Name: floral-dip transformation of flax (linum usitatissimum) to generate transgenic progenies with a high transformation rate
Uploaded: 2014-12-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
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This work was supported by the Ogelbay fund.

1. Crescere Piante <ol><li> 6 settimane prima immersione, riempimento 5 pentole pollici con terreno e seminare semi di lino ¼ pollice profondo nel terreno (4 semi per piatto). Assicurati di rassodare il terreno sopra i semi. Innaffiare le piante regolarmente e mantenere in lungo luce diurna (luce 14 ore e 10 ore scuro). </li><li> Controllare le piante regolarmente infiorescenze primari (cluster di organi fiori &quot;). Le piante sono pronte per la trasformazione quando le gemme sono visibili e hanno appena formata nella infiorescenza (figura 1 e 2). Per vedere i germogli, tagliare le foglie intorno ad esso, se necessario. NOTA: Usando il miglior palcoscenico fiore è critica ed è dettagliato nella discussione. <ol><li> Utilizzare il ramo principale dell&#39;impianto per il trattamento sperimentale in quanto produce più fiori che i rami laterali. Utilizzare i rami laterali sia come controlli (non essere immersi) o per altri trattamenti sperimentali. </li><li> In alternativa, utilizzare i principali e laterali ramistesso impianto per il trattamento sperimentale e utilizzare un&#39;altra pianta come controllo o per altri trattamenti sperimentali. Utilizzare le etichette per contrassegnare i singoli rami e fiori singoli con la data e il tipo di trattamento. </li></ol></li></ol> 2. Clonazione e trasformazione per Escherichia coli (E. coli) Cells <ol><li> Clone il frammento / gene di interesse nel sito di clonaggio multiplo di una pianta vettore binario ospitare il T-DNA. <ol><li> Eseguire la clonazione in un passo o due gradini. <ol><li> Direttamente clonare piccoli inserti in questo protocollo (~ 500 bp) nell&#39;impianto binario vettoriale. In questo protocollo, utilizzare lo stabilimento vettore binario (PRI909). In caso contrario, utilizzare altri vettori binari di piante in una strategia simile. </li><li> In alternativa, clonare inserti di grandi dimensioni (≥6.5 kb) in due fasi: la prima con un kit generale clonazione commerciale (non piantare specifico), poi sottoclone nella pianta vettore binario. </li></ol></li></ol></li><li> Impostare una reazione PCRzione per amplificare il gene di interesse. Progettare i primer con siti di restrizione alla fine del 5 &#39;(secondo il sito di clonazione multiplo pianta del vettore binario in uso). <ol><li> Eseguire PCR standard utilizzando DNA genomico di lino con le seguenti condizioni di ciclo: una presa iniziale di 24 ° C, quindi 2 minuti a 94 ° C, seguita da 30 cicli di 98 ° C per 5 sec, 60 ° C per 15 sec, e 72 ° C per 2 min. Eseguire una fase di estensione finale a 72 ° C per 5 minuti, seguito da una presa indefinita a 4 ° C. </li><li> I prodotti di PCR separate sul 1% Tris / borato / EDTA (TBE) gel, corrono il gel a 100 V per 1 ora. Purificare i prodotti dal gel e quantificare via Nanodrop. </li></ol></li><li> Impostare il mix legatura per clonare il prodotto di PCR nel vettore di clonaggio commerciale. Seguire il protocollo del produttore. </li><li> Trasforma il mix legatura in chimicamente competente E. coli come segue. <ol><li> Aggiungere 2 ml di mix legatura in un flaconcino di chemically competente E. coli. Incubare in ghiaccio per 30 min. </li><li> Heat Shock le cellule per 30 sec a 42 ° C (Heat tempo shock e temperatura dipende dal