This work was supported by the Ogelbay fund.

1. Bitkiler Yetiştiriciliği <ol><li> 6 hafta önce daldırma için, toprak ile 5 inç kaplarını doldurmak ve keten tohumlarını ekmeye ¼ (saksı başına 4 tohum) toprakta derin inç. Tohumlar üzerinde toprak firmaya emin olun. Düzenli bitkileri sulamak ve uzun gün ışığı (14 saat ışık ve 10 saat karanlık) onları korumak. </li><li> Düzenli birincil çiçek salkımına (çiçekler &#39;organlarının kümeleri) için bitkiler edin. tomurcuklar görebilir ve sadece çiçeklenme (Şekil 1 ve 2) içinde oluşturulmuş olan, bitkiler dönüşüm için hazırdır. , Tomurcukları görmek gerekirse çevresinde yaprakları kesmek için. NOT: En iyi çiçek sahne kullanmak çok önemlidir ve Tartışma ayrıntılı. <ol><li> Yan kollara daha fazla çiçek üretir gibi deneysel tedavi için bitkinin ana dalı kullanın. Yan dallar ya kontroller olarak (daldırma değil) ya da diğer deneysel tedaviler için kullanın. </li><li> Alternatif olarak, ana ve yan dalları kullanınAynı deneysel tedavi tesisi ve bir kontrol olarak ya da diğer deneysel tedavilerin bir bitki kullanımı. Bireysel şube ve tarih ve tedavi türü ile bireysel çiçek işaretlemek için etiketleri kullanın. </li></ol></li></ol> 2. Klonlama ve Dönüşüm Escherichia coli (E.coli) Hücreler için <ol><li> T-DNA barındıran bir bitki ikili vektörünün çok sayıda klonlama yerine Söz konusu parçacık, / genini klonlamak. <ol><li> Bir aşamada ya da iki aşamada klonlama yapın. <ol><li> Doğrudan bitki ikili vektör içine bu protokol (~ 500 bp) küçük uçlar klon. Bu protokolde, bitki ikili vektörü (PRI909) kullanın. Aksi takdirde, benzer bir strateji başka bitki ikili vektörleri kullanırlar. </li><li> Seçenek olarak ise, iki aşamada, büyük ekleri (≥6.5 kb), klon: ilk (spesifik bitki değildir), daha sonra bitki ikili vektöre alt-klonlamak genel ticari klonlama kiti kullanılarak. </li></ol></li></ol></li><li> PCR REAC kurmaksiyon ilgili geni amplifiye etmek için. (Kullanılan bitki ikili vektörünün çoklu klonlama sitesi göre) 5 &#39;ucunda bir sınırlama siteleri ile primerleri tasarlamak. <ol><li> Aşağıdaki döngü koşulları ile bir standart PCR genomik DNA kullanılarak, keten yapın: 24 ° C lik bir başlangıç ​​tutma, daha sonra 5 saniye boyunca 98 ° C 30 döngü, ardından 94 ° C&#39;de 2 dakika, 15 saniye için 60 ° C ve 2 dakika için 72 ° C. 4 ° C&#39;de beklemeye belirsiz, ardından 5 dakika süreyle 72 ° C&#39;de son uzatma adımı gerçekleştirir. </li><li> % 1 Tris / borat / EDTA (TBE) agaroz jeli üzerinde, ayrı PCR ürünleri, 1 saat boyunca 100 V&#39;ta jel üzerinde çalıştırıldı. Jelden ürünleri arındırın ve Nanodrop üzerinden ölçmek. </li></ol></li><li> Ticari klonlama vektörü PCR ürünü clone ligasyon karışımı ayarlayın. Üreticinin protokolünü takip ediniz. </li><li> Kimyasal olarak, yetkili E. içine ligasyon karışımı Dönüşümü aşağıdaki gibi coli hücreleri. <ol><li> Ch bir şişe içine ligasyon karışımı 2 ul ekleemically yeterli E. E. coli hücreleri. 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. </li><li> Isıtma 42 ° C&#39;de 30 saniye boyunca hücrelerin şok (ısı şoku zaman ve sıcaklık kullanılan hücre türüne göre değişir). </li><li> Buz üzerinde inkübe ve katabolik baskı (SOC) orta RT süper optimum suyu 250 ul ekleyin. </li><li> Tüp kap ve bir saat boyunca 37 ° C&#39;de 200 rpm&#39;de bir orbital çalkalayıcı içinde inkübe edilir. </li><li> 10 yayılır - bir (37 ° C&#39;de önceden ısıtılmış) önceden ısıtılmış LB plakası + uygun seçici antibiyotik her dönüşüm 50 ul (kullanılan ticari klonlama vektörü türüne göre seçici antibiyotiği belirlenmesi). 37 ° CO / N ile inkübe edin. </li></ol></li><li> Bir ticari kit kullanılarak, ~ Mini hazırlık plazmid saflaştırma için 10 koloni seçin. Miniprep plazmid arındırma genel olarak aşağıdaki gibi gerçekleştirilir. NOT: Tampon isimleri kullanılan ticari kit özgüdür ama genel işlevler benzer. <ol><li> 2 tek koloniler inoküle- (Kullanılan ticari vektör tipine göre belirlenen) uygun seçici antibiyotiği içeren 5 ml LB ortamı. </li><li> Çalkalama (~ 300 rpm) ile 37 ° C &#39;de yaklaşık 8 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> 10 dakika boyunca 6000 x g&#39;de santrifüj ile hücreler hasat edilir. </li><li> 250 ul yeniden süspansiyon tamponunda pelletini. Mix ve vorteks tamamen pelet dağıtmak için. </li><li> 6 kez - lizis tamponu 250 ul ekleyerek bakteriyel hücreler Lyse, boruları 4 tersini iyice karıştırın. </li><li> Nötralizasyon tamponunda lizatını nötralize ve 4 ters - karıştırmak için 6 kez. Bir masa üstü mikrosantrifüj üzerinde ~ 17.900 xg&#39;de 10 dakika santrifüj. </li><li> Bir spin kolon önceki adımdan Süpernatantlar aktarın. Santrifüj tekrar 30 ~ 17.900 xg - 60 saniye. </li><li> 60 saniye - 30 0.75 ml yıkama tampon ve santrifüj ekleyerek spin kolon yıkayın. Flow-through atın. </li><li> Ilave 1 dakika boyunca santrifüj remoartık yıkama tamponu ettik. Temiz bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde spin kolon yerleştirin. DNA Zehir için, her sütunun merkezine 50 ul su ekleyin. 