Jiří Macas'a (Biyoloji Merkezi CAS, České Budějovice, Çek Cumhuriyeti) agrobakteriyel suşu sağladığı için teşekkür ederiz. CEITEC MU'nun Çekirdek Tesis Bitki Bilimleri, teknik desteği için kabul edilmektedir. Bu çalışma, Çek Cumhuriyeti Eğitim, Gençlik ve Spor Bakanlığı tarafından Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu-Projesi "SINGING PLANT" ile desteklenmiştir. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446) ve INTER-COST projesi LTC20004.

Bitkilerde Agrobakteri Aracılı Tüylü Kök İndüksiyonu ve Rejenerasyonu

<ol>
	<li>Lee, L. Y., Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-DNA+binary+vectors+and+systems.">T-DNA binary vectors and systems.</a> Plant Physiology. 146 (2), 325-332 (2008).</li><li>Christey, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Ri-mediated+transformation+for+production+of+transgenic+plants.">Use of Ri-mediated transformation for production of transgenic plants.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Plant. 37 (6), 687-700 (2001).</li><li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-Mediated+Plant+Transformation:+the+Biology+behind+the+&#8220;Gene-Jockeying&#8221;+Tool.">Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the &#8220;Gene-Jockeying&#8221; Tool.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (1), 16-37 (2003).</li><li>Georgiev, M. I., Agostini, E., Ludwig-M&#252;ller, J., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+transformed+roots:+from+plant+disease+to+biotechnological+resource.">Genetically transformed roots: from plant disease to biotechnological resource.</a> Trends in Biotechnology. 30 (10), 528-537 (2012).</li><li>Gutierrez-Valdes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hairy+root+cultures&#8212;a+versatile+tool+with+multiple+applications.">Hairy root cultures&#8212;a versatile tool with multiple applications.</a> Frontiers in Plant Science. 11, 33 (2020).</li><li>Niazian, M., Belzile, F., Torkamaneh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+planta+hairy+root+transformation:+a+powerful+platform+for+functional+analysis+of+root+traits+in+Soybean.">CRISPR/Cas9 in planta hairy root transformation: a powerful platform for functional analysis of root traits in Soybean.</a> Plants. 11 (8), 1044 (2022).</li><li>Petit, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+extension+of+the+opine+concept:+plasmids+in+Agrobacterium+rhizogenes+cooperate+for+opine+degradation.">Further extension of the opine concept: plasmids in Agrobacterium rhizogenes cooperate for opine degradation.</a> Molecular and General Genetics MGG. 190 (2), 204-214 (1983).</li><li>Ozyigit, I. I., Dogan, I., Tarhan, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+and+its+biotechnological+applications+in+crops.">Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation and its biotechnological applications in crops.</a> Crop improvement. , (2013).</li><li>Jedli&#269;kov&#225;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hairy+root+transformation+system+as+a+tool+for+CRISPR/Cas9-directed+genome+editing+in+oilseed+rape+(Brassica+napus).">Hairy root transformation system as a tool for CRISPR/Cas9-directed genome editing in oilseed rape (Brassica napus).</a> Frontiers in Plant Science. 13, 919290 (2022).</li><li>Steinbauerov&#225;, V., Neumann, P., Macas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evidence+for+splicing+of+intron-containing+transcripts+of+plant+LTR+retrotransposon+Ogre.">Experimental evidence for splicing of intron-containing transcripts of plant LTR retrotransposon Ogre.</a> Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 427-436 (2008).</li><li>Neumann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centromeres+off+the+hook:+massive+changes+in+centromere+size+and+structure+following+duplication+of+CenH3+gene+in+Fabeae+species.">Centromeres off the hook: massive changes in centromere size and structure following duplication of CenH3 gene in Fabeae species.</a> Molecular Biology and Evolution. 32 (7), 1862-1879 (2015).</li><li>Montazeri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+analysis+of+the+hairy+root+induction+methods+in+Hypericum+perforatum.">A Comparative analysis of the hairy root induction methods in Hypericum perforatum.</a> Journal of Plant Molecular Breeding. 7 (1), 67-76 (2019).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peat-based+hairy+root+transformation+using+Rhizobium+rhizogenes+as+a+rapid+and+efficient+tool+for+easily+exploring+potential+genes+related+to+root-knot+nematode+parasitism+and+host+response.">Peat-based hairy root transformation using Rhizobium rhizogenes as a rapid and efficient tool for easily exploring potential genes related to root-knot nematode parasitism and host response.</a> Plant Methods. 19 (1), 22 (2023).</li><li>Christey, M. C., Sinclair, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+transgenic+kale+(Brassica+oleracea+var.+acephala),+rape+(B.+napus)+and+turnip+(B.+campestris+var.+rapifera)+plants+via+Agrobacterium+rhizogenes+mediated+transformation.">Regeneration of transgenic kale (Brassica oleracea var. acephala), rape (B. napus) and turnip (B. campestris var. rapifera) plants via Agrobacterium rhizogenes mediated transformation.</a> Plant Science. 87 (2), 161-169 (1992).</li><li>Christey, M. C., Sinclair, B. K., Braun, R. H., Wyke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+transgenic+vegetable+brassicas+(Brassica+oleracea+and+B.+campestris)+via+Ri-mediated+transformation.">Regeneration of transgenic vegetable brassicas (Brassica oleracea and B. campestris) via Ri-mediated transformation.</a> Plant Cell Reports. 16 (9), 587-593 (1997).</li></ol>

Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişki olmaksızın yürütüldüğünü beyan ederler.

B. napus ve A. thaliana'da tüylü kök transformasyonu ve ardından rejenerasyon için basit bir protokol geliştirdik. Bu işlem, hipokotil (B. napus) veya birincil çiçeklenme sapında (A. thaliana) enjeksiyon bazlı tüylü kök indüksiyonunu içerir. Bu çalışmada sunulan Brassicaceae üyelerinin yanı sıra, hipokotilin bir Ri plazmidi taşıyan agrobakteriyel suşu C58C1 ile enjekte edilmesi yöntemi, Fabaceae familyasında10,11 de etkili olmuştur.
Enjeksiyon bazlı yönteme bir alternatif, eksplantın bir bakteri süspansiyonuna daldırılmasından ve ardından eksplantın agrobakterilerle birlikte yetiştirilmesinden oluşan daldırma bazlı dönüşümdür. Enjeksiyon bazlı yöntemin daldırma yöntemine göre avantajı, bazı protokol adımlarının yokluğundan tasarruf edilen zamandır: eksplant hazırlama, birlikte yetiştirme süresinin bir testi ve tüylü köklerin indüksiyonu için hormon içeren bir ortam üzerinde kültür. Her iki yaklaşım da tüylü kök indüksiyonu için etkili olmakla birlikte, enjeksiyon bazlı yöntemle bazı türlerde eksplant daldırmaya göre daha yüksek transformasyon etkinliği gözlenmiştir12,13. Ayrıca, enjeksiyona dayalı dönüşüm, kompozit bitkiler (transgenik tüylü kökler ve yabani tip sürgünler) üretmek için de yararlıdır. Dönüştürülen bitkinin orijinal kökleri kesildikten sonra, tüylü kökler bitki büyümesini destekler ve transgen tüm bitki bağlamında incelenebilir.
Tüylü kök indüksiyonunun kritik adımı, inokulumun hipokotil veya birincil çiçeklenme sapına enjekte edilmesidir. B. napus'un hipokotilleri kırılabilir ve tüm hipokotilin kesilmesi kolayca gerçekleşebilir. Aynısı, çiçeklenme sapı inceliği nedeniyle A. thaliana ile de gözlemlenebilir. Farklı türlerin/çeşitlerin dönüşüm verimliliğinin karşılaştırılması gerekiyorsa, bitkileri enjekte etmede manipülasyon ve becerinin neden olduğu hatayı önlemek için tüm deneyleri bir kişinin yapmasını öneririz.
B. napus DH12075 ve A. thaliana Col-0'da tüylü kök rejenerasyonu için etkili bir protokol geliştirdik. Rejenerasyon oldukça değişken bir süreç olduğundan, tercih edilen bir türe veya çeşide bazı protokol değişiklikleri uygulanabilir. Örneğin, tüylü kök kaynaklı sürgünler, B. oleracea14'te farklı bir oksin/sitokinin oranı (1:1) ile ortaya çıkarılabilir. Alternatif olarak, B. campestris tüylü köklerdeolduğu gibi BAP yerine sitokinin tidiazuron kullanılabilir 15.
Ri plazmid T-DNA'nın bitki genomuna çoklu eklenmesi, tüylü kök transformasyonu ve rejenerasyon sisteminin potansiyel bir sınırlamasını temsil eder. Bu gibi durumlarda, T1 fidelerinin segregasyon analizinden sonra Ri plazmidinden TL/TR içermeyen hiçbir bitki ortaya çıkarılmaz. Bu nedenle, her transgen için birkaç bağımsız tüylü kök hattı oluşturmanızı öneririz.
Tüylü kök kültürleri, hızlı kurulumları ve ucuz bakımları nedeniyle (yetiştirme ortamında hormon gerekmez) gen fonksiyonel çalışmaları için son derece güçlü bir araçtır. Bu protokol, B. napus ve A. thaliana'da tüylü kök indüksiyonu ve rejenerasyonu için yöntemleri kapsar ve bu, ilgilenilen transgeni doğrudan tüylü kök kültürlerinde, kompozit bitkiler kullanılarak tüm bitki bağlamında veya transgenik bitkilerin rejenerasyonundan sonra incelemek için kullanılabilir.

