Name: floral-dip transformation of flax (linum usitatissimum) to generate transgenic progenies with a high transformation rate
Uploaded: 2014-12-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate at JoVE.com

This work was supported by the Ogelbay fund.

1. Bitkiler Yetiştiriciliği <ol><li> 6 hafta önce daldırma için, toprak ile 5 inç kaplarını doldurmak ve keten tohumlarını ekmeye ¼ (saksı başına 4 tohum) toprakta derin inç. Tohumlar üzerinde toprak firmaya emin olun. Düzenli bitkileri sulamak ve uzun gün ışığı (14 saat ışık ve 10 saat karanlık) onları korumak. </li><li> Düzenli birincil çiçek salkımına (çiçekler &#39;organlarının kümeleri) için bitkiler edin. tomurcuklar görebilir ve sadece çiçeklenme (Şekil 1 ve 2) içinde oluşturulmuş olan, bitkiler dönüşüm için hazırdır. , Tomurcukları görmek gerekirse çevresinde yaprakları kesmek için. NOT: En iyi çiçek sahne kullanmak çok önemlidir ve Tartışma ayrıntılı. <ol><li> Yan kollara daha fazla çiçek üretir gibi deneysel tedavi için bitkinin ana dalı kullanın. Yan dallar ya kontroller olarak (daldırma değil) ya da diğer deneysel tedaviler için kullanın. </li><li> Alternatif olarak, ana ve yan dalları kullanınAynı deneysel tedavi tesisi ve bir kontrol olarak ya da diğer deneysel tedavilerin bir bitki kullanımı. Bireysel şube ve tarih ve tedavi türü ile bireysel çiçek işaretlemek için etiketleri kullanın. </li></ol></li></ol> 2. Klonlama ve Dönüşüm Escherichia coli (E.coli) Hücreler için <ol><li> T-DNA barındıran bir bitki ikili vektörünün çok sayıda klonlama yerine Söz konusu parçacık, / genini klonlamak. <ol><li> Bir aşamada ya da iki aşamada klonlama yapın. <ol><li> Doğrudan bitki ikili vektör içine bu protokol (~ 500 bp) küçük uçlar klon. Bu protokolde, bitki ikili vektörü (PRI909) kullanın. Aksi takdirde, benzer bir strateji başka bitki ikili vektörleri kullanırlar. </li><li> Seçenek olarak ise, iki aşamada, büyük ekleri (≥6.5 kb), klon: ilk (spesifik bitki değildir), daha sonra bitki ikili vektöre alt-klonlamak genel ticari klonlama kiti kullanılarak. </li></ol></li></ol></li><li> PCR REAC kurmaksiyon ilgili geni amplifiye etmek için. (Kullanılan bitki ikili vektörünün çoklu klonlama sitesi göre) 5 &#39;ucunda bir sınırlama siteleri ile primerleri tasarlamak. <ol><li> Aşağıdaki döngü koşulları ile bir standart PCR genomik DNA kullanılarak, keten yapın: 24 ° C lik bir başlangıç ​​tutma, daha sonra 5 saniye boyunca 98 ° C 30 döngü, ardından 94 ° C&#39;de 2 dakika, 15 saniye için 60 ° C ve 2 dakika için 72 ° C. 4 ° C&#39;de beklemeye belirsiz, ardından 5 dakika süreyle 72 ° C&#39;de son uzatma adımı gerçekleştirir. </li><li> % 1 Tris / borat / EDTA (TBE) agaroz jeli üzerinde, ayrı PCR ürünleri, 1 saat boyunca 100 V&#39;ta jel üzerinde çalıştırıldı. Jelden ürünleri arındırın ve Nanodrop üzerinden ölçmek. </li></ol></li><li> Ticari klonlama vektörü PCR ürünü clone ligasyon karışımı ayarlayın. Üreticinin protokolünü takip ediniz. </li><li> Kimyasal olarak, yetkili E. içine ligasyon karışımı Dönüşümü aşağıdaki gibi coli hücreleri. <ol><li> Ch bir şişe içine ligasyon karışımı 2 ul ekleemically yeterli E. E. coli hücreleri. 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. </li><li> Isıtma 42 ° C&#39;de 30 saniye boyunca hücrelerin şok (ısı şoku zaman ve sıcaklık kullanılan hücre türüne göre değişir). </li><li> Buz üzerinde inkübe ve katabolik baskı (SOC) orta RT süper optimum suyu 250 ul ekleyin. </li><li> Tüp kap ve bir saat boyunca 37 ° C&#39;de 200 rpm&#39;de bir orbital çalkalayıcı içinde inkübe edilir. </li><li> 10 yayılır - bir (37 ° C&#39;de önceden ısıtılmış) önceden ısıtılmış LB plakası + uygun seçici antibiyotik her dönüşüm 50 ul (kullanılan ticari klonlama vektörü türüne göre seçici antibiyotiği belirlenmesi). 37 ° CO / N ile inkübe edin. </li></ol></li><li> Bir ticari kit kullanılarak, ~ Mini hazırlık plazmid saflaştırma için 10 koloni seçin. Miniprep plazmid arındırma genel olarak aşağıdaki gibi gerçekleştirilir. NOT: Tampon isimleri kullanılan ticari kit özgüdür ama genel işlevler benzer. <ol><li> 2 tek koloniler inoküle- (Kullanılan ticari vektör tipine göre belirlenen) uygun seçici antibiyotiği içeren 5 ml LB ortamı. </li><li> Çalkalama (~ 300 rpm) ile 37 ° C &#39;de yaklaşık 8 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> 10 dakika boyunca 6000 x g&#39;de santrifüj ile hücreler hasat edilir. </li><li> 250 ul yeniden süspansiyon tamponunda pelletini. Mix ve vorteks tamamen pelet dağıtmak için. </li><li> 6 kez - lizis tamponu 250 ul ekleyerek bakteriyel hücreler Lyse, boruları 4 tersini iyice karıştırın. </li><li> Nötralizasyon tamponunda lizatını nötralize ve 4 ters - karıştırmak için 6 kez. Bir masa üstü mikrosantrifüj üzerinde ~ 17.900 xg&#39;de 10 dakika santrifüj. </li><li> Bir spin kolon önceki adımdan Süpernatantlar aktarın. Santrifüj tekrar 30 ~ 17.900 xg - 60 saniye. </li><li> 60 saniye - 30 0.75 ml yıkama tampon ve santrifüj ekleyerek spin kolon yıkayın. Flow-through atın. </li><li> Ilave 1 dakika boyunca santrifüj remoartık yıkama tamponu ettik. Temiz bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde spin kolon yerleştirin. DNA Zehir için, her sütunun merkezine 50 ul su ekleyin. 1 dakika bekletin ve 1 dakika santrifüj. </li></ol></li></ol> 3. Ekle Varlığı için Saf Plazmidler Analiz <ol><li> Kısıtlama Digest: <ol><li> Ekleme klonlamak için kullanılan sınırlama enzimleri ile plazmidin sindirilmesi ile, ek maddenin varlığını belirlemek için bir kısıtlama sindirimi ayarlayın. Aşağıdaki gibi tipik bir çift sınırlama reaksiyonu özeti: Saflaştırılmış plazmid 1 ug, her bir sınır enzimleri 1 ul, 2 ul 10x kısıtlama (20 ul bir toplam) tampon + 2 ul BSA (eğer varsa), su ul, X sindirimi </li><li> Yavaşça karıştırın ve önerilen sıcaklıkta (bir enzim diğerine değişir) inkübe. </li><li> Kısıtlama 1 saat için 100 V çalışacak,% 1 TBE agaroz jel üzerinde reaksiyonu sindirmek ve uygun büyüklükte açılan dışarı bakmak analiz. </li></ol></li><li> PCR analizi: <ol><li> Insert veya vektör ve kartuş arasındaki kavşak içine yükseltmek için ticari vektör bölgesinden primerler kullanılarak, saflaştırılmış plazmid ile PCR ayarlayın. Ortak primerler M13 ileri ve geri ve T3 / T7 primerlerdir. </li><li> Bu protokol, aşağıdaki PCR çevrim koşulları kullanacaktır: ve daha sonra 5 saniye, 15 saniye için 60 ° C 98 ° C &#39;de 18 döngü, ardından 94 ° C&#39;de 2 dakika, ve 72 ° C, 24 ° C bir başlangıç ​​tutma 2 dakika karıştırıldı. 