1 dakika bekletin ve 1 dakika santrifüj. </li></ol></li></ol> 3. Ekle Varlığı için Saf Plazmidler Analiz <ol><li> Kısıtlama Digest: <ol><li> Ekleme klonlamak için kullanılan sınırlama enzimleri ile plazmidin sindirilmesi ile, ek maddenin varlığını belirlemek için bir kısıtlama sindirimi ayarlayın. Aşağıdaki gibi tipik bir çift sınırlama reaksiyonu özeti: Saflaştırılmış plazmid 1 ug, her bir sınır enzimleri 1 ul, 2 ul 10x kısıtlama (20 ul bir toplam) tampon + 2 ul BSA (eğer varsa), su ul, X sindirimi </li><li> Yavaşça karıştırın ve önerilen sıcaklıkta (bir enzim diğerine değişir) inkübe. </li><li> Kısıtlama 1 saat için 100 V çalışacak,% 1 TBE agaroz jel üzerinde reaksiyonu sindirmek ve uygun büyüklükte açılan dışarı bakmak analiz. </li></ol></li><li> PCR analizi: <ol><li> Insert veya vektör ve kartuş arasındaki kavşak içine yükseltmek için ticari vektör bölgesinden primerler kullanılarak, saflaştırılmış plazmid ile PCR ayarlayın. Ortak primerler M13 ileri ve geri ve T3 / T7 primerlerdir. </li><li> Bu protokol, aşağıdaki PCR çevrim koşulları kullanacaktır: ve daha sonra 5 saniye, 15 saniye için 60 ° C 98 ° C &#39;de 18 döngü, ardından 94 ° C&#39;de 2 dakika, ve 72 ° C, 24 ° C bir başlangıç ​​tutma 2 dakika karıştırıldı. 4 ° C&#39;de beklemeye belirsiz, ardından 5 dakika süreyle 72 ° C&#39;de son uzatma adımı gerçekleştirir. </li><li> 1 saat süre ile 120 V - bir% 1 TBE agaroz jeli üzerinde yük PCR ürünleri ve 100 çalıştırın. </li></ol></li><li> Ardışık: <ol><li> Analiz ve ekin varlığını doğrulamak için ticari bir sıralama tesisine arıtılmış plazmid gönder. </li><li> Doğru yapı elde edildikten sonra, (bitki ikili vektör içine) klonlanması ikinci adım için kullanılır. NOT: 2.3 Adımları - 3.3Klonlama bir aşamada tamamlanır elimine edilebilir. </li></ol></li></ol> Bitki, ikili vektör (PRI909) ve E. coli içine 4. Klon coli Dönüşüm <ol><li> Bitki ikili vektör doğrusallaştırmak tepkileri sindirmek bir çift kısıtlama kurmak ve primerler (2.2 adım) ilave edildi Aynı kısıtlama enzim sitelerini kullanarak önceden klonlanmış insert izole. </li><li> 2 saat - 1 için 100 V çalıştırmak jel elektroforezi kullanılarak kısıtlama digests analiz. Insert ve jelden doğrusallaşmış bitki ikili vektör kesin. </li><li> Jel ürünleri arındırmak için bir ticari kit kullanın. Üreticinin kılavuzuna başvurun. </li><li> Bitki ikili vektöre ekleme bağlamak için, ligasyon reaksiyonu ayarlayın. vektör oranı geçen parçanın boyutu ve bitki ikili vektör bağlıdır. Bu protokolde LIS1 insert 6.5 kb ve bitki ikili vektör 9 kb oldu. Vektör oranı 2 eki: Bu nedenle, 1 kullanın. </li><liBakteriyel dönüşüm, plazmid saflaştırma ve analiz için 3 -&gt; tekrarlayın 2.4 adımları. Doğru yapı (insert + bitki ikili vektör) elde edildikten sonra, 5. adımda elektroporasyon geçin. </li></ol> Agrobacterium 5. Elektroporasyon Elektrikli yetkili hücreler tumefaciens <ol><li> Agrobacterium bir şişe buz üzerinde elektriksel yetkili hücreleri tumefaciens çözülme. </li><li> Buz üzerinde, yetkin hücre 20 ul ikili vektör plasmid DNA 1 ng ekleyin ve yavaşça karıştırın. </li><li> Buz üzerinde 0.1 cm elektroporasyon küvetine soğutun. </li><li> Elektroporasyon küvetler yetkili hücre / DNA karışımı aktarın ve alt karışımı toplamak için dokunun. Electroporator makine ve nabız küveti koyun (voltaj ve zaman koşulları küvetin büyüklüğüne ve kullanılan elektroporatörü bağlıdır). </li><li> 15 ml&#39;lik bir tüpe SOC ortam ve transfer hücre 1 ml ilave edilir. </li><li> 28-30 &#39;de 1 saat süreyle inkübe edin100 rpm&#39;de sallayarak, C °. Levha 50 - LB agar + uygun seçici antibiyotiği hücre 100 ul (bitki ikili plazmid ve kullanılan Agrobacterium ırklarına dayanıyor 50 ug / ml kanamisin ve 100 ug / ml streptomisin, bu protokol kullanımında.). </li><li> 