Gelişim biyolojisinde temel amaç, bir genin içeriğe özgü rolünü anlamaktır. Ve bu geleneksel nakavt mutantlar veya kurucu aşırı ifade hatları ile elde etmek zor olabilir. Biz model bitki Arabidopsis thaliana üç ana meristems indükleyici sito özgü ifade için bir kaynak oluşturmak için modüler yeşil kapı klonlama sistemi kullanılır.
Aynı modüler klonlama stratejisi kullanılarak, bu yöntem dönüşüme değişmez diğer bitki türlerine uygulanabilir. Bu prosedürün görsel gösterimi değerlidir, çünkü kök meristemlerinde trans aktivasyonun etkisini analiz etmek ve kısa apeks görüntülemeden önce diseksiyon gerektirir, ki bu oldukça zor olabilir. Başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi tohumları sterilize edin.
Sonra, pH 5.8 de yarı mukavemetli Murashige ve Skoog orta hazırlamak ve yüzde bir sakaroz ve% 0.9 agar ekleyin. Otoklavlamadan sonra, DMSO'da çözünmüş Dex'i 10 ila 30 mikromolar arasında son konsantrasyonda indüksiyon plakalarına ekleyin. Kontrol plakalarına eşit miktarda DMSO ekleyin.
Kök görüntüleme için tohumları tabaklara koyun ve 48 saat karanlıkta ve 4 derece santigrat derecede tabakalayın. Plakaları bir bitki kuvözde dikey bir konuma getirin ve beş gün boyunca yetiştirin. Çimlenmeden beş gün sonra, fideleri görmek için konfokal lazer tarama mikroskobu kullanın.
Başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi tohumları hazırlamak ve büyümek. Çimlenmeden 6-7 gün sonra, her fideyi ayrı bir tencerede toprağa aktarın. Bitkileri sulama yaparak indükliyorsanız, suda etanolde çözünmüş 25 milimolar DEX stoğundan hazırlanan 25 mikromolar DEX çözeltisi kullanın.
İstenilen indüksiyon zamanına kadar her 2-3 günde bir su. Daldırma ile indükleme, 25 mikromolar son konsantrasyonveya DEX ve sahte tedavi için DMSO eşdeğer miktarda 0,02% Silwet L77 ve DEX içeren su 750 mililitre ile bir litrelik bir beaker hazırlayın. Tek bir bitkiyi 30 saniye boyunca indüksiyon veya sahte çözeltiye batırın.
Görüntüleme istenilen zamana kadar, her iki veya üç günde bir tekrarlayın. Başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi tohumları hazırlamak ve büyümek. Çimlenmeden 6-7 gün sonra, her fideyi ayrı bir tencerede toprağa aktarın.
Gövde yaklaşık bir santimetre uzunluğunda olduğunda, suda 10 ila 50 mikromolar DEX çözeltisi ile floresan SAM sprey. Gelişimin daha sonraki aşamalarında indüksiyon ve görüntüleme için, daha uzun sapları veya yan sürgünler SAM'lar neden. İndüksiyondan 24 ila 48 saat sonra, SAM'ları inceleyin ve görüntülemeye geçin.
İlk olarak, propidium iyodür milileter çözeltisi başına 10 mikrogram plaka dan fide aktarın ve beş dakika boyunca onları karşı leke. Kökleri bir mikroskop görüntüleme odasına yerleştirin ve 63x su daldırma amacı ile confocal lazer tarama mikroskobu kullanarak görüntüleyin. Propidium iyodür floresansını görselleştirmek için 488 nanometre lik bir uyarma dalga boyu kullanın ve 590 ile 660 nanometre arasında emisyon toplayın.
mTurquoise2 floresans için, 458 nanometre uyarma kullanın ve sıralı tarama kullanarak 460 ve 615 nanometre arasında emisyon toplamak. İlk olarak, istenilen bölümün karşı tarafında bir parmak ile bir kök düzeltmek. Bir jilet kullanarak, yaklaşık üç santimetre lik bir segment kesti ve birkaç ince kesim gerçekleştirin.
Jileti musluk suyu içeren bir Petri kabında durulayın ve kök kısımlarını toplayın. Ya bölümleri leke veya doğrudan mikroskop slaytlar üzerine monte. Boyama için, bir reaksiyon tüpünde propidium iyodür mililitre çözeltisi başına 250 mikrogram bir mililitre hazırlayın.