4 ° C&#39;de beklemeye belirsiz, ardından 5 dakika süreyle 72 ° C&#39;de son uzatma adımı gerçekleştirir. </li><li> 1 saat süre ile 120 V - bir% 1 TBE agaroz jeli üzerinde yük PCR ürünleri ve 100 çalıştırın. </li></ol></li><li> Ardışık: <ol><li> Analiz ve ekin varlığını doğrulamak için ticari bir sıralama tesisine arıtılmış plazmid gönder. </li><li> Doğru yapı elde edildikten sonra, (bitki ikili vektör içine) klonlanması ikinci adım için kullanılır. NOT: 2.3 Adımları - 3.3Klonlama bir aşamada tamamlanır elimine edilebilir. </li></ol></li></ol> Bitki, ikili vektör (PRI909) ve E. coli içine 4. Klon coli Dönüşüm <ol><li> Bitki ikili vektör doğrusallaştırmak tepkileri sindirmek bir çift kısıtlama kurmak ve primerler (2.2 adım) ilave edildi Aynı kısıtlama enzim sitelerini kullanarak önceden klonlanmış insert izole. </li><li> 2 saat - 1 için 100 V çalıştırmak jel elektroforezi kullanılarak kısıtlama digests analiz. Insert ve jelden doğrusallaşmış bitki ikili vektör kesin. </li><li> Jel ürünleri arındırmak için bir ticari kit kullanın. Üreticinin kılavuzuna başvurun. </li><li> Bitki ikili vektöre ekleme bağlamak için, ligasyon reaksiyonu ayarlayın. vektör oranı geçen parçanın boyutu ve bitki ikili vektör bağlıdır. Bu protokolde LIS1 insert 6.5 kb ve bitki ikili vektör 9 kb oldu. Vektör oranı 2 eki: Bu nedenle, 1 kullanın. </li><liBakteriyel dönüşüm, plazmid saflaştırma ve analiz için 3 -&gt; tekrarlayın 2.4 adımları. Doğru yapı (insert + bitki ikili vektör) elde edildikten sonra, 5. adımda elektroporasyon geçin. </li></ol> Agrobacterium 5. Elektroporasyon Elektrikli yetkili hücreler tumefaciens <ol><li> Agrobacterium bir şişe buz üzerinde elektriksel yetkili hücreleri tumefaciens çözülme. </li><li> Buz üzerinde, yetkin hücre 20 ul ikili vektör plasmid DNA 1 ng ekleyin ve yavaşça karıştırın. </li><li> Buz üzerinde 0.1 cm elektroporasyon küvetine soğutun. </li><li> Elektroporasyon küvetler yetkili hücre / DNA karışımı aktarın ve alt karışımı toplamak için dokunun. Electroporator makine ve nabız küveti koyun (voltaj ve zaman koşulları küvetin büyüklüğüne ve kullanılan elektroporatörü bağlıdır). </li><li> 15 ml&#39;lik bir tüpe SOC ortam ve transfer hücre 1 ml ilave edilir. </li><li> 28-30 &#39;de 1 saat süreyle inkübe edin100 rpm&#39;de sallayarak, C °. Levha 50 - LB agar + uygun seçici antibiyotiği hücre 100 ul (bitki ikili plazmid ve kullanılan Agrobacterium ırklarına dayanıyor 50 ug / ml kanamisin ve 100 ug / ml streptomisin, bu protokol kullanımında.). </li><li> 30 ° C - 28 48 saat kadar inkübe edin. </li><li> Koloni seçimi ve plazmid saflaştırma için yineleyin 2.5. </li><li> 3. adımı yineleyin plazmid analiz etmek ve çiçek-daldırma için yapı kullanmadan önce insert ve T-DNA&#39;nın bütünlüğünü kontrol etmek. Aşama 3.3&#39;te olduğu gibi, tüm uç bölgede ve T-DNA bölgeleri boyunca ve dizileme ile birden çok PCR primerleri kullanılarak adımı tekrar 3.2. NOT: Bu protokolde 4 farklı primerler, T-DNA ve insert genelinde 10 primerleri genelinde tasarlanmıştır. </li><li> Ben seçilmiş Agrobacterium kolonisi bitki ikili plazmid varlığı onaylandıktan sonra, yer hücreleri-80 ° C de, n,% 50 gliserol ve saklayın. Bunlar, bir hafta 7 içinde kullanılacak ise deposu 4 ° C plaka üzerinde koloniler kalmıştır. </li></ol> 6. Çiçekli-Daldırma Not: 2 gün önce çiçek-daldırma için: <ol><li> Sıvı ortamda LB + uygun antibiyotikler - sabit faz (kabul edilebilir 1 600 0.5 arasındaki OD) Agrobacterium hücreleri büyür. Not: Bu bitki ikili vektör ve kullanılan Agrobacterium soyu türüne göre, Aşama 5.6 ile aynı antibiyotik bulunmaktadır. </li><li> 1 ile başlangıç ​​kültürü: doymuş (5 mi) O / N kültürün 100 seyreltiler ve 24 büyümek - 150 rpm ile çalkalanarak bir 28-30 ° C&#39;de 48 saat süredir. Kültür midlogarithmic faz ulaşmış olmalıdır ve daha büyük olasılıkla yaklaşan veya sabit faz 1 olacak. Yaklaşık 0.8 OD (0.5 ila 1 arasında yine OD tüm kabul edilebilir) 8. 5.000 x santrifüj hücreleri toplayınoda sıcaklığında örn. </li><li> Sızma orta hücrelerin tekrar (% 5.0 sakaroz + ,05-,003% Silwet L-77). Daldırma ilk turda için,% 0.05 Silwet-77 kullanın. İkinci ve üçüncü turlarda için, (Tartışma ayrıntılı)% 0.03 ile konsantrasyonunu azaltmak. </li><li> Çiçek-daldırma adım ile devam edin. Yan bitki yatırın ve 1-2 dakika sızma ortamında yalnızca görünür tomurcukları batırın. Yan bitki bırakın ve kubbe (Şekil 3) yüksek nem korumak için plastik örtü ile örtün. </li><li> Bir sonraki gün, dik bir konumda bitki yer ve normal olarak korur. </li><li> Tomurcuk (genellikle yaklaşık 10 sonra - 14 gün) daha büyüdüğünde - 6.4, 6.1 tekrar adımları. 0.003% 60 sn ve Silwet-77 konsantrasyon - 30 daldırma süresini azaltın. </li><li> Onların tohumları (Şekil 4) tahsil edilecek olgun ve hazır olana kadar normal bitkiler koruyun. </li></ol> Pozitif Tra 7. SeçimiDoğrudan PCR ile nsformants <ol><li> Adım 1.1 gibi toprağa T1 tohumlarını ekmeye. <ol><li> Seçenek olarak ise, 500 ml su içinde, agar MS ortamı + 4 g, 2.2 g eklenmesi ile Murashige ve Skoog bazal tuz ortamı (MS ortamı) görünür. Otoklav ve küçük bitki tencere içine dökün. Kullanılana kadar 4 ° C&#39;de muhafaza edin. </li><li> Katılaşmış MS ortamı üzerinde yerleştirerek tohum Sow. Uzun gün ışığı (14 saat ışık ve karanlık 10 saat) altında tutun. 6 gün (Şekil 5) - Tohumlar yaklaşık 4 çimlenir. </li><li> Bir başlangıç ​​noktası olarak, her çiçekten bir tohum kullanın. Hiçbir olumlu Transformant elde edilirse, çiçek başka tohum seçerek bu adımı tekrarlayın. NOT: Aynı çiçeklerden Testi farklı tohumlar, bazı durumlarda bir çiçek bütün tohumlar dönüştürülmüş olacak çünkü. Deneysel çiçek ek tohum seçilmesi bazen gereklidir. </li></ol></li><li> Düzenli fide kontrol edin. Yaklaşık 10 - çimlenme sonrası 14 gün, ne zaman doğrugeliştirmek direkt PCR ile bitkiler testi bırakır. </li><li> 3 yaprak - 2 keserek yaprak ekstresi, DNA hazırlayın - Her fide (5 ağırlık 10 mg) ve bir mikrosantrifüj tüp koyun. </li><li> Her bir tüpe 50 mM NaOH, 180 ul ekleyin ve 95 ° C&#39;de 10 dakika inkübe edilir. </li><li> 1 M Tris-HCl (pH 8.0) 20 ul eklenmesi ile özü nötralize. </li><li> Pozitif dönüştürücüleri seçmek, T-DNA ya da parçası (Şekil 7) üzerinde tasarlanan primerler kullanılarak, doğrudan PCR reaksiyonunda ekstresi 1 ul kullanın. <ol><li> Bu protokol, 24 ° C lik bir başlangıç ​​tutma doğrudan PCR kullanarak, daha sonra 10 saniye, 15 saniye, tavlama aşamasında, 68 ° C&#39;de bir uzatma aşaması 98 ° C (40 döngü, ardından 98 ° C&#39;de 2 dakika, C). 4 ° C&#39;de beklemeye belirsiz, ardından 5 dakika boyunca 68 ° C&#39;de son uzatma adımı gerçekleştirir. (Döngüleri için primer, tavlama sıcaklıkları ve uzatma süreleri ile ilgili ayrıntılar için Tablo 1&#39;e bakınız). </li></ol></li><li> Pozitif dönüştürücüleri tanımak ve olgunluk onları büyümek. Tohumlar daha büyük bir kap içinde toprağa MS ortamına nakli çimlendirilmiştir durumunda (Şekil 5). </li></ol>