30 ° C - 28 48 saat kadar inkübe edin. </li><li> Koloni seçimi ve plazmid saflaştırma için yineleyin 2.5. </li><li> 3. adımı yineleyin plazmid analiz etmek ve çiçek-daldırma için yapı kullanmadan önce insert ve T-DNA&#39;nın bütünlüğünü kontrol etmek. Aşama 3.3&#39;te olduğu gibi, tüm uç bölgede ve T-DNA bölgeleri boyunca ve dizileme ile birden çok PCR primerleri kullanılarak adımı tekrar 3.2. NOT: Bu protokolde 4 farklı primerler, T-DNA ve insert genelinde 10 primerleri genelinde tasarlanmıştır. </li><li> Ben seçilmiş Agrobacterium kolonisi bitki ikili plazmid varlığı onaylandıktan sonra, yer hücreleri-80 ° C de, n,% 50 gliserol ve saklayın. Bunlar, bir hafta 7 içinde kullanılacak ise deposu 4 ° C plaka üzerinde koloniler kalmıştır. </li></ol> 6. Çiçekli-Daldırma Not: 2 gün önce çiçek-daldırma için: <ol><li> Sıvı ortamda LB + uygun antibiyotikler - sabit faz (kabul edilebilir 1 600 0.5 arasındaki OD) Agrobacterium hücreleri büyür. Not: Bu bitki ikili vektör ve kullanılan Agrobacterium soyu türüne göre, Aşama 5.6 ile aynı antibiyotik bulunmaktadır. </li><li> 1 ile başlangıç ​​kültürü: doymuş (5 mi) O / N kültürün 100 seyreltiler ve 24 büyümek - 150 rpm ile çalkalanarak bir 28-30 ° C&#39;de 48 saat süredir. Kültür midlogarithmic faz ulaşmış olmalıdır ve daha büyük olasılıkla yaklaşan veya sabit faz 1 olacak. Yaklaşık 0.8 OD (0.5 ila 1 arasında yine OD tüm kabul edilebilir) 8. 5.000 x santrifüj hücreleri toplayınoda sıcaklığında örn. </li><li> Sızma orta hücrelerin tekrar (% 5.0 sakaroz + ,05-,003% Silwet L-77). Daldırma ilk turda için,% 0.05 Silwet-77 kullanın. İkinci ve üçüncü turlarda için, (Tartışma ayrıntılı)% 0.03 ile konsantrasyonunu azaltmak. </li><li> Çiçek-daldırma adım ile devam edin. Yan bitki yatırın ve 1-2 dakika sızma ortamında yalnızca görünür tomurcukları batırın. Yan bitki bırakın ve kubbe (Şekil 3) yüksek nem korumak için plastik örtü ile örtün. </li><li> Bir sonraki gün, dik bir konumda bitki yer ve normal olarak korur. </li><li> Tomurcuk (genellikle yaklaşık 10 sonra - 14 gün) daha büyüdüğünde - 6.4, 6.1 tekrar adımları. 0.003% 60 sn ve Silwet-77 konsantrasyon - 30 daldırma süresini azaltın. </li><li> Onların tohumları (Şekil 4) tahsil edilecek olgun ve hazır olana kadar normal bitkiler koruyun. </li></ol> Pozitif Tra 7. SeçimiDoğrudan PCR ile nsformants <ol><li> Adım 1.1 gibi toprağa T1 tohumlarını ekmeye. <ol><li> Seçenek olarak ise, 500 ml su içinde, agar MS ortamı + 4 g, 2.2 g eklenmesi ile Murashige ve Skoog bazal tuz ortamı (MS ortamı) görünür. Otoklav ve küçük bitki tencere içine dökün. Kullanılana kadar 4 ° C&#39;de muhafaza edin. </li><li> Katılaşmış MS ortamı üzerinde yerleştirerek tohum Sow. Uzun gün ışığı (14 saat ışık ve karanlık 10 saat) altında tutun. 6 gün (Şekil 5) - Tohumlar yaklaşık 4 çimlenir. </li><li> Bir başlangıç ​​noktası olarak, her çiçekten bir tohum kullanın. Hiçbir olumlu Transformant elde edilirse, çiçek başka tohum seçerek bu adımı tekrarlayın. NOT: Aynı çiçeklerden Testi farklı tohumlar, bazı durumlarda bir çiçek bütün tohumlar dönüştürülmüş olacak çünkü. Deneysel çiçek ek tohum seçilmesi bazen gereklidir. </li></ol></li><li> Düzenli fide kontrol edin. Yaklaşık 10 - çimlenme sonrası 14 gün, ne zaman doğrugeliştirmek direkt PCR ile bitkiler testi bırakır. </li><li> 3 yaprak - 2 keserek yaprak ekstresi, DNA hazırlayın - Her fide (5 ağırlık 10 mg) ve bir mikrosantrifüj tüp koyun. </li><li> Her bir tüpe 50 mM NaOH, 180 ul ekleyin ve 95 ° C&#39;de 10 dakika inkübe edilir. </li><li> 1 M Tris-HCl (pH 8.0) 20 ul eklenmesi ile özü nötralize. </li><li> Pozitif dönüştürücüleri seçmek, T-DNA ya da parçası (Şekil 7) üzerinde tasarlanan primerler kullanılarak, doğrudan PCR reaksiyonunda ekstresi 1 ul kullanın. <ol><li> Bu protokol, 24 ° C lik bir başlangıç ​​tutma doğrudan PCR kullanarak, daha sonra 10 saniye, 15 saniye, tavlama aşamasında, 68 ° C&#39;de bir uzatma aşaması 98 ° C (40 döngü, ardından 98 ° C&#39;de 2 dakika, C). 4 ° C&#39;de beklemeye belirsiz, ardından 5 dakika boyunca 68 ° C&#39;de son uzatma adımı gerçekleştirir. (Döngüleri için primer, tavlama sıcaklıkları ve uzatma süreleri ile ilgili ayrıntılar için Tablo 1&#39;e bakınız). </li></ol></li><li> Pozitif dönüştürücüleri tanımak ve olgunluk onları büyümek. Tohumlar daha büyük bir kap içinde toprağa MS ortamına nakli çimlendirilmiştir durumunda (Şekil 5). </li></ol>

