li><li> 10 ml şırınga w / ucunda boru </li></ul> Tüp hazırlayın: <ol><li> Kuru ~ tüp istasyonu w / N 2 gaz (0.4 basıncı) en az 20 dakika bir tüp 30 inç (yaklaşık 2 inç sağ O-halka ötesine uzanan) . </li></ol> Altın boncuk DNA çökeltisi: <ol><li> Mikrosantrifüj tüp içinde 50 μmL toplam hacmi (maksimum 50 mg toplam DNA) transfekte DNA hazırlayın </li><li> 6-8 mg altın tartmak ve bir mikrosantrifüj tüpe transfer </li><li> Altın 0.05M spermidin 100 mcL ekleyin ve 20 saniye boyunca sonikasyon </li><li> Altın / spermidin DNA&#39;nın 50 mcL ekleyin </li><li> Vortex (yaklaşık 5 ayar) w / kapağı açık </li><li> 1M CaCl 2 bilge 100 mcL bırakın . </li><li> Sonikasyon kısa süreli (&lt;5 sn) </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika çökelti izin ver </li><li> Kısaca sonikasyon </li></ol> Sonication sırasında PVP çözüm hazırlayın: <ol><li> (3,5 ml% 100 EtOH 7.5 20mg/ml PVP stokunun mcL ekleyin) mermi her set için 15 ml konik, 3.5mL seyreltik PVP PVP çözümü sulandırmak olun </li></ol> EtOH altın boncuk Durulama: <ol><li> Mikrosantrifüj 10 sn tam hızda altın boncuk Spin </li><li> Süpernatant atın, ama altın boncuk üstüne küçük bir miktar sıvı tutmak </li><li> Gerekirse 1ml EtOH 3X yıkayın, kısaca her zaman sonikasyon </li></ol> Süspanse edin PVP çözüm altın / DNA: <ol><li> 200 mcL 3,5 ml seyreltik PVP / EtOH çözüm altın pelletini tekrar </li><li> Vortex tekrar süspansiyon için altın pelet (gerekirse kısaca sonikasyon) </li><li> Yeni bir 15 ml konik, altın / PVP çözüm 200 mcL transfer </li><li> Tüm altın, 15 ml konik devredilmiştir kadar bir defada 200 mcL PVP ekleyerek, bu şekilde devam edin ve son hacmi 3.2 mL </li></ol> Kaplama tüp: <ol><li> N 2 tüp istasyonu kapatın ve kuru tüp kaldırmak </li><li> 10 ml şırınga kuru boru takın </li><li> Gayretle 15 ml konik altın / PVP ile dolu sallamak </li><li> Altın / PVP çözüm boru sonuna yerleştirin ve kabarcıkları önlemek için yavaş yavaş olmak dikkatli emmek </li><li> ~ 2 inç boru iki ucunda kuru bırakın </li><li> Boru hala şırınga bağlı ve altın / PVP çözümü ile dolu, tüp geri istasyonu içine dikkatlice yerleştirin </li><li> Mark çözüm oturur boru ucu </li><li> Altın şırınga bağlı 5 dakika dinlendiriniz </li><li> Yerleşik altın (arka yıkamak için değil emin olun) geride bırakmış, böylece şırınga çekerek çok yavaş çözüm Suck </li><li> Şırınga çıkarın </li><li> 90 ° Döndür ve 2 saniye bekletin </li><li> 180 ° döndürün ve bir 2 saniye bekletin </li><li> 5 saniye için tüp Döndür </li><li> N 2 valf 0.4 arasında okur böylece açın - 0.5 ve 5 dakika boyunca kuruma ise altın kaplamalı boru spin. </li></ol> Tüp Kesme: <ol><li> Boru boru hazırlık istasyonu çıkarın ve işaretleri biter kesti. </li><li> Etiketli bir sintilasyon flakon koyun kesme kartuşları yakalamak için boru kıyıcı altında </li><li> Tüp kıyıcı boru ve tüp temiz ustura ile kesmek </li><li> Sintilasyon flakon bir kuruma pelet yerleştirin. </li><li> 4 Mağaza kartuşları ° C </li></ol> Atıcılık Doku Dilimleri Kültürlü dilim çekerken, kontaminasyonu önlemek için nispeten steril bir teknik istihdam için çok önemlidir. Mermi iki farklı yapıları çekim yaparken, her iki seti de aynı kartuş tutucu içine yüklenmiş olabilir, ancak namlu-liner ve ekran yapıları arasında değiştirilmesi gerektiğini unutmayın. Başlamadan önce hazır olması: <ul><li> DNA mermi (açmadan önce oda sıcaklığına kadar sintilasyon flakon sıcak izin) </li><li> Doku dilimleri </li><li> Gen Tabancası Helios </li><li> Gen tabancası hortumu ile Helyum tankı bağlı &lt;/ P&gt; <li> Kartuş tutucu </li><li> Yerinde plastik Namlu liner O-ring </li><li> Difüzör (modifiye) </li><li> Difüzör Ekran </li><li> Forseps </li></ul> Hazırlayıcı gen tabancası: <ol><li> Kullanarak forseps kartuş tutucu içine