<ol>
	<li>Bent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+thaliana+floral+dip+transformation+method.">Arabidopsis thaliana floral dip transformation method.</a> Methods Mol Biol. 343, 87-103 (2006).</li><li>Beranova, M., Rakousky, S., Vavrova, Z., Skalicky, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonication+assisted+Agrobacterium-mediated+transformation+enhances+the+transformation+efficiency+in+flax+(Linum+usitatissimum+L.).">Sonication assisted Agrobacterium-mediated transformation enhances the transformation efficiency in flax (Linum usitatissimum L.).</a> Plant Cell Tiss Organ Cult. 94, 253-259 (2008).</li><li>Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+site-specific+insertion+sequence+in+flax+genotrophs+induced+by+environment.">A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by environment.</a> New Phytol. 167, 171-180 (2005).</li><li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana.">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16 (6), 735-743 (1998).</li><li>Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Control+of+Rapid+Genomic+Changes+in+Flax.">Mechanisms and Control of Rapid Genomic Changes in Flax.</a> Ann Bot. 95, 201-206 (2005).</li><li>Dong, J. Z., McHughen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+procedure+for+production+of+transgenic+flax+plants+using+Agrobacterium+tumefaciens.">An improved procedure for production of transgenic flax plants using Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Sci. 88, 61-71 (1993).</li><li>Logemann, E., Birkenbihl, R. P., Ulker, B., Somssich, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+preparing+Agrobacterium+cells+that+simplifies+the+Arabidopsis+transformation+protocol.">An improved method for preparing Agrobacterium cells that simplifies the Arabidopsis transformation protocol.</a> Plant Methods. 2 (16), (2006).</li><li>Mara, C., Grigorova, B., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral-dip+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+to+examine+pTSO2::&#946;-glucuronidase+reporter+gene+expression.">Floral-dip transformation of Arabidopsis thaliana to examine pTSO2::&#946;-glucuronidase reporter gene expression.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li><li>Mlynarova, L., Bauer, M., Nap, J. -. P., Pretova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+Agrobacterium-mediated+gene+transfer+to+flax.">High efficiency Agrobacterium-mediated gene transfer to flax.</a> Plant Cell Rep. 13, 282-285 (1994).</li><li>Mu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+maize+female+inflorescence+following+floral+dip+method+mediated+by+agrobacterium.">Genetic transformation of maize female inflorescence following floral dip method mediated by agrobacterium.</a> Biotechnology. 11 (3), 178-183 (2012).</li><li>Trieu, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Medicago+truncatula+via+infiltration+of+seedlings+or+flowering+plants+with+Agrobacterium.">Transformation of Medicago truncatula via infiltration of seedlings or flowering plants with Agrobacterium.</a> Plant J. 22 (6), 531-541 (2000).</li><li>Yasmeen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Planta+transformation+of+tomato.">In Planta transformation of tomato.</a> Plant Mol Biol Rep. 27, 20-28 (2009).</li><li>Zale, J. M., Agarwal, S., Loar, S., Steber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+stable+transformation+of+wheat+by+floral+dip+in+Agrobacterium+tumefaciens.">Evidence for stable transformation of wheat by floral dip in Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Cell Rep. 28, 903-913 (2009).</li><li>Zhan, X. C., Jones, D. A., Kerr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+flax+plants+transformed+by+Agrobacterium+rhizogenes.">Regeneration of flax plants transformed by Agrobacterium rhizogenes.</a> Plant Mol Biol. 11, 551-559 (1988).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Böyle keten (Linum usitatissimum) gibi bazı bitki türlerinin,, başarılı bitki transformasyon sınırlı olmuştur. Daha önce, keten dönüşüm yaralama ve ortak ekimi, biyolistik parçacıkları uygulayarak ya da rejenerasyon ardından ultrason sonikasyon kullanarak bir Agrobacterium enfeksiyonu gerektiriyordu; Uzun ve eğilimli hem bir süreci birçok mutasyon olayları eşlik ediliyor. Ayrıca, bu teknikler arasında seçim süreci kanamisin gibi antibiyotik seçilebilir markerlerin kullanılmasını gerektirir. Bununla birlikte, keten antibiyotik 6,9,14 yüksek konsantrasyonlarda kaçış eğilimi seçimi bu yöntem, bir çok yanlış pozitif üreten literatürde not edilmiştir. Keten dönüşüm önceki tekniklerin bir diğer dezavantajı düşük dönüşüm oranları 2,6 olmuştur. Burada anlatılan protokolde, çiçek-daldırma yoluyla Agrobacterium aracılı bitki transformasyon gösterildi(-% 60 50), keten için yüksek dönüşüm oranı yeterli olmaktadır. Transformantlar, ana ve yan dallarından daldırma ve toplanan çiçeklerden elde edilmiştir. Pozitif transformantların seçimi sadece by-pass antibiyotik seçimi kullanımı, toprak T1 büyüyen bitkiler ve çimlenmiş kısa bir süre sonra yapraklarını tarama tarafından yapıldı, bir adım önce diğer bitki türleri için çiçek daldırma bir norm olarak kullanmıştır. Yaprakların doğrudan PCR testi yapılarak ve uygun T-DNA primerleri kullanılarak, pozitif transformantlar hızlı bir şekilde seçilebilir. Bu teknik, bu yöntem 1,10,12 kullanılarak daha önce Arabidopsis ve diğer bitki türleri için rapor edilen çok daha yüksek bir dönüşüm oranı basit, ucuz ve kolay uygulanabilir olması, ancak sonuçlar. Ayrıca keten en yüksek bildirilen dönüşüm oranıdır. Ancak, en iyi çiçek aşamasının seçimi ve iyi yüzey aktif madde konsantrasyonu gibi işlemlerde önemli adımlar, böylece oradaAgrobacterium çiçek organları öldürmeden bitki hücrelerine nüfuz edebilir. Erken sürgün aşamasında fazla% 0.05 yüksek Silwet-77 konsantrasyonu ile (Şekil 2A) kullanılırsa, çiçek geliştirme veya tohum vermeyecek. Dönüşüm çalışabilir, ancak son tomurcuk aşamasında (Şekil 2C) kullanılırsa, bu, çok daha düşük bir oranda gerçekleşir. Benzer sonuçlar Arabidopsis çiçek daldırma dönüşüm 1,4 ile elde edilmiştir. Bu protokol, tüm çiçek aşamaları ikinci daldırma ile, ardından farklı Silwet-77 konsantrasyonları ile test edilmiştir ve iyi aşama birinci daldırma için% 0.05 Silwet-77 orta tomurcuk aşama (Şekil 2C) olduğu belirlendi 0.03% biraz daha azalmış Silwet-77 konsantrasyonu ile geç tomurcuk sahne (Şekil 2C). Bu dönüşüm ayrıca, ardından% 0.003 düşük Silwet-77 konsantrasyonu ile erken tomurcuk aşama (Şekil 2A) ile çalıştı% 0.05 yüksek Silwet-77 konsantrasyonunda orta tomurcuk aşamasında (Şekil 2B) olan bir ikinci daldırma. Bu protokolde, diğer bazı parametreler dönüşüm oranını optimize çalıştı, ancak nihai sonuç üzerinde hiçbir etkisi olduğu bulunmuştur. Örnekler bitkiler tarafında yatıyordu ve bir gün iki gün plastik kaplı olduğunu daldırma süre sonra uzanan içerir; Agrobacterium kültürü için birden fazla 1 OD kullanılarak yerine 0,5-1; 15 dakika yerine 1 - - 2 dakika 5 daldırma süresini arttırmak. Yine bu stratejileri kullanarak dönüşüm oranı üzerinde herhangi bir etkisi fark değil. En etkili faktör, bununla birlikte, doğru çiçek aşamalarında sağlıklı bitkiler kullanılarak, ve en iyi Silwet-77 konsantrasyonu kullanılarak bulunmuştur. Biz iki daldırma aralıkları, bir kez daldırma da çalışır halde, nedense daha iyi bir zaman çalıştığını fark ettim. Bu protokole modifikasyonu reducin ile elde edilebilirg ikinci veya üçüncü daldırma olarak az 0.003 olarak% kadar Silwet-77 konsantrasyonu. Silwet-77 toksik olduğu için, çiçek çok yüksek bir konsantrasyon sonucu herhangi bir tohum verimi ile sonuçlanır kötü geliştirilmesi. bitkiler, sağlıklı görünümlü değil ve tomurcukları iyi gelişmekte değilse, ikinci veya üçüncü olaylar ortadan ile daldırma frekansı, birine azaltılabilir. Bu tekniğin önemli bir sınırlama, keten, her bir çiçekten elde edilen tohum sınırlı sayıda ve keten uzun yaşam döngüsü tarafından üretilen çiçek düşük sayıdır. T1 nesil almak için 10 hafta sonrası daldırma - ilk daldırma için hazır birincil tomurcukları ve ek 8 için tohum ekimi 8 hafta 6 - alır. Toplamda, 5 bir dizi - 6 ay T1 nesil elde etmek gereklidir. Diğer bitki türlerinin aksine hangi çiçek yılın her zaman, yıllık belirli zamanlarda bazı keten çeşitleri çiçek daha iyi. Bu teknik için çok düşünceli planlama önemlidir. <p clÖzetle eşek = &quot;jove_content&quot;&gt;, iki farklı keten çeşitleri ile çiçek dip bizim sonuçlarımız: keten, Stormont Cirrus (duyarlı ve plastik), ve yağ keten, (stabil olmayan duyarlı) Bethune, bu Agrobakteriyi gösteriyor - çiçek daldırma ile uyumlu bitki transformasyon keten transformasyonu için uygulanabilir ve etkili bir yöntem olup, keten transformasyonu için daha önce kullanılan tekniklerle yerine kullanılabilir. Bu protokolde çiçeksi-daldırma yöntemi tadilatları, diğer bitki türlerinden ile kullanım için uygulanan ve keten ile sınırlı olmayacaktır.