Bitki dönüşümü, bitki biyolojisindeki herhangi bir genetik çalışmanın darboğazıdır. Toprak kaynaklı bir bakteri olan Agrobacterium tumefaciens, transformantlar üretmek için çiçek daldırma veya doku kültürü yoluyla gen iletimi için bir araç olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. A. tumefaciens, bir yaralama bölgesindeki bitkileri enfekte eder ve T-DNA'nın bir Tümör indükleyici (Ti) plazmidden konakçı bitki genomuna aktarılması ve entegrasyonu nedeniyle tümörlere neden olur. Yabani tip T-DNA içermeyen modifiye Ti plazmidli tasarlanmış A. tumefaciens suşları ve ilgilenilen bir geni eklemek için yapay T-DNA ve klonlama bölgelerine sahip bir ikili vektör, verimli bir bitki dönüşüm sistemi olarak yaygın olarak kullanılır1. Bununla birlikte, birçok model tür ve mahsul, çiçek daldırmasına veya in vitro bitki rejenerasyonuna karşı inatçıdır veya bu dönüşüm sisteminin verimliliğini etkileyen uzun büyüme döngülerine sahiptir.
Agrobacterium rhizogenes, bir konakçı bitkiyi enfekte ettikten sonra yaralama bölgesinde maceracı köklerin veya tüylü köklerin oluşumunu indükler. A. tumefaciens'e benzer şekilde, A. rhizogenes, bir T-DNA'sını Kök indükleyici (Ri) bir plazmitten konakçı bitki genomuna aktararak transgenik tüylü köklerin gelişmesine neden olur. Bu süreç esas olarak kök onkojenik lokus (rol) genleri 2,3 tarafından kontrol edilir. Hem Ri plazmidini hem de ilgilenilen bir geni kodlayan yapay bir ikili vektörü taşıyan agrobakteriyel suşlar kullanılarak, rekombinant proteinler üretmek, promotörlerin veya genlerin işlevini analiz etmek veya Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar (CRISPR'ler)/CRISPR ile ilişkili protein 9 (Cas9)4,5,6.
Protokolümüz, Ri plazmidi pRiA4b7'yi taşıyan transkonjugan Ti-less A. tumefaciens C58C1 suşunu kullanır. Ri plazmidinin T-DNA'sı, bitki genomuna bağımsız olarak entegre olabilen sağ ve sol T-DNA (SIRASIYLA TR-DNA ve TL-DNA) olmak üzere iki bölgeden oluşur8. Bu sistemden yararlanılarak, Brassica napus DH12075 çeşidindeki uzun eksplant dönüşüm süreci optimize edildi9. Aşağıda ayrıntıları verilen protokol, seçilen tüylü kök hatlarının yenilenmesine ve ilgilenilen transgeni taşıyan ve rol genlerinden arınmış T1 bitkilerinin yaklaşık 1 yıl içinde elde edilmesine izin verir. Enjeksiyon bazlı tüylü kök dönüşümü, Arabidopsis thaliana Col-0'ın dönüştürülmesiyle gösterildiği gibi diğer Brassicaceae türlerinde kullanılabilir. Hipokotil, B. napus'u dönüştürmek için kullanılırken, A. thaliana birincil çiçeklenme gövdesine enjekte edilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.50 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>125.215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% solution of commercial bleach&#160;</td>
			<td>SAVO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-naphthaleneacetic acid (NAA)&#160;</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>N0903</td>
			<td>Callus regeneration medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>108.132/108.078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M micropore tape</td>
			<td>Micropore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Benzylaminopurine (BAP)&#160;</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>B0904</td>
			<td>Callus regeneration medium, Shoot elongation medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological agar</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM201</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological peptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0037</td>
			<td>LB and YEB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beef extract</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X975.1</td>
			<td>YEB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottles</td>
			<td>DURAN</td>
			<td>L300025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime sodium</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>C0111</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Serva</td>
			<td>3955301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTAB Hexadecyltrimethylammonium bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>52365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA - Titriplex III, (Ethylenendinitrilo)tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ES134-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elctroporation cuvette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophesis agar, peqGOLD universal</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-2789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis chamber</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis gel reader</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electroporator GenePulser Xcell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethidium bromide</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser/MicroPulser electroporation cuvettes, 0.2 cm gap</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1652082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Ruler DNA ladder mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SM0331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibberellic acid (GA3)</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>G0907</td>
			<td>Shoot elongation medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-pirerazinyl)-ethansulfonique</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1101100250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>indole-3-butyric acid (IBA)</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>I0902</td>
			<td>Root induction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin monosulfate</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>K0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magenta GA-7 Plant Culture Box w/ Lid</td>
			<td>Plant Media</td>
			<td>V8505-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring cylinder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES monohydrate</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M1503</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium (MS)</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0237</td>
			<td>Medium for germination, Plant growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium (MS) + B5 vitamins&#160;</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0231</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle Agani 26G x 1/2 - 0.45 x 13mm</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8169</td>
			<td>Callus regeneration medium, Root induction medium, Medium for germination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVP 40 (polyvinylpyrolidone Mr 40000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9003-39-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Redtaq DNA Polymerase,Taq for routine PCR with inert dye, 10X buffer included</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4309-250UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retsh mill</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Lachner</td>
			<td>30093-APO</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>square Petri Dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>GOSSBP124-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Penta</td>
			<td>24970-31000</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P666.1</td>
			<td>Rotylabo syringe filters 0.22 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ticarcillin disodium</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>T0180</td>
			<td>Hairy root growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan</td>
			<td>Serva</td>
			<td>3719003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water</td>
			<td>Millipore Milli-Q purified water&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>Y1333</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hairy root transformation and regeneration in arabidopsis thaliana and brassica napus