<ol>
	<li>Bent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+thaliana+floral+dip+transformation+method.">Arabidopsis thaliana floral dip transformation method.</a> Methods Mol Biol. 343, 87-103 (2006).</li><li>Beranova, M., Rakousky, S., Vavrova, Z., Skalicky, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonication+assisted+Agrobacterium-mediated+transformation+enhances+the+transformation+efficiency+in+flax+(Linum+usitatissimum+L.).">Sonication assisted Agrobacterium-mediated transformation enhances the transformation efficiency in flax (Linum usitatissimum L.).</a> Plant Cell Tiss Organ Cult. 94, 253-259 (2008).</li><li>Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+site-specific+insertion+sequence+in+flax+genotrophs+induced+by+environment.">A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by environment.</a> New Phytol. 167, 171-180 (2005).</li><li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana.">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16 (6), 735-743 (1998).</li><li>Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Control+of+Rapid+Genomic+Changes+in+Flax.">Mechanisms and Control of Rapid Genomic Changes in Flax.</a> Ann Bot. 95, 201-206 (2005).</li><li>Dong, J. Z., McHughen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+procedure+for+production+of+transgenic+flax+plants+using+Agrobacterium+tumefaciens.">An improved procedure for production of transgenic flax plants using Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Sci. 88, 61-71 (1993).</li><li>Logemann, E., Birkenbihl, R. P., Ulker, B., Somssich, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+preparing+Agrobacterium+cells+that+simplifies+the+Arabidopsis+transformation+protocol.">An improved method for preparing Agrobacterium cells that simplifies the Arabidopsis transformation protocol.</a> Plant Methods. 2 (16), (2006).</li><li>Mara, C., Grigorova, B., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral-dip+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+to+examine+pTSO2::&#946;-glucuronidase+reporter+gene+expression.">Floral-dip transformation of Arabidopsis thaliana to examine pTSO2::&#946;-glucuronidase reporter gene expression.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li><li>Mlynarova, L., Bauer, M., Nap, J. -. P., Pretova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+Agrobacterium-mediated+gene+transfer+to+flax.">High efficiency Agrobacterium-mediated gene transfer to flax.</a> Plant Cell Rep. 13, 282-285 (1994).</li><li>Mu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+maize+female+inflorescence+following+floral+dip+method+mediated+by+agrobacterium.">Genetic transformation of maize female inflorescence following floral dip method mediated by agrobacterium.</a> Biotechnology. 11 (3), 178-183 (2012).</li><li>Trieu, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Medicago+truncatula+via+infiltration+of+seedlings+or+flowering+plants+with+Agrobacterium.">Transformation of Medicago truncatula via infiltration of seedlings or flowering plants with Agrobacterium.</a> Plant J. 22 (6), 531-541 (2000).</li><li>Yasmeen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Planta+transformation+of+tomato.">In Planta transformation of tomato.</a> Plant Mol Biol Rep. 27, 20-28 (2009).</li><li>Zale, J. M., Agarwal, S., Loar, S., Steber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+stable+transformation+of+wheat+by+floral+dip+in+Agrobacterium+tumefaciens.">Evidence for stable transformation of wheat by floral dip in Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Cell Rep. 28, 903-913 (2009).</li><li>Zhan, X. C., Jones, D. A., Kerr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+flax+plants+transformed+by+Agrobacterium+rhizogenes.">Regeneration of flax plants transformed by Agrobacterium rhizogenes.</a> Plant Mol Biol. 11, 551-559 (1988).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Böyle keten (Linum usitatissimum) gibi bazı bitki türlerinin,, başarılı bitki transformasyon sınırlı olmuştur. Daha önce, keten dönüşüm yaralama ve ortak ekimi, biyolistik parçacıkları uygulayarak ya da rejenerasyon ardından ultrason sonikasyon kullanarak bir Agrobacterium enfeksiyonu gerektiriyordu; Uzun ve eğilimli hem bir süreci birçok mutasyon olayları eşlik ediliyor. Ayrıca, bu teknikler arasında seçim süreci kanamisin gibi antibiyotik seçilebilir markerlerin kullanılmasını gerektirir. Bununla birlikte, keten antibiyotik 6,9,14 yüksek konsantrasyonlarda kaçış eğilimi seçimi bu yöntem, bir çok yanlış pozitif üreten literatürde not edilmiştir. Keten dönüşüm önceki tekniklerin bir diğer dezavantajı düşük dönüşüm oranları 2,6 olmuştur. Burada anlatılan protokolde, çiçek-daldırma yoluyla Agrobacterium aracılı bitki transformasyon gösterildi(-% 60 50), keten için yüksek dönüşüm oranı yeterli olmaktadır. Transformantlar, ana ve yan dallarından daldırma ve toplanan çiçeklerden elde edilmiştir. Pozitif transformantların seçimi sadece by-pass antibiyotik seçimi kullanımı, toprak T1 büyüyen bitkiler ve çimlenmiş kısa bir süre sonra yapraklarını tarama tarafından yapıldı, bir adım önce diğer bitki türleri için çiçek daldırma bir norm olarak kullanmıştır. Yaprakların doğrudan PCR testi yapılarak ve uygun T-DNA primerleri kullanılarak, pozitif transformantlar hızlı bir şekilde seçilebilir. Bu teknik, bu yöntem 1,10,12 kullanılarak daha önce Arabidopsis ve diğer bitki türleri için rapor edilen çok daha yüksek bir dönüşüm oranı basit, ucuz ve kolay uygulanabilir olması, ancak sonuçlar. Ayrıca keten en yüksek bildirilen dönüşüm oranıdır. Ancak, en iyi çiçek aşamasının seçimi ve iyi yüzey aktif madde konsantrasyonu gibi işlemlerde önemli adımlar, böylece oradaAgrobacterium çiçek organları öldürmeden bitki hücrelerine nüfuz edebilir. Erken sürgün aşamasında fazla% 0.05 yüksek Silwet-77 konsantrasyonu ile (Şekil 2A) kullanılırsa, çiçek geliştirme veya tohum vermeyecek. Dönüşüm çalışabilir, ancak son tomurcuk aşamasında (Şekil 2C) kullanılırsa, bu, çok daha düşük bir oranda gerçekleşir. Benzer sonuçlar Arabidopsis çiçek daldırma dönüşüm 1,4 ile elde edilmiştir. Bu protokol, tüm çiçek aşamaları ikinci daldırma ile, ardından farklı Silwet-77 konsantrasyonları ile test edilmiştir ve iyi aşama birinci daldırma için% 0.05 Silwet-77 orta tomurcuk aşama (Şekil 2C) olduğu belirlendi 0.03% biraz daha azalmış Silwet-77 konsantrasyonu ile geç tomurcuk sahne (Şekil 2C). Bu dönüşüm ayrıca, ardından% 0.003 düşük Silwet-77 konsantrasyonu ile erken tomurcuk aşama (Şekil 2A) ile çalıştı% 0.05 yüksek Silwet-77 konsantrasyonunda orta tomurcuk aşamasında (Şekil 2B) olan bir ikinci daldırma. Bu protokolde, diğer bazı parametreler dönüşüm oranını optimize çalıştı, ancak nihai sonuç üzerinde hiçbir etkisi olduğu bulunmuştur. Örnekler bitkiler tarafında yatıyordu ve bir gün iki gün plastik kaplı olduğunu daldırma süre sonra uzanan içerir; Agrobacterium kültürü için birden fazla 1 OD kullanılarak yerine 0,5-1; 15 dakika yerine 1 - - 2 dakika 5 daldırma süresini arttırmak. Yine bu stratejileri kullanarak dönüşüm oranı üzerinde herhangi bir etkisi fark değil. En etkili faktör, bununla birlikte, doğru çiçek aşamalarında sağlıklı bitkiler kullanılarak, ve en iyi Silwet-77 konsantrasyonu kullanılarak bulunmuştur. Biz iki daldırma aralıkları, bir kez daldırma da çalışır halde, nedense daha iyi bir zaman çalıştığını fark ettim. Bu protokole modifikasyonu reducin ile elde edilebilirg ikinci veya üçüncü daldırma olarak az 0.003 olarak% kadar Silwet-77 konsantrasyonu. Silwet-77 toksik olduğu için, çiçek çok yüksek bir konsantrasyon sonucu herhangi bir tohum verimi ile sonuçlanır kötü geliştirilmesi. bitkiler, sağlıklı görünümlü değil ve tomurcukları iyi gelişmekte değilse, ikinci veya üçüncü olaylar ortadan ile daldırma frekansı, birine azaltılabilir. Bu tekniğin önemli bir sınırlama, keten, her bir çiçekten elde edilen tohum sınırlı sayıda ve keten uzun yaşam döngüsü tarafından üretilen çiçek düşük sayıdır. T1 nesil almak için 10 hafta sonrası daldırma - ilk daldırma için hazır birincil tomurcukları ve ek 8 için tohum ekimi 8 hafta 6 - alır. Toplamda, 5 bir dizi - 6 ay T1 nesil elde etmek gereklidir. Diğer bitki türlerinin aksine hangi çiçek yılın her zaman, yıllık belirli zamanlarda bazı keten çeşitleri çiçek daha iyi. Bu teknik için çok düşünceli planlama önemlidir. <p clÖzetle eşek = &quot;jove_content&quot;&gt;, iki farklı keten çeşitleri ile çiçek dip bizim sonuçlarımız: keten, Stormont Cirrus (duyarlı ve plastik), ve yağ keten, (stabil olmayan duyarlı) Bethune, bu Agrobakteriyi gösteriyor - çiçek daldırma ile uyumlu bitki transformasyon keten transformasyonu için uygulanabilir ve etkili bir yöntem olup, keten transformasyonu için daha önce kullanılan tekniklerle yerine kullanılabilir. Bu protokolde çiçeksi-daldırma yöntemi tadilatları, diğer bitki türlerinden ile kullanım için uygulanan ve keten ile sınırlı olmayacaktır.