Petri kabındaki musluk suyunu bir pipetle çıkarın ve propidium iyodür çözeltisi ve beş dakika boyunca leke ile değiştirin. Daha sonra propidium iyot çözeltisini çıkarın ve suyla durulayın. İnce pratisyen veya ince bir fırça kullanarak, lekeli bölümleri mikroskop slaytlarına aktarın.
Örnekleri görüntülemek için 25x daldırma su daldırma lens ile bir confocal lazer tarama mikroskobu kullanın. Propidium iyodür floresansını heyecanlandırmak ve 570 ila 620 nanometre arasında emisyon toplamak için 561 nanometre lazer ışığı kullanın. Sürücü hattı yapıları tarafından kodlanmış mTurquoise2 florofor efektörheyecan için 405 nanometre lazer ışığı kullanın ve 425 ila 475 nanometre emisyon toplamak.
İlk olarak, çekim ucunun iki santimetre altında kök kesmek için forceps kullanın. Bir elinde kök tutun ve çiçek tomurcukları ve büyük primordia kaldırmak için ince forseps kullanın. Genç primordia kaldırmak için, yüzde üç agarose içeren bir Petri kabında dik bir pozisyonda SAM düzeltmek.
Daha sonra, SAM yakın herhangi bir genç primordia kaldırmak için bir dürbün ve forceps kullanın. Diseksiyonlu SAM'i propidium iyodürün mililitre çözeltisi başına 250 mikrogram içeren bir tüpe aktarın. Boyama işlemi sırasında numunenin tamamen batık kalmasını sağlarken numunenin 5 ila 10 dakika lekesini bırakın.
Lekeli SAM'i yüzde üç agarose orta içeren küçük bir Petri kabına yerleştirin. SAM'i çift distile suyla kapatın. İncelenen SAM'ları görüntülemek için 25 x daldırma su daldırma lensi ile donatılmış bir confocal lazer tarama mikroskobu kullanın.
Propidium iyodür floresansını heyecanlandırmak ve 570 ila 620 nanometre arasında emisyon toplamak için 561 nanometre lazer ışığı kullanın. MTurquoise2 florofor heyecanlandırmak ve 425 ila 475 nanometre emisyon toplamak için 405 nanometre lazer ışığı kullanın. Z yönünde 50 mikrometreye yayılan ve adım boyutu 0,5 mikrometre olan görüntü yığınlarını kaydedin.
DEX ile indüksiyon kök endodermis phloem öncüleri ve cambium hücre tipi spesifik mTurquoise2 ifade yol açar, ve ateş apikal meristem kök hücreleri. Transaktivasyon için bir test çalışması olarak, V16 aktivasyon etki alanına kaynaşmış ikincil hücre duvarı ana transkripsiyon faktörü VND7'yi kodlayan bir efektör çizgi oluşturulur. Dex veya DMSO'nun 15 mikrolitresi ile beş günlük tek tedaviden sonra, başlangıç kılıfındaki ektopik lignifikasyonun görselleştirilmesi için kök kesitler hazırlanır.
İndüklenen örneklerde başlangıç kılıfı hücreleri propidium iyodür kanalı için güçlü bir sinyal gösterirken, bazı hücreler ksilem hücrelerinde hücre duvarının tipik retikülat kalınlaşmasını gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, farklı dokularda gen ekspresyonunu nasıl tetiklayacağınızı ve numunelerinizi görüntülemeye nasıl hazırlayacağınızı net bir şekilde anlamanız gerekir. Bu yordamı takiben, kurulan sürücü hatları, araştırma ilgi alanlarına göre diğer kullanıcılar tarafından oluşturulan çok çeşitli efektör yapıları ile kullanılabilir.
Bu kısayol, bitki araştırmacılarının hücre tipi spesifik ekspresyonun veya ayrılmış bir zamanda ilgi çeken bir genin nakavtının etkisini hızla değerlendirmelerine yardımcı olmalıdır. Bu hücre tipi spesifik indüksiyon sistemi kortikosteroid deksametazon kullanımını gerektirir. Doğrudan temastan kaçınılmalıdır, bu nedenle tedavi sırasında eldiven ve yüz maskesi takmak önemlidir.