Keten (Linum usitatissimum) kendi lifleri ve yağlar için yaygın olarak yetiştirilen önemli bir üründür. Keten genomunun dönüşüm örneğin yaralanma, Agrobacterium enfeksiyonuna ve doku kültürü içinde ko-kültivasyonu, rejenerasyonunun ardından biyolistik tanecikleri veya ultrason sonikasyon uygulama gibi tekniklerle mümkündür. Ancak, bu teknikler çok mutasyon olayları eğilimi ve transjenik çizgiler elde etmek üzere uzun bir süre de dahil olmak üzere pek çok dezavantajları vardır. Bu yöntemlerin bazıları, aynı zamanda pahalı olabilir ve düşük kurtarma fide sonuçlanan araçların yetenekli ve etkili manipülasyon gerektirebilir. En önemlisi, bu teknik genellikle düşük dönüşüm oranları 2,6 sonuçlanır. Çiçek-daldırma yoluyla Agrobacterium aracılı bitki transformasyon transgenik bitkiler oluşturmak için basit ve etkili bir yaklaşımdır. Bu rutin olarak ve başarılı Arabidopsis thaliana gibi birçok bitki türleri için kullanılmaktadırbir 1,4-ta, medicago truncatula 11, domates 12, buğday 13 ve mısır 10. Ancak, bu tür nedeniyle keten tarafından üretilen çiçekler düşük sayılar gibi çeşitli faktörlere, keten dönüşümü için uygun bir teknik olarak düşünülmüş değil, her çiçek, tohum boyutu büyük ve kalın ceket elde edilen tohumların sınırlı sayıda, aynı zamanda genetik transformasyon süreci için sorunlu olabilir hangi. Yavrularıyla olmayan transforme ya çimlenme veya çimlenme ama çamaşır suyu yok iken Ayrıca, çiçek daldırma tekniği seçimi segmenti, filizlenmeye ve yeşil kalmak için kendi yeteneklerine göre ayırt dönüştürülmüş progeny&#39;lerinde bir antibiyotik içeren bir bitki medyada dönüştürülmüş tohumların çimlenme gerektirir dışarı hızlı ve ölür. Mevcut literatürde, vahşi tip keten esaslı yalancı pozitif sonuçlar üreten, ve T1 progeny&#39;lerinin seçim yapmak, antibiyotik seçimleri yüksek konsantrasyon kaçmak eğiliminde olduğu görülmüştürAntibiyotik direnci 6,14 daha zor. Antibiyotiğin yüksek konsantrasyon seçim ortamına ilave edildi, ayrıca, gözlenen dönüşüm oranı önemli ölçüde 9 düştü. Bu protokol, biz onun genomu 3,5 değiştirerek ortamda streslere cevap gösterilmiştir elyaf keten, Stormont cirrus (duyarlı ve plastik), bir çizgi dönüştürmek için Agrobakteriyi ve çiçek daldırma yöntemi kullanılmıştır. Antibiyotik kaçış sorunu aşmak için, biz bitki medyaya antibiyotik ekleyerek yerine seçim, T1 yapraklarından DNA&#39;nın doğrudan PCR testi yapmak için seçtiniz. Biz tedavi sırasında belirli çiçekler izlemek için keten basit anatomi yararlandı. Bu izleme sistemi antibiyotik eklemeden toprağa belirli çiçekler ve çimlenme gelen tohum seçimi izin. Pozitif transformantlar sadece DNA hızlı ve etkili bir yöntem kullanılarak o yapraklarından elde edilen testlerin yapılmasını tespit edildif direkt PCR. Bizim sonuçlarımız çiçek daldırma yöntemi keten bu hat çok iyi çalıştı ve şaşırtıcı bir çok yüksek dönüşüm oranı sonuçlandı göstermek - daha önce olduğu bildirildi Arabidopsis thaliana, gözlemlenen daha yüksek, (50% 60) 0,1-1 % 1 ve diğer bitki türlerinin 10,12 daha da yüksektir. Biz de keten tohumu (keten yağı) başka çeşitli Bethune test (stabil ve duyarlı olmayan), ve bizim ön veriler çiçek daldırma da keten bu çeşitli çalıştığını gösterir. Bu protokolün amacı, Agrobacterium ve çiçek daldırma transgenik keten oluşturmak için kullanılabileceğini göstermektir. Bu teknik, basit, pahalı olmayan ve keten dönüşümün diğer yöntemlere göre daha hızlı olduğunu göstermektedir. Daha da önemlisi, keten dönüşüm 2,6 diğer yöntemlere göre çok daha yüksek bir dönüşüm oranı ile sonuçlanır. Birçok şubesi ve çiçekleri vardır Arabidopsis thaliana&#39;nın anatomisi, makes zor daldırma ve aynı bitki üzerinde çiçek olmayan daldırma ayırt etmek üzere. Bu nedenle, tohumların çok sayıda, bitki başına yaklaşık 20,000 tohum, pozitif dönüştürücüleri 8 tanımlamak amacıyla taranması gerekir. Keten, diğer taraftan, mümkün bireysel çiçekler izlemek ve süreci tarama sırasında belirli tohum seçmek için yapar bitkilerin başına yaklaşık 100 tohum üreten az sayıda şube (bir ana dal ve yan dal birkaç) ve daha az çiçek vardır. Biz çiçek daldırma keten ilgili herhangi bir tür, yaklaşık 200 türün bir cins dönüştürmek için uygulanabilir bir yöntem olduğunu öneriyorum. Bu yöntem keten dönüşümün diğer yöntemlere göre çok daha yüksek dönüşüm oranı verir. Biz de T1 yaprak DNA&#39;nın doğrudan PCR taraması genellikle birçok yanlış pozitif üretir antibiyotik direnç kaçış sorunu aşmak için etkili bir yol olduğunu öneriyorlar. Doğrudan PCR taraması herhangi bir başka bitki türlerine uygulanabilir ve t sınırlı değildirketen o. Bu protokolde kullanılan basit bir tohum izleme yöntemi keten benzer anatomik dallanma ile herhangi bir diğer bitki türlerine uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety (PL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5&quot; pots</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potting soil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Greenhouse with appropriate light setting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose gel electropheresis equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digital imaging setup</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silwet-77</td><td>LEHLE SEEDS</td><td>VIS-01</td><td>Toxic, wear gloves</td></tr><tr><td>GoTaq Green Master Mix</td><td>Promega</td><td>Part# 9PIM712</td><td></td></tr><tr><td>Terra PCR Direct Polymerase Mix</td><td>Clontech</td><td>639270</td><td></td></tr><tr><td>Binary vector PRI 909</td><td>Takara</td><td>3260</td><td></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens LBA4404 E</td><td>Takara</td><td>9115</td><td></td></tr><tr><td>TOPO TA cloning kit</td><td>Invitrogen</td><td>K4595-01</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electroporator and cuvettes</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2092</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spinner</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic wrap and aluminum foil wrap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>speedSTAR DNA polymerase</td><td>Takara</td><td>RR070A/B</td><td></td></tr><tr><td>QlAquick gel extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN plasmid mini kit</td><td>Qiagen</td><td>12123</td><td></td></tr><tr><td>SalI-HF enzyme</td><td>NEB</td><td>R3138S</td><td></td></tr><tr><td>SacI-HF enzyme</td><td>NEB</td><td>R3156S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligation kit</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>Murashige Skoog</td><td>Sigma</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>A360-500</td><td></td></tr></tbody></table>