Keten (Linum usitatissimum) kendi lifleri ve yağlar için yaygın olarak yetiştirilen önemli bir üründür. Keten genomunun dönüşüm örneğin yaralanma, Agrobacterium enfeksiyonuna ve doku kültürü içinde ko-kültivasyonu, rejenerasyonunun ardından biyolistik tanecikleri veya ultrason sonikasyon uygulama gibi tekniklerle mümkündür. Ancak, bu teknikler çok mutasyon olayları eğilimi ve transjenik çizgiler elde etmek üzere uzun bir süre de dahil olmak üzere pek çok dezavantajları vardır. Bu yöntemlerin bazıları, aynı zamanda pahalı olabilir ve düşük kurtarma fide sonuçlanan araçların yetenekli ve etkili manipülasyon gerektirebilir. En önemlisi, bu teknik genellikle düşük dönüşüm oranları 2,6 sonuçlanır. Çiçek-daldırma yoluyla Agrobacterium aracılı bitki transformasyon transgenik bitkiler oluşturmak için basit ve etkili bir yaklaşımdır. Bu rutin olarak ve başarılı Arabidopsis thaliana gibi birçok bitki türleri için kullanılmaktadırbir 1,4-ta, medicago truncatula 11, domates 12, buğday 13 ve mısır 10. Ancak, bu tür nedeniyle keten tarafından üretilen çiçekler düşük sayılar gibi çeşitli faktörlere, keten dönüşümü için uygun bir teknik olarak düşünülmüş değil, her çiçek, tohum boyutu büyük ve kalın ceket elde edilen tohumların sınırlı sayıda, aynı zamanda genetik transformasyon süreci için sorunlu olabilir hangi. Yavrularıyla olmayan transforme ya çimlenme veya çimlenme ama çamaşır suyu yok iken Ayrıca, çiçek daldırma tekniği seçimi segmenti, filizlenmeye ve yeşil kalmak için kendi yeteneklerine göre ayırt dönüştürülmüş progeny&#39;lerinde bir antibiyotik içeren bir bitki medyada dönüştürülmüş tohumların çimlenme gerektirir dışarı hızlı ve ölür. Mevcut literatürde, vahşi tip keten esaslı yalancı pozitif sonuçlar üreten, ve T1 progeny&#39;lerinin seçim yapmak, antibiyotik seçimleri yüksek konsantrasyon kaçmak eğiliminde olduğu görülmüştürAntibiyotik direnci 6,14 daha zor. Antibiyotiğin yüksek konsantrasyon seçim ortamına ilave edildi, ayrıca, gözlenen dönüşüm oranı önemli ölçüde 9 düştü. Bu protokol, biz onun genomu 3,5 değiştirerek ortamda streslere cevap gösterilmiştir elyaf keten, Stormont cirrus (duyarlı ve plastik), bir çizgi dönüştürmek için Agrobakteriyi ve çiçek daldırma yöntemi kullanılmıştır. Antibiyotik kaçış sorunu aşmak için, biz bitki medyaya antibiyotik ekleyerek yerine seçim, T1 yapraklarından DNA&#39;nın doğrudan PCR testi yapmak için seçtiniz. Biz tedavi sırasında belirli çiçekler izlemek için keten basit anatomi yararlandı. Bu izleme sistemi antibiyotik eklemeden toprağa belirli çiçekler ve çimlenme gelen tohum seçimi izin. Pozitif transformantlar sadece DNA hızlı ve etkili bir yöntem kullanılarak o yapraklarından elde edilen testlerin yapılmasını tespit edildif direkt PCR. Bizim sonuçlarımız çiçek daldırma yöntemi keten bu hat çok iyi çalıştı ve şaşırtıcı bir çok yüksek dönüşüm oranı sonuçlandı göstermek - daha önce olduğu bildirildi Arabidopsis thaliana, gözlemlenen daha yüksek, (50% 60) 0,1-1 % 1 ve diğer bitki türlerinin 10,12 daha da yüksektir. Biz de keten tohumu (keten yağı) başka çeşitli Bethune test (stabil ve duyarlı olmayan), ve bizim ön veriler çiçek daldırma da keten bu çeşitli çalıştığını gösterir. Bu protokolün amacı, Agrobacterium ve çiçek daldırma transgenik keten oluşturmak için kullanılabileceğini göstermektir. Bu teknik, basit, pahalı olmayan ve keten dönüşümün diğer yöntemlere göre daha hızlı olduğunu göstermektedir. Daha da önemlisi, keten dönüşüm 2,6 diğer yöntemlere göre çok daha yüksek bir dönüşüm oranı ile sonuçlanır. Birçok şubesi ve çiçekleri vardır Arabidopsis thaliana&#39;nın anatomisi, makes zor daldırma ve aynı bitki üzerinde çiçek olmayan daldırma ayırt etmek üzere. Bu nedenle, tohumların çok sayıda, bitki başına yaklaşık 20,000 tohum, pozitif dönüştürücüleri 8 tanımlamak amacıyla taranması gerekir. Keten, diğer taraftan, mümkün bireysel çiçekler izlemek ve süreci tarama sırasında belirli tohum seçmek için yapar bitkilerin başına yaklaşık 100 tohum üreten az sayıda şube (bir ana dal ve yan dal birkaç) ve daha az çiçek vardır. Biz çiçek daldırma keten ilgili herhangi bir tür, yaklaşık 200 türün bir cins dönüştürmek için uygulanabilir bir yöntem olduğunu öneriyorum. Bu yöntem keten dönüşümün diğer yöntemlere göre çok daha yüksek dönüşüm oranı verir. Biz de T1 yaprak DNA&#39;nın doğrudan PCR taraması genellikle birçok yanlış pozitif üretir antibiyotik direnç kaçış sorunu aşmak için etkili bir yol olduğunu öneriyorlar. Doğrudan PCR taraması herhangi bir başka bitki türlerine uygulanabilir ve t sınırlı değildirketen o. Bu protokolde kullanılan basit bir tohum izleme yöntemi keten benzer anatomik dallanma ile herhangi bir diğer bitki türlerine uygulanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="762">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety (PL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5&#34; pots</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">potting soil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">greenhouse with appropriate light setting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose gel electropheresis equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">digital imaging setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silwet-77&#160;</td>
			<td>LEHLE SEEDS</td>
			<td>VIS-01</td>
			<td>Toxic, wear gloves</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GoTaq Green Master Mix</td>
			<td>promega</td>
			<td>Part# 9PIM712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terra PCR Direct Polymerase Mix</td>
			<td>Clontech</td>
			<td align="right">639270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Binary vector PRI 909</td>
			<td>Takara</td>
			<td align="right">3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agrobacterium tumefaciens LBA4404 E</td>
			<td>Takara&#160;</td>
			<td align="right">9115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TOPO TA cloning kit</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>K4595-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sucrose&#160;</td>
			<td>fischer scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">electroporator and cuvettes</td>
			<td>bio-Rad</td>
			<td>165-2092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaker&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">spinner&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">platic wrap and aluminum foil wrap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">speedSTAR DNA polymerase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR070A/B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QlAquick gel extraction kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAGEN plasmid mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">12123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SalI-HF enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3138S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SacI-HF enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3156S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA ligation kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murashige Skoog</td>
			<td>sigma</td>
			<td>M5524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>fisher scintific</td>
			<td>A360-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