Tüylü kök dönüşümü, çeşitli türlerde bitki biyoteknolojisi için çok yönlü bir araçtır. Kök indükleyici (Ri) plazmid taşıyan bir Agrobacterium suşu tarafından enfeksiyon, T-DNA'nın Ri plazmidinden bitki genomuna aktarılmasından sonra yaralama bölgesinde tüylü köklerin oluşumunu indükler. Protokol, Brassica napus DH12075 ve Arabidopsis thaliana Col-0'da enjeksiyon bazlı tüylü kök indüksiyonunun prosedürünü ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Tüylü kökler, ilgilenilen bir transgeni analiz etmek için kullanılabilir veya transgenik bitkilerin üretimi için işlenebilir. Sitokinin 6-benzilaminopurin (5 mg/L) ve oksin 1-naftalinasetik asit (8 mg/L) içeren rejenerasyon ortamı, her iki türde de başarılı bir şekilde sürgün oluşumunu ortaya çıkarır. Protokol, ilgilenilen bir transgen taşıyan ve Ri plazmidinden T-DNA içermeyen bitkiler elde etmek için rejenerantların ve T1 bitkilerinin genotiplenmesini ve seçimini kapsar. Kompozit bir tesisin oluşumuna yol açan alternatif bir süreç de tasvir edilmiştir. Bu durumda, tüylü kökler sürgünde tutulur (doğal kökler yerine), bu da tüylü kök kültürlerinde bir transgenin tüm bitki bağlamında incelenmesini sağlar.