floral-dip transformation of flax (linum usitatissimum) to generate transgenic progenies with a high transformation rate

Çiçeksi-daldırma yoluyla, Agrobacterium aracılı bitki transformasyon bitki transformasyonu alanında yaygın olarak kullanılan bir teknik olan ve çok sayıda bitki türleri için başarılı olduğu rapor edilmiştir. Ancak, çiçek daldırma ile keten (Linum usitatissimum) dönüşümü rapor edilmemiştir. Bu protokolün amacı bu Agrobacterium kurmak ve çiçek daldırma yöntemi transgenik keten oluşturmak için de kullanılabilir. Bu teknik, basit, pahalı olmayan ve etkili olan ve daha da önemlisi, keten dönüşüm akımı mevcut yöntemlere göre daha yüksek bir dönüşüm oranı elde edildiğini göstermektedir. 2 dakika - Özetle, keten inflorescences 1, bir ikili vektör plazmid (T-DNA fragmanı ayrıca Linum ekleme dizisi, Lis-1) taşıyan Agrobacterium çözeltisi içinde bekletilir. Bitkiler 24 saat kendi tarafında düz atıldı. Daha sonra, bitkiler bir sonraki işlem yapana dek, normal gelişim koşulları altında muhafaza edilmiştir. süreçdaldırma ile, 14 günlük aralıklarla - yaklaşık 10 ile 3 kez, - daldırma s 2 tekrarlandı. T1 tohumları toplanır ve toprağa çimlendirilmiştir. Yaklaşık iki hafta sonra, muamele edilen nesiller, doğrudan PCR ile test edilmiştir; 2-3 yaprak bitki artı uygun T-DNA primerleri başına kullanılmıştır. Pozitif transformantlar seçilir ve olgunlaşana kadar büyütülmüştür. pozitif dönüştürücüleri olarak muameleden geçirilmiş olan bitkilerin tohumlarının% 60 - dönüşüm hızı 50 ile, beklenmedik bir şekilde yüksek olmuştur. Bu Arabidopsis thaliana ve çiçek daldırma dönüşüm kullanarak diğer bitki türleri için bildirilenlerden daha yüksek bir dönüşüm oranıdır. Bu transformasyon için başka yöntemler kullanarak keten transformasyonu için, aynı zamanda bugüne kadar rapor edilmiş olan, en yüksek düzeydedir.