floral-dip transformation of flax (linum usitatissimum) to generate transgenic progenies with a high transformation rate

Çiçeksi-daldırma yoluyla, Agrobacterium aracılı bitki transformasyon bitki transformasyonu alanında yaygın olarak kullanılan bir teknik olan ve çok sayıda bitki türleri için başarılı olduğu rapor edilmiştir. Ancak, çiçek daldırma ile keten (Linum usitatissimum) dönüşümü rapor edilmemiştir. Bu protokolün amacı bu Agrobacterium kurmak ve çiçek daldırma yöntemi transgenik keten oluşturmak için de kullanılabilir. Bu teknik, basit, pahalı olmayan ve etkili olan ve daha da önemlisi, keten dönüşüm akımı mevcut yöntemlere göre daha yüksek bir dönüşüm oranı elde edildiğini göstermektedir. 2 dakika - Özetle, keten inflorescences 1, bir ikili vektör plazmid (T-DNA fragmanı ayrıca Linum ekleme dizisi, Lis-1) taşıyan Agrobacterium çözeltisi içinde bekletilir. Bitkiler 24 saat kendi tarafında düz atıldı. Daha sonra, bitkiler bir sonraki işlem yapana dek, normal gelişim koşulları altında muhafaza edilmiştir. süreçdaldırma ile, 14 günlük aralıklarla - yaklaşık 10 ile 3 kez, - daldırma s 2 tekrarlandı. T1 tohumları toplanır ve toprağa çimlendirilmiştir. Yaklaşık iki hafta sonra, muamele edilen nesiller, doğrudan PCR ile test edilmiştir; 2-3 yaprak bitki artı uygun T-DNA primerleri başına kullanılmıştır. Pozitif transformantlar seçilir ve olgunlaşana kadar büyütülmüştür. pozitif dönüştürücüleri olarak muameleden geçirilmiş olan bitkilerin tohumlarının% 60 - dönüşüm hızı 50 ile, beklenmedik bir şekilde yüksek olmuştur. Bu Arabidopsis thaliana ve çiçek daldırma dönüşüm kullanarak diğer bitki türleri için bildirilenlerden daha yüksek bir dönüşüm oranıdır. Bu transformasyon için başka yöntemler kullanarak keten transformasyonu için, aynı zamanda bugüne kadar rapor edilmiş olan, en yüksek düzeydedir.

Şekil 1-4 protokol dahilinde bazı adımları göstermektedir. Şekil 1 ve 2, çiçeklenme tomurcukları etrafında yaprakları Agrobacterium hücreleri ve protokolü geliştirmek için kullanılan farklı tomurcuk aşamalarında bunları ortaya çıkarmak için kesilir. 3 keten çiçek daldırma işlemi göstermektedir. Şekil 4, gösteren bir takip ve tespit edilebilir nasıl ana ve yan dallar etiketli olabilir ve nasıl bireysel çiçekler örneği. Şekil 5 T1 yavrularıyla, MS bitki medyada çimlenmiş ve daha sonra vade için toprağa nakledilen nasıl gösterir. Şekil 6 nasıl vahşi göstermektedir tipi keten literatürde 6,9,14 önceki bulguları teyit kanamisin yüksek konsantrasyonlarda kaçabilir. Şekil 7, pozitif T1 transformantlar arasında doğrudan PCR amplifikasyonunun bir örneğini göstermektedir. T1 çiçekler m toplandıTek bir T0 bitkinin ain ve yan sürgünler. Doğrudan PCR görülebileceği gibi, 12/08 T1 bitkiler PCR ile pozitif test edilmiş ve T-DNA üzerinde farklı bölgeleri amplifiye. Bizim primerleri Lis-1 ek ve çok sayıda klonlama konumu (Şekil 7B ve C) arasında tasarlanmıştır. Biz, sol sınır ve NOS terminatörü (veriler gösterilmemiştir) ya da sağ sınır ve çoklu bir klonlama bölgesi (Şekil 7D), T-DNA &#39;nın farklı segmentinin amplifiye edilmesi bitki ikili vektöründen ek primerler kullanıldı. LIS-1 ekleme özgü primerler de bu protokol kullanıldı (veriler gösterilmemiştir). Primerlerin listesi Tablo 1 &#39;de verilmiştir. Bununla birlikte, bu primerlerin sekansları, T-DNA bitki ikili vektör sekansı ve çiçek daldırma için kullanılan ekleme bağlıdır. Biz de ana ve yan dallar toplanan çiçekler arasında dönüşüm oranı açısından anlamlı bir fark olmadığını kaydetti. Birincil çiçeklenme tomurcukları etrafında yaprakları Kesme Şekil 1. Agrobacterim hücreleri bunları ortaya çıkarmak için. (A) tomurcukları yaprakları ile kaplıdır. (B) Yapraklar bunları ortaya çıkarmak için tomurcukları etrafında kesilmiştir. (C) bitkiden görüntü Büyütülmüş tomurcukları maruz kestikten sonra (A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52189/52189fig2highres.jpg" /> Şekil 2. çiçek dalış için kullanılacak en iyi evresini belirlemek için bu protokolü kullanılan farklı tomurcuk aşamaları. (A) erken evre tomurcuk approxima olduğunu<html> tely 2 mm. (B) orta kademe tomurcuk yaklaşık 5 mm&#39;dir. (C) Geç evre tomurcuk yaklaşık yaklaşık 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52189/52189fig3highres.jpg" /> Şekil 3. keten çiçek-daldırma işlemi. (A), birinci salkımına daldırma bitkiler ertesi güne kadar düz belirtilen (C). (A) &#39;dan Büyütülmüş (B) gerçekleştirildi. Agrobacterium hücreleri ihtiva eden infiltrasyon ortam içinde daldırılır ve kısa kolları muhafaza etmek plastik ile kaplanmıştır Yüksek nem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Her zaman &quot;&gt;:&quot; tutmak-together.within-sayfa = fo &quot;jove_content <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52189/52189fig4highres.jpg" /> . Şekil 4. T0 tedavi bitkilerden çiçek izleme ve tohum koleksiyonları süreci, (A) ana dal (merkezi uzun şube) ile tüm bitki örneği ve yan dallar (B - D). Bir . farklı branşlardan çiçek örneği (E) Bireysel çiçeklerden toplanan tohumların bir örnek (etiketli - k). ana dalından <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig4highres.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52189/52189fig5highres.jpg" /> Şekil 5. T1 fidanları antibiyotik seçimi olmadan yetiştirilmektedir. (A) T1 tohumları vardırMS bitki medya çimlenmiş. (B) Olumlu transformanlar, direkt PCR tarafından belirlenen, toprağa nakledilen ve vadeye kadar büyütülür. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52189/52189fig6highres.jpg" /> Şekil 6. Antibiyotik kaçış, T1 seçimi için bir sorun, doğrudan PCR taraması ile aşılır. Antibiyotik olmadan MS bitki medya çimlenmiş (A) Yabani tip keten tohumu. (B) Yabani tip keten tohumu, MS bitki medya + artan konsantrasyonları üzerinde çimlenmiş ve kanamisin (200 mg / ml, 600 ug / ml, 1 mg / ml). vahşi tip keten ve T1 ila 2 mg / ml kanamisin. (D), PCR MS bitki ortam üzerinde yeşertilmiş (c) vahşi-tür keten tohumu kanamisin primerler kullanılarak, fide tüm çoğaltılan, C DNA işaretleyici, FlaxS, vahşi tip flaxS: EZ1: kanamisin geni (efsaneleri ified olmayan daldırma dalı kontrol Ma: çiçekten T1 döl &quot;bir&quot; ana dal toplanan, Sc, Sd, Se, Sf: yan dal, W toplanan değişik çiçek &quot;c, d, e, f&quot; T1 yavrularıyla:. no-DNA) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig6large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/52189/52189fig7highres.jpg" /> Şekil 7. direkt PCR yöntemi kullanılarak T1 progeny&#39;lerinin başarılı PCR amplifikasyonlarının bir örnek. Bitki ikili vektör + klonlanmış LIS-1 ucun (A) şeması. Mavi oklar (Takara değiştirilmiş) doğrudan PCR taramasında kullanılan PCR primerleri konumunu göstermektedir. (B), PCR primerleri, M13F + ile 3 &#39;(C), PCR ile primerler M13R + 18a <strong&gt; primerler sağ sınırında (RB) ve çoklu klonlama sitesi (MCS) ile (D) PCR ** Her kulvar bireysel C toplanan çiçeklerden T1 temsil: Kontrol şube (non-daldırma), M: Ana dal çiçek ag, S: Yan dal çiçek bc &#39;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> İleri primer dizisi kaynağı </td><td> dizisi 5&#39;-3 &#39; </td><td> Ters primer dizisi kaynağı </td><td> Sekans 5&#39;-3 &#39; </td><td> Tavlama Sıcaklık (° C) </td><td> Uzatma Süresi (sn) </td><td> Beklenen boyutta (bp) </td></tr><tr><td> M13F (T-DNA) </td><td> CTGCAAGGCG ATTAAGTTGG </td><td> 3 &#39;(LIS-1 ekleme) </td><td> GAGGATGGAA GATGAAGAAGG </td><td> 57 </td><td> 40 </td><td> 450 </td></tr><tr><td> 18a (LIS-1 ekleme) </td><td> TATTTTAACCC <td> M13R (T-DNA) </td><td> ATTAGGCACC CCAGGCTTTA </td><td> 57 </td><td> 40 </td><td> 520 </td></tr><tr><td> MCS (T-DNA) </td><td> TGGTCATAGC TGTTTCCTGTG </td><td> RB (T-DNA) </td><td> TTTAAACTGA AGGCGGGAAA </td><td> 60 </td><td> 20 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> LB (T-DNA) </td><td> TTTGATGGTG GTTCCGAAAT </td><td> NOS (T-DNA) </td><td> GAATCCTGTT GCCGGTCTT </td><td> 60 </td><td> 30 </td><td> 380 </td></tr><tr><td> NPTII (T-DNA) </td><td> GCGATACCGT AAAGCACGAG </td><td> NTPII (T-DNA) </td><td> GCTCGACGTT GTCACTGAAG </td><td> 65 </td><td> 45 </td><td> 502 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. doğrudan PCR testi için kullanılan primerlerin bazı.