Plant transformation is the bottleneck of any genetic study in plant biology. A soil-borne bacterium, Agrobacterium tumefaciens, is widely used as a means for gene delivery by floral dip or tissue culture to generate transformants. A. tumefaciens infects plants at a wounding site and causes tumors due to the transfer and integration of T-DNA from a Tumor-inducing (Ti) plasmid into the host plant genome. Engineered A. tumefaciens strains with modified Ti plasmid without the wild-type T-DNA and a binary vector with artificial T-DNA and cloning sites for inserting a gene of interest are commonly used as an efficient plant transformation system1. However, many model species and crops are recalcitrant to floral dip or in vitro plant regeneration or have long growth cycles, impacting the efficiency of this transformation system.
Agrobacterium rhizogenes induces the formation of adventitious roots, or hairy roots, at the wounding site after infecting a host plant. Similar to A. tumefaciens, A. rhizogenes transfers a T-DNA from a Root-inducing (Ri) plasmid to the host plant genome, causing the development of transgenic hairy roots. This process is controlled mainly by the root oncogenic loci (rol) genes2,3. Using agrobacterial strains carrying both the Ri plasmid and an artificial binary vector encoding a gene of interest, hairy root cultures have been used to produce recombinant proteins, analyze the function of promoters or genes, or edit genomes using Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPRs)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)4,5,6.
Our protocol uses the transconjugant strain Ti-less A. tumefaciens C58C1 carrying the Ri plasmid pRiA4b7. The T-DNA of the Ri plasmid consists of two regions, right and left T-DNA (TR-DNA and TL-DNA, respectively), that can independently integrate into the plant genome8. Exploiting this system, the lengthy explant transformation process in Brassica napus DH12075 cultivar was optimized9. The protocol detailed below allows for the regeneration of selected hairy root lines and obtaining T1 plants carrying the transgene of interest and free of rol genes in roughly 1 year. The injection-based hairy root transformation can be used in other Brassicaceae species, as shown by transforming Arabidopsis thaliana Col-0. While hypocotyl is used to transform B. napus, A. thaliana is injected into the primary inflorescence stem.

Yazar Spotlight: Brassicaceae'de Gelişmiş Verimlilik için Tüylü Kök Bazlı Dönüşüm Protokollerinin Optimize Edilmesi

Arabidopsis thaliana ve Brassica napus'ta Tüylü Kök Dönüşümü ve Rejenerasyonu

Our research aimed at developing a protocol for an efficient transformation in Brassicaceae. Using a hair root-based transformation, we improved dramatically transformation efficiency in Brassica napus, which is crucial for our research. We also tested the protocol in model species Arabidopsis thaliana.We have optimized the protocol for spring cultivars DH12075 in Brassica napus. The next challenge is to optimize the protocol of transformation and regeneration of winter cultivars in Brassica napus, as well as for Brassica rapa and Brassica oleracea. Hairy roots can be readily propagated, and their rapid growth enables the prompt analysis of the gene of interest shortly after the transformation.Consequently, it becomes feasible to selectively regenerate specific hairy root lines that exhibit the desired trait. For example, a gene mutation introduced by CRISPR-Cas.