tipo di cellule utilizzate). </li><li> Incubare in ghiaccio e aggiungere 250 ml di brodo RT eccellente ottimale con repressione da cataboliti (SOC) di media. </li><li> Chiudere la provetta e incubare in un agitatore orbitale a 200 rpm a 37 ° C per un ora. </li><li> Distribuire 10 - 50 microlitri da ogni trasformazione su una piastra preriscaldata LB (preriscaldata a 37 ° C) + antibiotico appropriato selettiva (determinare l&#39;antibiotico selettivo in base al tipo di clonazione commerciale vettore utilizzato). Incubare le piastre a 37 ° CO / N. </li></ol></li><li> Scegli ~ 10 colonie per mini depurazione preparazione plasmide, utilizzando un kit commerciale. Mini purificazione preparazione plasmide viene generalmente eseguita come segue. NOTA: i nomi di buffer sono specifici per il kit commerciale utilizzato, ma le loro funzioni generali sono simili. <ol><li> Inoculare le singole colonie in 2- 5 ml terreno LB contenente l&#39;antibiotico selettiva appropriata (determinato in base al tipo di vettore commerciale utilizzato). </li><li> Incubare per circa 8 ore a 37 ° C con scuotimento vigoroso (~ 300 rpm). </li><li> Raccogliere le cellule per centrifugazione a 6.000 xg per 10 min. </li><li> Risospendere il pellet nel tampone di risospensione 250 microlitri. Mescolare e vortex per disperdere completamente il pellet. </li><li> Lyse le cellule batteriche aggiungendo 250 ml di tampone di lisi, mescolare accuratamente invertendo i tubi 4 - 6 volte. </li><li> Neutralizzare il lisato nel buffer neutralizzazione e invertire 4 - 6 volte per mescolare. Centrifugare per 10 minuti a ~ 17.900 xg in una microcentrifuga tavolo. </li><li> Trasferire il surnatante dal passaggio precedente per una colonna di spin. Centrifugare nuovamente ~ 17.900 xg per 30 - 60 a sec. </li><li> Lavare la colonna di spin aggiungendo 0,75 ml tampone di lavaggio e centrifuga per 30-60 sec. Gettare il flow-through. </li><li> Centrifuga per un ulteriore 1 min Remove tampone di lavaggio residuo. Porre la colonna di spin in un ambiente pulito 1,5 ml provetta. Per eluire DNA, aggiungere acqua 50 microlitri al centro di ogni colonna. Lasciate riposare per 1 minuto, e centrifugare per 1 min. </li></ol></li></ol> 3. Analizzare il purificato Plasmidi per la presenza di Insert <ol><li> Limitazione Digest: <ol><li> Impostare una restrizione digest per determinare la presenza dell&#39;inserto per digestione del plasmide con gli enzimi di restrizione usati per clonare l&#39;inserto. Un tipico doppio restrizione digerire reazione come segue: 1 mg di plasmide purificato, 1 ml di ogni enzimi di restrizione, 2 ml 10x restrizione digerire tampone + 2 pl BSA (se applicabile), X ml di acqua (per un totale di 20 microlitri) </li><li> Miscelare delicatamente e incubare a temperatura consigliata (varia da un enzima all&#39;altro). </li><li> Analizzare la restrizione digerire reazione 1% TBE gel, correre a 100 V per 1 ora e cercare drop-out di dimensioni adeguate. </li></ol></li><li> Analisi PCR: <ol><li> Impostare una PCR con il plasmide purificato, utilizzando primer dalla regione vector commerciale per amplificare all&#39;interno dell&#39;inserto o la giunzione tra il vettore e l&#39;inserto. Primer comuni sono M13 avanti e indietro e primer T3 / T7. </li><li> In questo protocollo, utilizzare le seguenti condizioni di ciclo di PCR: una presa iniziale di 24 ° C, quindi 2 minuti a 94 ° C, seguita da 18 cicli a 98 ° C per 5 sec, 60 ° C per 15 sec e 72 ° C per 2 min. Eseguire una fase di estensione finale a 72 ° C per 5 minuti, seguito da