Şekil 1-4 protokol dahilinde bazı adımları göstermektedir. Şekil 1 ve 2, çiçeklenme tomurcukları etrafında yaprakları Agrobacterium hücreleri ve protokolü geliştirmek için kullanılan farklı tomurcuk aşamalarında bunları ortaya çıkarmak için kesilir. 3 keten çiçek daldırma işlemi göstermektedir. Şekil 4, gösteren bir takip ve tespit edilebilir nasıl ana ve yan dallar etiketli olabilir ve nasıl bireysel çiçekler örneği. Şekil 5 T1 yavrularıyla, MS bitki medyada çimlenmiş ve daha sonra vade için toprağa nakledilen nasıl gösterir. Şekil 6 nasıl vahşi göstermektedir tipi keten literatürde 6,9,14 önceki bulguları teyit kanamisin yüksek konsantrasyonlarda kaçabilir. Şekil 7, pozitif T1 transformantlar arasında doğrudan PCR amplifikasyonunun bir örneğini göstermektedir. T1 çiçekler m toplandıTek bir T0 bitkinin ain ve yan sürgünler. Doğrudan PCR görülebileceği gibi, 12/08 T1 bitkiler PCR ile pozitif test edilmiş ve T-DNA üzerinde farklı bölgeleri amplifiye. Bizim primerleri Lis-1 ek ve çok sayıda klonlama konumu (Şekil 7B ve C) arasında tasarlanmıştır. Biz, sol sınır ve NOS terminatörü (veriler gösterilmemiştir) ya da sağ sınır ve çoklu bir klonlama bölgesi (Şekil 7D), T-DNA &#39;nın farklı segmentinin amplifiye edilmesi bitki ikili vektöründen ek primerler kullanıldı. LIS-1 ekleme özgü primerler de bu protokol kullanıldı (veriler gösterilmemiştir). Primerlerin listesi Tablo 1 &#39;de verilmiştir. Bununla birlikte, bu primerlerin sekansları, T-DNA bitki ikili vektör sekansı ve çiçek daldırma için kullanılan ekleme bağlıdır. Biz de ana ve yan dallar toplanan çiçekler arasında dönüşüm oranı açısından anlamlı bir fark olmadığını kaydetti. Birincil çiçeklenme tomurcukları etrafında yaprakları Kesme Şekil 1. Agrobacterim hücreleri bunları ortaya çıkarmak için. (A) tomurcukları yaprakları ile kaplıdır. (B) Yapraklar bunları ortaya çıkarmak için tomurcukları etrafında kesilmiştir. (C) bitkiden görüntü Büyütülmüş tomurcukları maruz kestikten sonra (A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52189/52189fig2highres.jpg" /> Şekil 2. çiçek dalış için kullanılacak en iyi evresini belirlemek için bu protokolü kullanılan farklı tomurcuk aşamaları. (A) erken evre tomurcuk approxima olduğunu<html> tely 2 mm. (B) orta kademe tomurcuk yaklaşık 5 mm&#39;dir. (C) Geç evre tomurcuk yaklaşık yaklaşık 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52189/52189fig3highres.jpg" /> Şekil 3. keten çiçek-daldırma işlemi. (A), birinci salkımına daldırma bitkiler ertesi güne kadar düz belirtilen (C). (A) &#39;dan Büyütülmüş (B) gerçekleştirildi. Agrobacterium hücreleri ihtiva eden infiltrasyon ortam içinde daldırılır ve kısa kolları muhafaza etmek plastik ile kaplanmıştır Yüksek nem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Her zaman &quot;&gt;:&quot; tutmak-together.within-sayfa = fo &quot;jove_content <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52189/52189fig4highres.jpg" /> . Şekil 4. T0 tedavi bitkilerden çiçek izleme ve tohum koleksiyonları süreci, (A) ana dal (merkezi uzun şube) ile tüm bitki örneği ve yan dallar (B - D). Bir . farklı branşlardan çiçek örneği (E) Bireysel çiçeklerden toplanan tohumların bir örnek (etiketli - k). ana dalından <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig4highres.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52189/52189fig5highres.jpg" /> Şekil 5. T1 fidanları antibiyotik seçimi olmadan yetiştirilmektedir. (A) T1 tohumları vardırMS bitki medya çimlenmiş. (B) Olumlu transformanlar, direkt PCR tarafından belirlenen, toprağa nakledilen ve vadeye kadar büyütülür. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52189/52189fig6highres.jpg" /> Şekil 6. Antibiyotik kaçış, T1 seçimi için bir sorun, doğrudan PCR taraması ile aşılır. Antibiyotik olmadan MS bitki medya çimlenmiş (A) Yabani tip keten tohumu. (B) Yabani tip keten tohumu, MS bitki medya + artan konsantrasyonları üzerinde çimlenmiş ve kanamisin (200 mg / ml, 600 ug / ml, 1 mg / ml). vahşi tip keten ve T1 ila 2 mg / ml kanamisin. (D), PCR MS bitki ortam üzerinde yeşertilmiş (c) vahşi-tür keten tohumu kanamisin primerler kullanılarak, fide tüm çoğaltılan, C DNA işaretleyici, FlaxS, vahşi tip flaxS: EZ1: kanamisin geni (efsaneleri ified olmayan daldırma dalı kontrol Ma: çiçekten T1 döl &quot;bir&quot; ana dal toplanan, Sc, Sd, Se, Sf: yan dal, W toplanan değişik çiçek &quot;c, d, e, f&quot; T1 yavrularıyla:. no-DNA) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig6large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/52189/52189fig7highres.jpg" /> Şekil 7. direkt PCR yöntemi kullanılarak T1 progeny&#39;lerinin başarılı PCR amplifikasyonlarının bir örnek. Bitki ikili vektör + klonlanmış LIS-1 ucun (A) şeması. Mavi oklar (Takara değiştirilmiş) doğrudan PCR taramasında kullanılan PCR primerleri konumunu göstermektedir. (B), PCR primerleri, M13F + ile 3 &#39;(C), PCR ile primerler M13R + 18a <strong&gt; primerler sağ sınırında (RB) ve çoklu klonlama sitesi (MCS) ile (D) PCR ** Her kulvar bireysel C toplanan çiçeklerden T1 temsil: Kontrol şube (non-daldırma), M: Ana dal çiçek ag, S: Yan dal çiçek bc &#39;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> İleri primer dizisi kaynağı </td><td> dizisi 5&#39;-3 &#39; </td><td> Ters primer dizisi kaynağı </td><td> Sekans 5&#39;-3 &#39; </td><td> Tavlama Sıcaklık (° C) </td><td> Uzatma Süresi (sn) </td><td> Beklenen boyutta (bp) </td></tr><tr><td> M13F (T-DNA) </td><td> CTGCAAGGCG ATTAAGTTGG </td><td> 3 &#39;(LIS-1 ekleme) </td><td> GAGGATGGAA GATGAAGAAGG </td><td> 57 </td><td> 40 </td><td> 450 </td></tr><tr><td> 18a (LIS-1 ekleme) </td><td> TATTTTAACCC <td> M13R (T-DNA) </td><td> ATTAGGCACC CCAGGCTTTA </td><td> 57 </td><td> 40 </td><td> 520 </td></tr><tr><td> MCS (T-DNA) </td><td> TGGTCATAGC TGTTTCCTGTG </td><td> RB (T-DNA) </td><td> TTTAAACTGA AGGCGGGAAA </td><td> 60 </td><td> 20 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> LB (T-DNA) </td><td> TTTGATGGTG GTTCCGAAAT </td><td> NOS (T-DNA) </td><td> GAATCCTGTT GCCGGTCTT </td><td> 60 </td><td> 30 </td><td> 380 </td></tr><tr><td> NPTII (T-DNA) </td><td> GCGATACCGT AAAGCACGAG </td><td> NTPII (T-DNA) </td><td> GCTCGACGTT GTCACTGAAG </td><td> 65 </td><td> 45 </td><td> 502 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. doğrudan PCR testi için kullanılan primerlerin bazı.

Watch this Scientific Journal Video about Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate at JoVE.com

Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Burada, biz çiçek daldırma yoluyla Agrobacterium aracılı bitki dönüşümü kullanarak keten dönüştürmek için bir protokol mevcut. Bu protokol için basit ve ucuzdur, ancak keten transformasyonu için mevcut veriler yöntemlere göre daha yüksek bir dönüşüm oranını verir.

Keten Çiçekli-Dip Dönüşüm (<em&gt; Linum usitatissimum</em&gt;) Yüksek Dönüşüm Oranı ile Transgenik progeny&#39;lerinde oluşturmak için

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

floral-dip-transformation-flax-linum-usitatissimum-to-generate

Research

JoVE Journal

Biology

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

29.1K Görüntüleme.  Case Western Reserve University.  Burada, biz çiçek daldırma yoluyla Agrobacterium aracılı bitki dönüşümü kullanarak keten dönüştürmek için bir protokol mevcut. Bu protokol için basit ve ucuzdur, ancak keten transformasyonu için mevcut veriler yöntemlere göre daha yüksek bir dönüşüm oranını verir. 