Daha önce Brassica napus'un üç çeşidinde, yani DH12075, Topas DH4079 ve Westar9'da enjeksiyon bazlı tüylü kök indüksiyonu için bir protokolü optimize etmiştik. Bu dönüşüm protokolünü model tür A. thaliana'ya uygulamak için, 1 aylık bitkiciklerin birincil çiçeklenme saplarına bir agrobakteriyel aşı enjekte edildi. Saçlı kökler 2-4 hafta sonra enjeksiyon bölgesinde ortaya çıktı. Tüylü kökler eksize edildi ve katı ortamda eksize edildi. Yöntemin bu iki türdeki karşılaştırması Şekil 1'de gösterilmiştir.
Seçilen tüylü kök hatları, sürgün oluşumunu indüklemek için rejenerasyon ortamına aktarıldı. A. thaliana'da, test edilen 10 tüylü kök hattının hepsinde 14 gün içinde sarı calli indüklendi. Rejenerasyon ortamına aktarıldıktan sonraki 3 hafta içinde koyu yeşil lekeler olarak görülebilen ilk sürgün primordia ortaya çıkmıştır (Şekil 2). 4 haftalık kültürden sonra, sürgünler 10 tüylü kök hattının 9'unda (% 90 rejenerasyon verimi) tüylü kökleri kapladı. Bazı durumlarda, nasırdan adventif kökler ortaya çıkmıştır (Şekil 2H). Rejenerasyon besiyerinde 3 ay geçmesine rağmen bir hat yenilenmedi (her 4 haftada bir tüylü kökler taze bir besiyerine aktarıldı). Bu nedenle, A. thaliana tüylü köklerin rejenerasyon etkinliği, B. napus DH120759'un etkinliğine benzer.
B. napus ve A. thaliana'nın tüylü kök rejenerantları, tüylü kök kaynaklı bitkilerin tipik bir özelliği olan bir cüce fenotipi sergiler (Şekil 3)2. Ayrıca yoğun kök sistemleri, buruşuk yapraklar ve çiçeklenme zamanındaki değişiklikleri gözlemledik. Bu sözde tüylü kök (veya Ri) fenotipi, bitki genomuna eklenen Ri plazmidinden gelen rol genlerinden kaynaklanır. Ri T-DNA'nın ve bir ikili vektör üzerinde kodlanan transgenin eklenmesi bağımsız veya bağlantılı olabilir. Bu nedenle, kendi kendine tozlaşma ile oluşturulan T1 dölünün bir ayrışma analizi, ilgilenilen transgeni ifade eden rolsüz bitkilerin belirlenmesine yardımcı olur. T1 bitkilerinin genotiplemesi, TL ve TR'nin ORF'lerine ve ilgilenilen transgene özgü PCR primerleri ile gerçekleştirilir. Agrobakteriyel kontaminasyonun yokluğu, virC primerlerinin PCR ürünlerinin yokluğu ile doğrulanır (Şekil 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig01.jpg"> Şekil 1: A. thaliana ve B. napus'taki prosedürün özeti. Agrobacterium inokulumunun hipokotil veya birincil çiçeklenme gövdesine enjeksiyonu, tüylü köklerin gelişimini indükler. Tüylü kökler, genotiplenecek ve analiz edilecek kompozit bir bitki oluşturmak için doğal köklerin yerini alabilir (mavi oklar). Kültürlenmiş tüylü kökler T0 bitkilerine dönüştürülebilir, T1 bitkilerinde çoğaltılabilir ve genotiplenebilir (yeşil oklar). Tüylü kökler ayrıca fonksiyonel analiz için alt kültüre alınabilir (siyah ok). Genotipleme sonuçlarına örnekler sunulmuştur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig02.jpg"> Şekil 2: A. thaliana'da tüylü köklerin yenilenmesi. (A) Tüylü kök kültürü plakalara aktarıldıktan 1 gün sonra. (B, C) Çallı, rejenerasyon ortamında kültürden 2 hafta sonra gelişti. (D, E) Shoot primordia 3 haftalık kültürden sonra ortaya çıktı. (G, H) Sürgünler 4 hafta sonra oluşur. (H) Nasırdan gelişen maceracı kökler. (C, F, I) Yenileyici olmayan tüylü kök çizgisi. Ölçek çubukları 1 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig02large.jpg" target="_blank">cm'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig03.jpg"> Şekil 3: B. napus ve A. thaliana yabani tip bitkilerin ve tüylü kök kaynaklı rejenerantların (T0 bitkileri) temsili fotoğrafları. Rejenerantların Ri fenotipine dikkat edin. Ölçek çubukları 2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig03large.jpg" target="_blank">cm'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Hairy Root Transformation and Regeneration in Arabidopsis thaliana and Brassica napus at JoVE.com

Protokol , Arabidopsis birincil çiçeklenme sapları ve Brassica napus hipokotilleri kullanılarak tüylü kök indüksiyonunu açıklar. Tüylü kökler kültürlenebilir ve transgenik bitkileri yenilemek için eksplant olarak kullanılabilir.

Hairy root transformation represents a versatile tool for plant biotechnology in various species. Infection by an Agrobacterium strain carrying a ...