una presa indefinita a 4 ° C. </li><li> Prodotti Load PCR su un TBE gel 1% e correre per 100 - 120 V per 1 ora. </li></ol></li><li> Sequencing: <ol><li> Invia il plasmide purificato in un impianto commerciale sequenziamento per analizzare e confermare la presenza dell&#39;inserto. </li><li> Una volta ottenuto il costrutto corretta, utilizzare per la seconda fase di clonazione (nella pianta vettore binario). NOTA: i passaggi 2,3-3,3può essere eliminato se la clonazione è completata in un solo passo. </li></ol></li></ol> 4. Clonazione nell&#39;impianto Binary Vector (PRI909) e E. coli Transformation <ol><li> Impostare una doppia restrizione digerire reazioni linearizzare la pianta vettore binario e isolare l&#39;inserto precedentemente clonato utilizzando gli stessi siti di restrizione enzimi che sono stati aggiunti i primer (punto 2.2). </li><li> Analizzare i digest restrizione con elettroforesi su gel, correre a 100 V per 1 - 2 ore. Tagliare l&#39;inserto e la pianta linearizzato vettore binario dal gel. </li><li> Utilizzare un kit commerciale per purificare i prodotti in gel. Consultare il manuale del costruttore. </li><li> Impostare una reazione legatura per legare l&#39;inserto nella pianta vettore binario. L&#39;inserto rapporto vettore dipende dalla dimensione dell&#39;inserto e la pianta vettore binario. In questo protocollo l&#39;inserto LIS1 era 6,5 ​​kb e la pianta vettore binario è stato di 9 kb. Quindi, utilizzare un 1: 2 inserto rapporto vettoriale. </li><li&gt; Ripetere i passaggi 2,4-3 per la trasformazione batterica, la purificazione plasmide e analisi. Una volta ottenuto il costrutto corretta (insert + pianta vettore binario), procedere al elettroporazione al punto 5. </li></ol> 5. elettroporazione in Agrobacterium tumefaciens Cells elettricamente competenti <ol><li> Scongelare una fiala di Agrobacterium tumefaciens cellule elettricamente competenti sul ghiaccio. </li><li> Aggiungere 1 ng di binario DNA vettore plasmidico a 20 ml di cellule competenti, sul ghiaccio, e mescolare delicatamente. </li><li> Raffreddare un 0,1 centimetri cuvetta elettroporazione sul ghiaccio. </li><li> Trasferire la miscela cellule / DNA competente per le cuvette di elettroporazione, e toccare per raccogliere la miscela a fondo. Inserire la cuvetta nella macchina elettroporatore e impulsi (condizioni di tensione e di tempo dipendono dalle dimensioni della cuvetta e elettroporatore utilizzato). </li><li> Aggiungere 1 ml di media SOC e cellule di trasferimento in una provetta da 15 ml. </li><li> Incubare per 1 ora a 28 - 30° C, agitando a 100 rpm. Tavola 50 - 100 microlitri di cellule su agar LB + antibiotico appropriato selettiva (dipende dalla pianta plasmide binario e il ceppo di Agrobacterium utilizzata In questo uso protocollo 50 ug / ml di kanamicina e 100 mg / ml di streptomicina.). </li><li> Incubare le piastre fino a 48 ore a 28 - 30 ° C. </li><li> Ripetere il punto 2.5 per la selezione delle colonie e purificazione plasmide. </li><li> Ripetere passaggio 3 per analizzare il plasmide e per verificare l&#39;integrità dell&#39;inserto e T-DNA prima di utilizzare il costrutto floreale-dipping. Ripetere il passaggio 3.2, l&#39;utilizzo di più primer PCR in tutta la regione inserita e in tutte le regioni T-DNA e sequenziamento come al punto 3.3. NOTA: In questo protocollo 4 primer diversi sono stati progettati in tutto il T-DNA e 10 primer attraverso l&#39;inserto. </li><li> Una volta che la presenza della pianta plasmide binario nella colonia Agrobacterium selezionata viene