Watch this Scientific Journal Video about Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate at JoVE.com

Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Burada, biz çiçek daldırma yoluyla Agrobacterium aracılı bitki dönüşümü kullanarak keten dönüştürmek için bir protokol mevcut. Bu protokol için basit ve ucuzdur, ancak keten transformasyonu için mevcut veriler yöntemlere göre daha yüksek bir dönüşüm oranını verir.

Keten Çiçekli-Dip Dönüşüm (<em&gt; Linum usitatissimum</em&gt;) Yüksek Dönüşüm Oranı ile Transgenik progeny&#39;lerinde oluşturmak için

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

floral-dip-transformation-flax-linum-usitatissimum-to-generate

Research

JoVE Journal

Biology

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

29.0K Görüntüleme.  Case Western Reserve University.  Burada, biz çiçek daldırma yoluyla Agrobacterium aracılı bitki dönüşümü kullanarak keten dönüştürmek için bir protokol mevcut. Bu protokol için basit ve ucuzdur, ancak keten transformasyonu için mevcut veriler yöntemlere göre daha yüksek bir dönüşüm oranını verir. 

Video: Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

Floral-daldırma Dönüşüm Arabidopsis thaliana Inceleyin PTSO2: β-glucuronidase Reporter Gen İfadesi

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Biyoloji

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Transgenik, Üretimi C. elegans Biyolistik Dönüşüm

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella protonemal protoplast and Arabidopsis mesophyll protoplast transformation1. Due to its capacity to undergo efficient mitotic homologous recombination, Physcomitrella patens has emerged as an important model system in recent years2. This capacity allows high frequencies of gene targeting3-9, which is not seen in other model plants such as Arabidopsis. To take full advantage of this system, we need an effective and easy method to deliver DNA into moss cells. The most common ways to transform this moss are particle bombardment10 and PEG-mediated DNA uptake11. Although particle bombardment can produce a high transformation efficiency12, gene guns are not readily available to many laboratories and the protocol is difficult to standardize. On the other hand, PEG mediated transformation does not require specialized equipments, and can be performed in any laboratory with a sterile hood. Here, we show a simple and highly efficient method for transformation of moss protoplasts. This method can generate more than 120 transient transformants per microgram of DNA, which is an improvement from the most efficient protocol previously reported13. Because of its simplicity, efficiency, and reproducibility, this method can be applied to projects requiring large number of transformants as well as for routine transformation.

Efficient Polyethylene Glycol PEG Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella protonemal protoplast and Arabidopsis mesophyll protoplast transformation1.

Moss Verimli Polietilen Glikol (PEG) aracılığı ile Dönüşüm Physcomitrella Dini ayinlerde kullanılan patenler</em

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella ...

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic redundancy affecting simple genetics in higher plants. The novel model organism Ostreococcus tauri is the smallest free-living eukaryote known to date, and possesses a greatly reduced genome size and cellular complexity1,2, manifested by the presence of just one of most organelles (mitochondrion, chloroplast, golgi stack) per cell, and a genome containing only ~8000 genes. Furthermore, the combination of unicellularity and easy culture provides a platform amenable to chemical biology approaches. Recently, Ostreococcus has been successfully employed to study basic mechanisms underlying circadian timekeeping3-6. Results from this model organism have impacted not only plant science, but also mammalian biology7. This example highlights how rapid experimentation in a simple eukaryote from the green lineage can accelerate research in more complex organisms by generating testable hypotheses using methods technically feasible only in this background of reduced complexity. Knowledge of a genome and the possibility to modify genes are essential tools in any model species. Genomic1, Transcriptomic8, and Proteomic9 information for this species is freely available, whereas the previously reported methods6,10 to genetically transform Ostreococcus are known to few laboratories worldwide.
In this article, the experimental methods to genetically transform this novel model organism with an overexpression construct by means of electroporation are outlined in detail, as well as the method of inclusion of transformed cells in low percentage agarose to allow selection of transformed lines originating from a single transformed cell. Following the successful application of Ostreococcus to circadian research, growing interest in Ostreococcus can be expected from diverse research areas within and outside plant sciences, including biotechnological areas. Researchers from a broad range of biological and medical sciences that work on conserved biochemical pathways may consider pursuing research in Ostreococcus, free from the genomic and organismal complexity of larger model species.