altın kaplamalı plastik kartuşlarda yerleştirin. </li><li> Kartuşu tutucu kilit ilk geri iterek, gen tabancasının içine yerleştirin </li><li> Kilidi ile kartuş tutucu Güvenli </li><li> O-ring ve güvenli bir yerde difüzör ekran ile bir varil liner edinin </li><li> Gen tabancasının içine varil-liner Vida </li></ol> Gen tabancası ile kültür dilim Çekim: <ol><li> Kulak manşonlar koyun </li><li> Hortum bağlı helyum gazı tankı içine gen tabancası Tak </li><li> 180 PSI tankı üzerinde baskı </li><li> Difüzör ekranı herhangi bir toz veya enkaz kaldırmak için havaya bir boş vur. Silahı ateşlemek için, ilk tetiği çekin, sonra silah sesi çıkarıncaya kadar güvenlik kilidi düğmesini bastırın. </li><li> Boş Çekimden sonra, inkübatör dilim kaldırmak </li><li> Avans tabancası ilk inşa etmek </li><li> Yaklaşık 0.5 difüzör ekranı ile çekim dilim 1 inç </li><li> Advance kartuş kuyuları arasında. </li><li> Son iyi Çekimden sonra, kuvöz içine dilimlerini </li><li> Helyum hortum tabancası ayrılmakta önce gaz ve serbest basınç kapatın </li><li> Sökün varil liner ve kartuşunu çıkarın ve kullanılan kabuklar </li></ol> Temizleme kartuşu sahipleri ve varil gömlekleri: <ol><li> Yeri kartuşları, varil gömlekleri ve sabunlu su ile beher difüzör ekranları </li><li> 20 dakika banyo sonikatör ve sonikasyon yerleştirin beher </li><li> Tüm sabun artıkları kaldırılana kadar iyice su ile durulayın </li><li> Bir saat için% 70 EtOH yıkayınız </li><li> Kuruması için kuru kağıt havlu üzerine koyun bir gecede </li><li> Temizlik kartuşları, varil gömlekleri, ve ekranlar sonra sonraki Biyolistik transfections yeniden </li></ol> Biyolistik Transfeksiyon Sorun giderme ipuçları Biyolistik transfeksiyon bazen suboptimal transfeksiyon koşulları neden olabilir. Bu çok az ya da çok fazla hücre transfekte çok yüksek veya çok düşük ekspresyon düzeyleri yol açabilir, ya da genel olarak sağlıksız hale doku dilim neden olabilir. Genellikle sağlıksız dilimleri sonucu basınç patlama. Optimal transfekte doku dilimler elde etmek için bazı ipuçları bulunmaktadır. : Dilim (ya da çok fazla hücre / dilim transfekte varsa) deneyin sağlıksız görünüyorsa <ul><li> artan çekim mesafesi </li><li> azalan basınç gaz tankeri </li><li> altın miktarını azaltarak </li><li> Bio-Rad difüzör merkezi kesme ve difüzör ekranı ile merkezi yerine. </li></ul> Eğer çok az hücreler transfekte deneyin: <ul><li> çekim mesafesi azalan </li><li> gaz tankeri giderek artan bir baskı </li><li> altın miktarını artırarak </li><li> / iyi doku dilim sayısını artırarak </li><li> O-ring varil-liner sağlam olduğundan emin olun. </li></ul> Emin olun aynı çekim sırasında transfekte hem de çok sayıda ve çok az sayıda hücre ile dilimleri alırsanız: <ul><li> simetrik yukarıda silah tutan </li><li> bu altın eşit boru iç kaplama. (Altın bir çizgi alıyorsanız, altın yerine bir kez daha hızlı bir oranda tüp süpernatantı çizmek ve azot açmadan önce altın uzun döndürmek Öte yandan, altın şeritli, Bu muhtemelen mermi yapımı sırasında çok fazla nem maruz kalma nedeniyle boru kaplama önce iyice kurulayın ve kapakları kapaklama) zamanında mermi hazırlanıyor, EtOH açılmamış bir şişe kullanarak emin olun. </li></ul> Transfeksiyon verimliliği en iyi görünüyorsa (# hücreleri / dilim transfekte), ancak ifade seviyesi çok yüksek veya çok düşük görünüyor: <ul><li> altın oran DNA ayarlayın. (Çok düşük ise, örneğin, altın miktarı korumak, ancak DNA miktarını artırmak.) </li><li> çekim ve veri toplama arasındaki süreyi ayarlamak </li></ul> Yapıları çok az ifade alıyorsanız, çift transfeksiyon durumunda, emin olmak amacıyla, iki yapıları oranı uygun şekilde ayarlayın ve hem de yapıları aynı organizatörü altında olduğundan emin olun bir organizatörü dışı rekabet olmaz.