Araştırmamız, Brassicaceae'de verimli bir dönüşüm için bir protokol geliştirmeyi amaçladı. Saç kökü bazlı bir dönüşüm kullanarak, araştırmamız için çok önemli olan Brassica napus'ta dönüşüm verimliliğini önemli ölçüde iyileştirdik. Protokolü model türlerde de test ettik Arabidopsis thaliana.Brassica napus'ta DH12075 bahar çeşitleri için protokolü optimize ettik. Bir sonraki zorluk, Brassica napus'un yanı sıra Brassica rapa ve Brassica oleracea'daki kış çeşitlerinin dönüşüm ve yenilenme protokolünü optimize etmektir. Tüylü kökler kolayca çoğaltılabilir ve hızlı büyümeleri, dönüşümden kısa bir süre sonra ilgilenilen genin hızlı bir şekilde analiz edilmesini sağlar.Sonuç olarak, istenen özelliği sergileyen belirli tüylü kök çizgilerini seçici olarak yenilemek mümkün hale gelir. Örneğin, CRISPR-Cas tarafından tanıtılan bir gen mutasyonu.

hairy-root-transformation-regeneration-arabidopsis-thaliana-brassica

Research

JoVE Journal

Biology

Hairy Root Transformation and Regeneration in Arabidopsis thaliana and Brassica napus

2.0K Görüntüleme.  Masaryk University. Araştırmamız, Brassicaceae'de verimli bir dönüşüm için bir protokol geliştirmeyi amaçladı. Saç kökü bazlı bir dönüşüm kullanarak, araştırmamız için çok önemli olan Brassica napus'ta dönüşüm verimliliğini önemli ölçüde iyileştirdik. Protokolü model türlerde de test ettik Arabidopsis thaliana.Brassica napus'ta DH12075 bahar çeşitleri için protokolü optimize ettik. Bir sonraki zorluk, Brassica napus'un yanı sıra Brassica rapa ve Brassica oleracea...

Video: Yazar Spotlight: Brassicaceae'de Gelişmiş Verimlilik için Tüylü Kök Bazlı Dönüşüm Protokollerinin Optimize Edilmesi

Hairy root transformation represents a versatile tool for plant biotechnology in various species. Infection by an Agrobacterium strain carrying a Root-inducing (Ri) plasmid induces the formation of hairy roots at the wounding site after the transfer of T-DNA from the Ri plasmid into the plant genome. The protocol describes in detail the procedure of the injection-based hairy root induction in Brassica napus DH12075 and Arabidopsis thaliana Col-0. The hairy roots may be used to analyze a transgene of interest or processed for the generation of transgenic plants. Regeneration medium containing cytokinin 6-benzylaminopurine (5 mg/L) and auxin 1-naphthaleneacetic acid (8 mg/L) successfully elicits shoot formation in both species. The protocol covers the genotyping and selection of regenerants and T1 plants to obtain plants carrying a transgene of interest and free of T-DNA from the Ri plasmid. An alternative process leading to the formation of a composite plant is also depicted. In this case, hairy roots are kept on the shoot (instead of the natural roots), which enables the study of a transgene in hairy root cultures in the context of the whole plant.

The protocol describes hairy root induction using Arabidopsis primary inflorescence stems and Brassica napus hypocotyls. The hairy roots can be cultured and used as explants to regenerate transgenic plants.

Biyoloji

Agrobacterium-Mediated Hairy Root Transformation in Brassica napus DH12075

To begin, place the seeds of Brassica napus DH12075 in micro-tubes. To degrease the seeds, add water and 0.1%detergent to the micro-tube, and shake for 60 seconds. Now rinse the seeds with water followed by 70%ethanol, each for 60 seconds.Next, place the seeds in 10%sodium hypochlorite solution and shake for 20 minutes. After removing the bleach, wash the seeds four times with sterile water for 60 seconds each. Place the seeds on a Petri dish containing the seed germination medium.Cold stratify the seeds at four degrees celsius overnight before moving the dish to a cultivation room. After five days, transfer the seedlings to a plant culture box containing a plant growth medium. Inoculate Ti less agrobacterium tumefaciens C58C1 carrying a hairy root-inducing plasmid PRIA 4B in five milliliters of LB medium.Grow the culture overnight at 28 degrees Celsius until it reaches an optical density at 600 nanometers of 0.9 to one. Transfer the bacterial inoculum into the syringe. Using a 26-gauge needle mounted on the syringe, puncture the hypocotyl of an 18-day-old seedling at about one centimeter above the growth medium.Inject approximately 50 microliters of inoculum into the wound and scratch the tissue on the surface of the hypocotyl. Return the plant to the cultivation room at 21 degrees Celsius for two to four weeks. Next, cut off the callus with emerged hairy roots from the hypocotyl.Place the callus with hairy roots on a Petri dish containing hairy-root growth medium and antibiotics to suppress agrobacterial growth. Seal the dish with gas-permeable tape before incubating it at 24 degrees Celsius. After incubation, isolate the hairy roots from the callus, and transfer the individual roots to a hairy-root growth medium.Alternatively, to generate a composite plant consisting of wild-type shoots and transgenic hairy roots, remove the native roots of the plant. Then transfer the plant with emerging hairy roots to a culture box containing plant-growth medium and antibiotics to suppress agrobacterial growth.