Video: Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the transgene, as multi-copy integrations are often subjected to gene silencing. The Gateway-compatible binary vector based on bacterial artificial chromosomes (pBIBAC-GW), like other pBIBAC derivatives, allows the insertion of single-copy transgenes with high efficiency. As an improvement to the original pBIBAC, a Gateway cassette has been cloned into pBIBAC-GW, so that the sequences of interest can now be easily incorporated into the vector transfer DNA (T-DNA) by Gateway cloning. Commonly, the transformation with pBIBAC-GW results in an efficiency of 0.2&#8211;0.5%, whereby half of the transgenics carry an intact single-copy integration of the T-DNA. The pBIBAC-GW vectors are available with resistance to Glufosinate-ammonium or DsRed fluorescence in seed coats for selection in plants, and with resistance to kanamycin as a selection in bacteria. Here, a series of protocols is presented that guide the reader through the process of generating transgenic plants using pBIBAC-GW: starting from recombining the sequences of interest into the pBIBAC-GW vector of choice, to plant transformation with Agrobacterium, selection of the transgenics, and testing the plants for intactness and copy number of the inserts using DNA blotting. Attention is given to designing a DNA blotting strategy to recognize single- and multi-copy integrations at single and multiple loci.

Using a pBIBAC-GW binary vector makes generating transgenic plants with intact single-copy insertions, an easy process. Here, a series of protocols is presented that guide the reader through the process of generating transgenic Arabidopsis plants, and testing the plants for intactness and copy number of the inserts.

Transgenik bitkiler BIBAC-GW ikili vektör kullanarak tek kopya ekleme ile oluşturma

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the ...

Genetik

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

Schrenkiella parvula is an extremophyte adapted to various abiotic stresses, including multiple ion toxicity stresses. Despite high-quality genomic resources available to study how plants adapt to environmental stresses, its value as a functional genomics model and tool has been limited by the lack of a feasible transformation system. In this protocol, we report how to generate stable transgenic S. parvula lines using an Agrobacterium-mediated floral-dip method. We modified the transformation protocol used for A. thaliana to account for unique traits of S. parvula, such as an indeterminate flowering habit and a high epicuticular wax content on leaves. Briefly, S. parvula seeds were stratified at 4 &#176;C for five days before planting. Plants were grown at a photoperiod of a 14 h light and 10 h dark and a 130 &#181;mol m-2s-1 light intensity, at 22 &#176;C to 24 &#176;C. Eight to nine week-old plants with multiple inflorescences were selected for transformation. These inflorescences were dipped in an infiltration solution of Agrobacterium tumefaciens GV3101 carrying the pMP90RK plasmid. We performed two rounds of flower dipping with an interval of three to four weeks to increase the transformation efficiency. The T1 seeds were collected and dried for four weeks in a container with desiccants before germination to screen for candidate transformed lines. Resistance to BASTA was used to screen T1 plants. We sprayed the BASTA solution three times with an interval of three days starting at two week-old plants to reduce false positives. A BASTA drop test was performed on surviving individual plants to identify true positive transformants. The transformation efficiency was 0.033%, yielding 3&#8211;4 transgenic plants per 10,000 T1 seeds propagated.

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

Agrobacterium-mediated transformation using a floral-dip method can be successfully employed to create stable transgenic lines of the extremophyte model Schrenkiella parvula. We present a protocol modified from that for Arabidopsis thaliana, considering different growth habits and physiological characteristics of the extremophyte.

Bitki büyüme ve Floral daldırma dönüşümün Agrobacterium aracılı Extremophyte Schrenkiella parvula

Schrenkiella parvula is an extremophyte adapted to various abiotic stresses, including multiple ion toxicity stresses. Despite high-quality genomic ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the flexible and efficient GreenGate cloning system with the proven and benchmarked LhGR system (here termed GR-LhG4) for the inducible expression, we have generated a set of transgenic Arabidopsis lines that can drive the expression of an effector cassette in a range of specific cell types in the three main plant meristems. To this end, we chose the previously developed GR-LhG4 system based on a chimeric transcription factor and a cognate pOp-type promoter ensuring tight control over a wide range of expression levels. In addition, to visualize the expression domain where the synthetic transcription factor is active, an ER-localized mTurquoise2 fluorescent reporter under control of the pOp4 or pOp6 promoter is encoded in driver lines. Here, we describe the steps necessary to generate a driver or effector line and demonstrate how cell type specific expression can be induced and followed in the shoot apical meristem, the root apical meristem and the cambium of Arabidopsis. By using several or all driver lines, the context specific effect of expressing one or multiple factors (effectors) under control of the synthetic pOp promoter can be assessed rapidly, for example in F1 plants of a cross between one effector and multiple driver lines. This approach is exemplified by the ectopic expression of VND7, a NAC transcription factor capable of inducing ectopic secondary cell wall deposition in a cell autonomous manner.

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Here, we describe the generation and application of a set of transgenic Arabidopsis thaliana lines enabling inducible, tissue-specific expression in the three main meristems, the shoot apical meristem, the root apical meristem, and the cambium.

İndüklenebilir, hücre türüne özgü ifade Arabidopsis thaliana aracılığıyla LhGR-aracılı Trans-harekete geçirmek

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS!

Lignin is one of the most prevalent biopolymers on the planet and a major component of lignocellulosic biomass. This phenolic polymer plays a vital structural and protective role in the development and life of higher plants. Although the intricate mechanisms regulating lignification processes in vivo strongly impact the industrial valorization of many plant-derived products, the scientific community still has a long way to go to decipher them. In a simple three-step workflow, the dual labeling protocol presented herein enables bioimaging studies of actively lignifying zones of plant tissues. The first step consists in the metabolic incorporation of two independent chemical reporters, surrogates of the two native monolignols that give rise to lignin H- and G-units. After incorporation into growing lignin polymers, each reporter is then specifically labeled with its own fluorescent probe via a sequential combination of bioorthogonal SPAAC/CuAAC click reactions. Combined with lignin autofluorescence, this approach leads to the generation of three-color localization maps of lignin within plant cell walls by confocal fluorescence microscopy and provides precise spatial information on the presence or absence of active lignification machinery at the scale of plant tissues, cells and different cell wall layers.

BLISS, a dual labeling protocol for studying lignification dynamics, was developed. Using synthetic monolignol reporters and a sequential combination of SPAAC and CuAAC bioorthogonal click reactions, this methodology paves the way to in-depth analysis of the factors that regulate the biogenesis of lignins in planta.

Lignification Dynamics ile tıklatın kimya tesislerinde görselleştirme: Çift etiketleme BLISS olduğunu!

Lignin is one of the most prevalent biopolymers on the planet and a major component of lignocellulosic biomass. This phenolic polymer plays a vital ...

Kimya

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent proteins and generation of fluorescent fusion proteins have been wildly used as an effective tool to directly visualize the protein localization and dynamics in cells. It is especially useful to compare them with well-known organelle markers after co-expression with the protein of interest. Nevertheless, classical approaches for protein co-expression in plants usually involve multiple independent expression plasmids, and therefore have drawbacks that include low co-expression efficiency, expression-level variation, and high time expenditure in genetic crossing and screening. In this study, we describe a robust and novel method for co-expression of multiple chimeric fluorescent proteins in plants. It overcomes the limitations of the conventional methods by using a single expression vector that is composed of multiple semi-independent expressing cassettes. Each protein expression cassette contains its own functional protein expression elements, and therefore it can be flexibly adjusted to meet diverse expression demand. Also, it is easy and convenient to perform the assembly and manipulation of DNA fragments in the expression plasmid by using an optimized one-step reaction without additional digestion and ligation steps. Furthermore, it is fully compatible with current fluorescent protein derived bio-imaging technologies and applications, such as FRET and BiFC. As a validation of the method, we employed this new system to co-express fluorescently fused vacuolar sorting receptor and secretory carrier membrane proteins. The results show that their perspective subcellular localizations are the same as in previous studies by both transient expression and genetic transformation in plants.