<ol>
	<li>Klein, T. M., Fromm, M., Weissinger, A., Tomes, D., Schaaf, S., Sletten, M., Sanford, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+foreign+genes+into+intact+maize+cells+with+high-velocity+microprojectiles.">Transfer of foreign genes into intact maize cells with high-velocity microprojectiles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 4305-4309 (1988).</li><li>Wellmann, H., Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protocol+for+biolistic+transfection+of+brain+slices+and+dissociated+cultured+neurons+with+a+hand-held+gene+gun.">Optimized protocol for biolistic transfection of brain slices and dissociated cultured neurons with a hand-held gene gun.</a> J. Neurosci. Methods. 92, 55-64 (1999).</li><li>McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biolistic+transfection+of+neurons.">Biolistic transfection of neurons.</a> Sci. STKE. 51, 1-13 (2000).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li></ol>

Biyolistik transfeksiyon transfecting hücreleri canlı doku yüksek hız DNA kaplı altın parçacıkları ile bombardımanı ile fiziksel bir araçtır. Mermi çekirdeğinde dinlenmek için geldiğinde parçacık aracılı gen transferi, genel transfekte hücreler neden. Birçok farklı Transfeksiyonu yöntemleri var iken, mikroenjeksiyon, lipofection, kalsiyum-fosfat transfeksiyon, elektroporasyon ve viral transfeksiyon gibi, Biyolistik transfeksiyon, bu diğer yöntemleri kullanarak kolayca transfekte değil hücreler transfecting için yoğun daha az emek, ve verimli bir alternatif sunabilir. Aslında, hücre duvarının varlığı, önceden var olan yöntemleri 1 transfeksiyon zorlaştırdı beri ilk bitkilerde gen transferi için bir teknik olarak geliştirilmiştir . Benzer şekilde, post-mitotik nöronlar 2,3 transfect herkesin bildiği gibi zor olduğundan biolistics nörobiyoloji alanında popülerlik kazanmıştır. Özellikle, ince bozulmamış beyin dilimleri tek nöronların morfolojisi değerlendirilmesini amaçlayan deneylerde kullanılmak üzere ilkesine tekniği yaygın olarak kabul edilmektedir. Burada açıklanan yöntemler, gen tabancası düzenlenen bir elin (Bio-Rad Helios Gen Tabancası sistemi) kullanarak kültürlü beyin dilim Biyolistik transfeksiyon nasıl gerçekleştirileceğine ilişkin detaylı ve kapsamlı bir açıklama sağlamak. Seyrek, beyin dilim boyunca hücrelerinin sayısı transfeksiyon sağlar çünkü Biyolistik transfeksiyon dilim kültüründe nöronlar transfecting için tercih edilen bir yöntem haline gelmiştir. Bu şekilde, bireysel nöronlar izolasyon incelenebilir. Bu tekniğin özellikle de beyin dilim nöronlar transfecting için uygun olduğundan, genellikle ışık saçılması doku 4 içinde derin floresan işaretli hücrelerin foton 2-eksitasyon sağlar görselleştirme bu yana, 2-foton mikroskobu ile birlikte kullanılır . Aslında bu video boyunca sunulan tek piramidal nöronlar yüksek büyütme görüntüleri özel bir dahili 2-foton lazer tarama mikroskobu kullanılarak ele geçirildi. Sonuç Biyolistik transfeksiyon çevreleyen hücreler yüksek yoğunluklu kapsamında tek tek hücrelerin transfecting etkin bir araçtır ve floresan nöronal dilim kültüründe bireysel nöronlar etiketleme gibi son derece yararlı olduğunu kanıtlamıştır.