Brassica napus DH12075'da Agrobakteri Aracılı Tüylü Kök Dönüşümü

Regeneration and Selection Methods for Brassica napus DH12075 Regenerants and T1 Plants

Under sterile conditions, using tweezers, transfer five to 10 hairy root lines of Brassica napus on a dish containing regeneration medium. Seal the dish with gas permeable tape and culture at 21 degrees Celsius in a long-day photoperiod. Every three to four weeks, transfer the hairy roots to a Petri dish with fresh regeneration medium.Observe the callous formation after approximately two weeks and shoot from the callous after two more weeks of callous formation. Individualize the shoots and transfer them to the plant culture box containing the shoot elongation medium. After two to three weeks, cut off the remnants of the callous from the shoot and transfer the elongated shoots to the plant culture box containing root induction medium.Now transfer the rooted plant to the soil and acclimatize it first in the phytotrons Then transfer the plant to a greenhouse for flowering. To speed up the production of T1 plants, collect siliques containing mature green seeds from the T0 regenerants. While working in a sterile flow box, surface sterilize the siliques with 70%ethanol.Place the siliques on a plate lid or a slide. Using a 24 gauge needle mounted on a one milliliter syringe, slit the siliques along the valve margins. Open the carpals and put them aside.Collect the immature seeds and transfer them to a plate containing seed germination medium. Seal the plate and place it in a cultivation room until germination. Compared to the wild-type, hairy root regenerative of B.napus displayed a dwarf phenotype with dense root systems, wrinkled leaves, and altered flowering time.

Brassica napus DH12075 Rejenerantları ve T1 Bitkileri için Rejenerasyon ve Seleksiyon Yöntemleri

Hairy Root Transformation and Regeneration in Arabidopsis thaliana Col-0

To begin, place the surface-sterilized Arabidopsis thaliana Col-0 seeds onto a plate containing seed germination medium. After two days of cold stratification, move the plate to a cultivation room set at 21 degrees Celsius with a long day photoperiod and 50%humidity. Transfer one-week old seedlings to a plant culture box with a plant growth medium.Grow the Agrobacterium tumefaciens culture in LB medium until it reaches an optical density at 600 nanometers of 0.9 to 1. Using a needle mounted on an insulin syringe, inject approximately 50 microliters of bacterial culture at the base of the primary inflorescent stem of a one-month old Arabidopsis plantlet. Scratch the tissue on the surface of the primary stem with the syringe.After two to four weeks, excise the emerging hairy roots and cultivate them on a Petri dish with the hairy root growth medium supplemented with antibiotics to suppress agrobacterial growth. Culture the hairy root at 24 degrees Celsius in the dark. After one to two weeks, individualize the hairy roots on the plate with hairy root growth medium and transfer selected hairy root lines to a fresh medium every four to five weeks.Transfer the hairy roots to a plate with a regeneration medium to induce callus formation, and culture at 21 degrees Celsius in a long day photoperiod. Once the shoots emerge from the callus, cut the shoots and transfer them to a shoot elongation medium for two to three weeks to promote growth and elongation. Then transfer the elongated shoots to the root induction medium.Finally, transfer the rooted plant to the soil to perform transgenic selection. In A.thaliana, yellow calli were induced within 14 days in all tested hairy root lines. First shoot primordia, visible as dark green spots, emerged within three weeks after transfer to the regeneration medium.After four weeks, shoots covered the hairy roots in 90%of the lines, with some cases showing adventitious root formation. However, one line did not regenerate even after three months. Compared to the wild type, hairy root regenerants of A.thaliana displayed a dwarf phenotype with dense root systems, wrinkled leaves, and altered flowering time.