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

This article describes genetic transformation of the unicellular marine alga Ostreococcus tauri by electroporation. This eukaryotic organism is an effective model platform for higher plants, possesing greatly reduced genomic and cellular complexity and being readily amenable to both cell culture and chemical biology.

Picoeukaryote genomik Dönüşüm<em&gt; Ostreococcus tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and develops most often in the setting of immunosuppression. Despite decades of research, optimal treatment of KS remains poorly defined and clinical outcomes are especially unfavorable in resource-limited settings. KS lesions are driven by pathological angiogenesis, chronic inflammation, and oncogenesis, and various in vitro cell culture models have been developed to study these processes. KS arises from KSHV-infected cells of endothelial origin, so EC-lineage cells provide the most appropriate in vitro surrogates of the spindle cell precursor. However, because EC have a limited in vitro lifespan, and as the oncogenic mechanisms employed by KSHV are less efficient than those of other tumorigenic viruses, it has been difficult to assess the processes of transformation in primary or telomerase-immortalized EC. Therefore, a novel EC-based culture model was developed that readily supports transformation following infection with KSHV. Ectopic expression of the E6 and E7 genes of human papillomavirus type 16 allows for extended culture of age- and passage-matched mock- and KSHV-infected EC and supports the development of a truly transformed (i.e., tumorigenic) phenotype in infected cell cultures. This tractable and highly reproducible model of KS has facilitated the discovery of several essential signaling pathways with high potential for translation into clinical settings.

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is a tumor induced by infection with the oncogenic virus human herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). The endothelial cell culture model described here is uniquely suited for studying the mechanisms by which KSHV transforms host cells.

Hücresel dönüştürme Kaposi sarkomu Herpesvirus tarafından eğitim için bir Vitro modeli

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

CRISPR/Cas9 Kullanarak Boş Mutasyonlar Oluşturmak için Culex Sivrisineklerinin Embriyolarının Hazırlanması ve EnjekteSi

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive organs/gametes. Recent advances in CRISPR-Cas9 genome editing technology allow for high editing efficacy and timesaving knockout mutations of endogenous candidate genes at specific sites. Additionally, Agrobacterium-mediated genetic transformation of rice is also a key method for gene modification, which has been widely adopted by many public and private laboratories. In this study, we applied CRISPR-Cas9 genome editing tools and successfully generated three male sterile mutant lines by targeted genome editing of OsABCG15 in a japonica cultivar. We used a modified Agrobacterium-mediated rice transformation method that could provide excellent means of genetic emasculation for hybrid seed production in rice. Transgenic plants can be obtained within 2&#8211;3 months and homozygous transformants were screened by genotyping using PCR amplification and Sanger sequencing. Basic phenotypic characterization of the male sterile homozygous line was performed by microscopic observation of the rice male reproductive organs, pollen viability analysis by iodine potassium iodide (I2-KI) staining semi-thin cross-sectioning of developing anthers.

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

This work describes the use of CRISPR-Cas9 genome editing technology to knockout endogenous gene OsABCG15 followed by a modified Agrobacterium-mediated transformation protocol to produce a stable male-sterile line in rice.

Agrobacterium-Aracılı Genetik Dönüşüm, Transgenik Üretim ve Pirinçte Erkek Üreme Gelişimi Çalışmaları Için Uygulaması

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic pest management strategies. The most used transposable element in insect transformation is piggyBac, and piggyBac-based germline transformation has been successfully conducted in model insects. However, it is still challenging to employ this technology in non-model insects that include agricultural pests. This paper reports on germline transformation of a global agricultural pest, the fall armyworm (FAW), Spodoptera frugiperda, using the hyperactive piggyBac transposase (hyPBase).
In this work, the hyPBase mRNA was produced and used in place of helper plasmid in embryo microinjections. This change led to the successful generation of transgenic FAW. Furthermore, the methods of screening transgenic animals, PCR-based rapid detection of transgene insertion, and thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR)-based determination of the integration site, are also described. Thus, this paper presents a protocol to produce transgenic FAW, which will facilitate piggyBac-based transgenesis in FAW and other lepidopteran insects.

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Successful germline transformation in the fall armyworm, Spodoptera frugiperda, was achieved using mRNA of hyperactive piggyBac transposase.

Hiperaktif piggyBac Transposase aracılı Germline Dönüşümü Sonbahar Ordu Kurdu, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular mechanisms behind the beneficial effects of exercise are poorly understood. Many physical workouts, particularly those classified as aerobic exercises such as jogging and walking, produce impulsive forces at the time of foot contact with the ground. Therefore, it was speculated that mechanical impact might be implicated in how exercise contributes to organismal homeostasis. For testing this hypothesis on the brain, a custom-designed ''passive head motion'' (hereafter referred to as PHM) system was developed that can generate vertical accelerations with controlled and defined magnitudes and modes and reproduce mechanical stimulation that might be applied to the heads of rodents during treadmill running at moderate velocities, a typical intervention to test the effects of exercise in animals. By using this system, it was demonstrated that PHM recapitulates the serotonin (5-hydroxytryptamine, hereafter referred to as 5-HT) receptor subtype 2A (5-HT2A) signaling in the prefrontal cortex (PFC) neurons of mice. This work provides detailed protocols for applying PHM and measuring its resultant mechanical accelerations at rodents' heads.

The present protocol describes a custom-designed ''passive head motion'' system, which reproduces mechanical accelerations at rodents' heads generated during their treadmill running at moderate velocities. It allows dissecting mechanical factors/elements from the beneficial effects of physical exercise.

Kemirgenlerin Kafalarında Tanımlanmış İvmelenmeler Oluşturmak için Pasif Kafa Hareketinin Uygulanması

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is a newly isolated filamentous cyanobacterium. This paper describes how new filamentous cyanobacteria can be isolated from marine rockpools. It also describes how DNA can be extracted from filaments and how the genomes can be sequenced. Although transformation is established for many single-celled species, it is less frequently reported for filamentous cyanobacteria. A simplified method for the natural transformation of P. lacuna is described here. P. lacuna is the only member of the order Oscillatoriales for which natural transformation is established. This paper also shows how natural transformation is used to express superfolder green fluorescent protein (sfGFP). An endogenous cpcB promoter induced approximately 5 times stronger expression than cpc560, A2813, or psbA2 promoters from Synechocystis sp. PCC6803. Further, a method for the cryopreservation of P. lacuna and Synechocystis sp. CPP 6803 was established, and methods for assessing motility in a liquid medium and on agar and plastic surfaces are described.

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Phormidium lacuna is a filamentous cyanobacterium that was isolated from marine rockpools. This article describes the isolation of filaments from natural sources, DNA extraction, genome sequencing, natural transformation, expression of sfGFP, cryoconservation, and motility methods.

Filamentöz Cyanobacterium Phormidium lacuna'nın Doğal Transformasyonu, Protein İfadesi ve Kriyokorunumu

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is ...