Biz tüm ürünler ayrı ayrı listelenmiş olmasına rağmen, Bio-Rad (kedi # 165-2431) Yukarıda listelenen tüm ürünler içerir &quot;Helios Gen-Gun Sistemi&quot; satın almak için daha ekonomiktir.

preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture

Biyolistik transfeksiyon yüksek hız DNA kaplı parçacıkları ile bombardıman doku hücreleri transfecting fiziksel bir araçtır. Biz DNA kaplamalı mermi ilk hazırlık Organotipik dilim kültürlerin bir gen tabancası kullanarak nihai çekim, rat hipokampal dilim Biyolistik transfeksiyon için ayrıntılı bir protokol sağlar. Gen tabancası transfeksiyon nöronlar transfecting verimli ve kolay bir yoludur ve floresan hücrelerin doku dilim küçük bir alt etiketlenmesi için özellikle yararlıdır. Bu video ilk DNA ile kat altın parçacıkları için gerekli adımları özetlemektedir. Gelecek, plastik boru içine altın / DNA mermilerle hattına nasıl göstermek, gen tabancasının içine yüklemek için plastik kartuşları elde etmek için bu boru kesmek için nasıl. Son olarak, Bio-Rad taşıma gösteren gen tabancası Helios ve sorun giderme danışma hizmeti sunan sağlıklı ve optimal transfekte bir doku dilimler elde etmek için, sıçan hipokampal dilim kültürlerin Biyolistik transfeksiyon gerçekleştirmek.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture at JoVE.com

Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Biz DNA kaplı altın mermi hazırlanması için bir metodu tanımlar ve biolistically kültürlü hipokampal dilim nöronlar transfect gibi mermi kullanımını göstermek.

Gen Tabancası İşaretleri ve Dilim Kültür Nöronlar Biyolistik Transfeksiyon hazırlanması

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed ...

preparation-gene-gun-bullets-biolistic-transfection-neurons-slice

Research

JoVE Journal

Biology

52.2K Görüntüleme.  University of California, Davis. Biz DNA kaplı altın mermi hazırlanması için bir metodu tanımlar ve biolistically kültürlü hipokampal dilim nöronlar transfect gibi mermi kullanımını göstermek.

Video: Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Horizontal Slice Preparation of the Retina

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of retinal neurons, such as amacrine cells, expand their dendrites horizontally, so that the morphology of the cells is supposed to be severely damaged in the vertical slices. In the whole-mount preparation, especially for patch-clamp recordings, retinal neurons in the middle layer are not easily accessible due to the extensive coverage of glial cell (Mueller cell) s endfeets. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact. The slice was made horizontally at the inner layer of the retina using a vibratome slicer after the retina was embedded in the low-temperature melting agarose gel. In this horizontal slice preparation of the retina, we studied the function of retinal neurons compared with their morphology, by using patch-clamp recording, calcium imaging technique, immunocytochemistry, and single-cell RT-PCR.

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact.

Retina Yatay Dilim Hazırlık

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of ...

Biyoloji

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

Gen tabancası Transfeksiyon Hipokampal Nöronlar

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

E18 Rat Brain Organotipik Dilim Kültür

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

Myeloid dendritik hücreler kemik iliği öncüleri Kültür

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for neuronal survival and function. Neurotrophins are specifically required to maintain the survival and differentiation of innervating sensory neurons but the question of how these target-derived neurotrophins communicate to the cell body of innervating neurons has been an area of active research for over 30 years. The most commonly accepted model of how neurotrophin signals reach the cell body proposes that signaling endosomes carry this signal retrogradely along the axon. In order to study retrograde transport, a culture system was originally devised by Robert Campenot, in which cell bodies are isolated from their axons. The technique of preparing these compartmented chambers for culturing sensory neurons recapitulates the selective stimulation of neuron terminals that occurs in vivo following release of target-derived neurotrophins. Retrograde signaling events that require long-range microtubule dependent retrograde transport have important implications for the treatment of neurodegenerative disorders.

Here we describe the technique of preparing and maintaining compartmented chambers for culturing sensory neurons of the dorsal root ganglia.

Kompartman Kültürleri Dorsal Kök Ganglia Nöronlar hazırlanması ve Bakım

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Helios Gen Tabancası kullanarak Soğan Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) Testi

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

Embriyonik Fare Böbrek Nefrojenik Zone Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

Hücre Kültürü ve Hipoksi Test İndüksiyon

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Ribozom Bağlı Doğan Polipeptitler İzolasyonu<em&gt; In vitro</em&gt; MRNA boyunca Translasyonel Duraklat Siteleri Belirleme

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.