We have developed a novel method for co-expressing multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants to overcome the difficulties of conventional methods. It takes advantage of using a single expression plasmid that contains multiple functionally independent protein expressing cassettes to achieve protein co-expression.

Bitkilerde etkin bir şekilde birden fazla Chimeric floresan Fusion proteinlerin ortak ifade

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

CcCIPK14 Gene Function Analysis to Illuminate the Efficient Root Transgenic System

An efficient and stable transformation system is fundamental for gene function study and molecular breeding of plants. Here, we describe the use of an Agrobacterium rhizogenes mediated transformation system on pigeon pea. The stem is infected with A. rhizogenes carrying a binary vector, which induced callus after 7 days and adventitious roots 14 days later. The generated transgenic hairy root was identified by morphological analysis and a GFP reporter gene.To further illustrate the application range of this system, CcCIPK14 (Calcineurin B-like protein-interacting protein kinases) was transformed into pigeon pea using this transformation method. The transgenic plants were treated with jasmonic acid (JA) and abscisic acid (ABA), respectively, for the purpose of testing whether CcCIPK14 responds to those hormones. The results demonstrated that (1) exogenous hormones could significantly upregulate the expression levelof CcCIPK14, especially in CcCIPK14 over-expression (OE) plants; (2) the content of Genistein in CcCIPK14-OE lines was significantly higher than the control; (3) the expression level of two downstream key flavonoid synthase genes, CcHIDH1 and CcHIDH2, were up-regulated in the CcCIPK14-OE lines; and (4) the hairy root transgenic system can be used to study metabolically functional genes in non-model plants.

CcCIPK14 Gene Function Analysis to Illuminate the Efficient Root Transgenic System

Here we present an efficient and stable transformation system for the functional analysis of the CcCIPK14 gene as an example, providing a technical basis for studying the metabolism of non-model plants.

An efficient and stable transformation system is fundamental for gene function study and molecular breeding of plants. Here, we describe the use of an ...

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

Floral-daldırma Dönüşüm Arabidopsis thaliana Inceleyin PTSO2: β-glucuronidase Reporter Gen İfadesi

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Biyoloji

Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also associated with these genomic changes are heritable phenotypic variations 1,2. The flax variety Stormont Cirrus (Pl) when grown under three different nutrient conditions can either remain inducible (under the control conditions), or become stably modified to either the large or small genotroph by growth under high or low nutrient conditions respectively. The lines resulting from the initial growth under each of these conditions appear to grow better when grown under the same conditions in subsequent generations, notably the Pl line grows best under the control treatment indicating that the plants growing under both the high and low nutrients are under stress. One of the genomic changes that are associated with the induction of heritable changes is the appearance of an insertion element (LIS-1) 3, 4 while the plants are growing under the nutrient stress. With respect to this insertion event, the flax variety Stormont Cirrus (Pl) when grown under three different nutrient conditions can either remain unchanged (under the control conditions), have the insertion appear in all the plants (under low nutrients) and have this transmitted to the next generation, or have the insertion (or parts of it) appear but not be transmitted through generations (under high nutrients) 4. The frequency of the appearance of this insertion indicates that it is under positive selection, which is also consistent with the growth response in subsequent generations. Leaves or meristems harvested at various stages of growth are used for DNA and RNA isolation. The RNA is used to identify variation in expression associated with the various growth environments and/or t he presence/absence of LIS-1. The isolated DNA is used to identify those plants in which the insertion has occurred.

Growing some flax varieties under nutrient stress results in genomic variation within a subset of the genome and phenotypic variation. A complex insertion at a specific site is associated with growth under various nutrient regimes and with changes in gene expression around this site.

Keten içinde değişiklikler Kalıtsal Çevre İndüklenmiş

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also ...

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic pest management strategies. The most used transposable element in insect transformation is piggyBac, and piggyBac-based germline transformation has been successfully conducted in model insects. However, it is still challenging to employ this technology in non-model insects that include agricultural pests. This paper reports on germline transformation of a global agricultural pest, the fall armyworm (FAW), Spodoptera frugiperda, using the hyperactive piggyBac transposase (hyPBase).
In this work, the hyPBase mRNA was produced and used in place of helper plasmid in embryo microinjections. This change led to the successful generation of transgenic FAW. Furthermore, the methods of screening transgenic animals, PCR-based rapid detection of transgene insertion, and thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR)-based determination of the integration site, are also described. Thus, this paper presents a protocol to produce transgenic FAW, which will facilitate piggyBac-based transgenesis in FAW and other lepidopteran insects.

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Successful germline transformation in the fall armyworm, Spodoptera frugiperda, was achieved using mRNA of hyperactive piggyBac transposase.

Hiperaktif piggyBac Transposase aracılı Germline Dönüşümü Sonbahar Ordu Kurdu, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic ...

Bitkilerde Agrobakteri Aracılı Tüylü Kök İndüksiyonu ve Rejenerasyonu

Hairy Root Transformation and Regeneration in Arabidopsis thaliana and Brassica napus

Hairy root transformation represents a versatile tool for plant biotechnology in various species. Infection by an Agrobacterium strain carrying a Root-inducing (Ri) plasmid induces the formation of hairy roots at the wounding site after the transfer of T-DNA from the Ri plasmid into the plant genome. The protocol describes in detail the procedure of the injection-based hairy root induction in Brassica napus DH12075 and Arabidopsis thaliana Col-0. The hairy roots may be used to analyze a transgene of interest or processed for the generation of transgenic plants. Regeneration medium containing cytokinin 6-benzylaminopurine (5 mg/L) and auxin 1-naphthaleneacetic acid (8 mg/L) successfully elicits shoot formation in both species. The protocol covers the genotyping and selection of regenerants and T1 plants to obtain plants carrying a transgene of interest and free of T-DNA from the Ri plasmid. An alternative process leading to the formation of a composite plant is also depicted. In this case, hairy roots are kept on the shoot (instead of the natural roots), which enables the study of a transgene in hairy root cultures in the context of the whole plant.

Yazar Spotlight: Brassicaceae'de Gelişmiş Verimlilik için Tüylü Kök Bazlı Dönüşüm Protokollerinin Optimize Edilmesi

The protocol describes hairy root induction using Arabidopsis primary inflorescence stems and Brassica napus hypocotyls. The hairy roots can be cultured and used as explants to regenerate transgenic plants.

Keten Çiçekli-Dip Dönüşüm (

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Transgenik bitkiler BIBAC-GW ikili vektör kullanarak tek kopya ekleme ile oluşturma

Bitki büyüme ve Floral daldırma dönüşümün Agrobacterium aracılı Extremophyte Schrenkiella parvula

İndüklenebilir, hücre türüne özgü ifade Arabidopsis thaliana aracılığıyla LhGR-aracılı Trans-harekete geçirmek

Lignification Dynamics ile tıklatın kimya tesislerinde görselleştirme: Çift etiketleme BLISS olduğunu!

Bitkilerde etkin bir şekilde birden fazla Chimeric floresan Fusion proteinlerin ortak ifade

CcCIPK14 Gene Function Analysis to Illuminate the Efficient Root Transgenic System

Floral-daldırma Dönüşüm Arabidopsis thaliana Inceleyin PTSO2: β-glucuronidase Reporter Gen İfadesi

Keten içinde değişiklikler Kalıtsal Çevre İndüklenmiş

Hiperaktif piggyBac Transposase aracılı Germline Dönüşümü Sonbahar Ordu Kurdu, Spodoptera frugiperda

Arabidopsis thaliana ve Brassica napus'ta Tüylü Kök Dönüşümü ve Rejenerasyonu