confermata, luogo celle in 50% glicerolo e conservare a -80 ° C. Conservare rimanendo colonie sulla piastra a 4 ° C se devono essere utilizzati entro una settimana 7. </li></ol> 6. Floral-immersione NOTA: 2 giorni prima Floreale-immersione: <ol><li> Crescere cellule tumefaciens alla fase stazionaria (OD 600 tra 0,5-1 è accettabile) in LB + antibiotici appropriati in mezzi liquidi. NOTA: Questi sono gli stessi antibiotici come al punto 5.6, in base vegetale vettore binario e il tipo di ceppo Agrobacterium utilizzato. </li><li> Avviare la coltura di 1: 100 di diluizioni saturo (5 ml) O / N cultura e crescere per 24 - 48 ore a 28-30 ° C agitando a 150 rpm. La cultura dovrebbe aver raggiunto la fase midlogarithmic e più probabile sarà avvicinamento o in fase stazionaria 1. OD di circa 0,8 (OD nuovamente tra 0,5 e 1 è tutto accettabile) 8. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 5.000 xg a RT. </li><li> Risospendere le cellule in terreno infiltrazione (5,0% di saccarosio + ,05-0,003% Silwet L-77). Per il primo turno di immersione, utilizzare 0,05% Silwet-77. Per il secondo e terzo ciclo, ridurre la concentrazione di 0,03% (descritto Discussione). </li><li> Procedere con il passo floreale-dip. Posare la pianta su un fianco e immergere solo i germogli visibili nel mezzo di infiltrazione per 1-2 min. Lasciare la pianta su un lato e coprire con pellicola trasparente per mantenere alta umidità nella cupola (Figura 3). </li><li> Il giorno successivo, posizionare l&#39;impianto in posizione verticale e mantenere normalmente. </li><li> Quando la gemma cresce più grande (di solito dopo circa 10 - 14 giorni), ripetere i passaggi 6,1-6,4. Ridurre il tempo di immersione per 30-60 sec e Silwet-77 concentrazione 0,003%. </li><li> Mantenere le piante normalmente fino loro semi sono maturi e pronti per essere raccolti (figura 4). </li></ol> 7. La selezione di Tra Positivensformants con PCR diretta <ol><li> Seminare i semi T1 sul suolo come al punto 1.1. <ol><li> In alternativa, fare Murashige e Skoog sale basale (MS media) con l&#39;aggiunta di 2,2 g di MS media + 4 g di agar-agar in 500 ml di acqua. Autoclave e versare in piccoli vasi per piante. Conservare nel 4 ° C fino all&#39;uso. </li><li> Seminare il seme mettendoli sul supporto MS solidificato. Tenere sotto lunga diurna (luce 14 ore e 10 ore di buio). I semi germinano in circa 4-6 giorni (Figura 5). </li><li> Utilizzare un seme di ogni fiore come un punto di partenza. Se si ottiene alcun trasformante positivo, ripetere questo passaggio con la scelta di un altro seme dal fiore. NOTA: test semi diversi dagli stessi fiori, perché in alcuni casi non tutti i semi da un fiore saranno trasformati. Selezione di semi supplementari da fiori sperimentali volte è necessario. </li></ol></li><li> Controllare sulle piantine regolarmente. In circa 10 - 14 giorni dopo la germinazione, quando la veralascia sviluppare, testare le piante con PCR diretta. </li><li> Preparare l&#39;estratto di foglie di DNA tagliando 2 - 3 foglie (5-10 mg in peso) da ciascuna piantina e metterli in una provetta. </li><li> Aggiungere 180 ml di NaOH 50 mm per ogni tubo, e incubare per 10 minuti a 95 ° C. </li><li> Neutralizzare l&#39;estratto aggiungendo 20 ml di 1 M Tris-HCl (pH 8,0). </li><li> Usare 1 ml di estratto nella reazione diretta PCR, utilizzando primer disegnati tutti i T-DNA o l&#39;inserto (Figura 7), per selezionare trasformanti positivi. <ol><li> In questo protocollo, utilizzare PCR diretta con una presa iniziale di 24 ° C, quindi 2 min a 98 ° C, seguiti da 40 cicli di (98 ° C per 10 sec, fase di ricottura per 15 secondi, ed una fase di allungamento a 68 ° C). Eseguire una fase di estensione finale a 68 ° C per 5 minuti, seguito da una presa indefinita a 4 ° C. (Fare riferimento alla Tabella 1 per i dettagli su primer, temperature di ricottura e tempi di estensione per i cicli). </li></ol></li><li> Identificare trasformanti positivi e farle crescere alla maturità. Se i semi sono stati germinati in mezzo MS, trapianto suolo in un vaso più grande (Figura 5). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

In alcune specie vegetali, come lino (Linum usitatissimum), trasformazione pianta successo è stato limitato. In precedenza, la trasformazione in lino ha richiesto una infezione da Agrobacterium ferendo e co-coltivazione, applicando particelle Biolistic o mediante ultrasuoni sonicazione, seguita da rigenerazione; un processo che è sia lungo e soggetto ad essere accompagnato da molti eventi mutazionali. Inoltre, il processo di selezione di queste tecniche richiede l&#39;uso di marcatori selezionabili antibiotici come kanamicina. Tuttavia, è stato osservato in letteratura che questo metodo di selezione produce molti falsi positivi, come il lino tende a sfuggire alte concentrazioni di antibiotici 6,9,14. Un altro svantaggio delle tecniche precedenti trasformazione di lino è la velocità di trasformazione bassi 2,6. Nel protocollo qui descritto, Agrobacterium trasformazione dell&#39;impianto mediata tramite floreale-immersione è stato mostratocomportare un tasso di trasformazione alta per il lino (50 - 60%). Trasformanti sono stati ottenuti da fiori anabbaglianti e raccolti dalle principali e laterali rami. Selezione di trasformanti positivi è stato semplicemente fatto la coltivazione di piante T1 sul suolo e screening loro foglie subito dopo che germogliavano, by-passando l&#39;uso di antibiotici di selezione, un passo in precedenza utilizzato come norma in floreale-dip per altre specie vegetali. Per eseguire l&#39;analisi diretta PCR di foglie, e utilizzando gli appositi primer T-DNA, trasformanti positivi possono essere rapidamente selezionati. Questa tecnica è semplice, economico e di facile esecuzione, ma comporta una frequenza di trasformazione molto superiori a quelli precedentemente riportati per Arabidopsis e altre specie vegetali utilizzando questo metodo 1,10,12. E &#39;anche il più alto tasso di trasformazione segnalato per il lino. Tuttavia, vi sono fasi critiche nelle procedure compresa la selezione dei migliori fase del fiore e la migliore concentrazione di tensioattivo, in modo chel&#39;Agrobacterium può penetrare nelle cellule vegetali senza uccidere gli organi di fiori. Se uno stadio precoce del germoglio viene utilizzato (Figura 2A) con alta concentrazione Silwet-77 di più di 0,05%, il fiore non svilupperà né prevedere semi. Se tardivamente germoglio viene utilizzato (Figura 2C), anche se la trasformazione potrebbe funzionare, si verificherà ad un tasso molto più basso. Risultati simili sono stati ottenuti con Arabidopsis dip floreale trasformazione 1,4. Per questo protocollo, tutte le fasi floreali sono stati testati con differenti Silwet-77 concentrazioni e il miglior palcoscenico era determinato a essere il palcoscenico del germoglio centrale (Figura 2C) con Silwet-77 a 0,05% per la prima immersione, seguita da una seconda immersione a la fase tardiva del germoglio (figura 2C) con un po &#39;ridotta concentrazione Silwet-77 del 0,03%. La trasformazione ha funzionato bene anche con la fase germogliamento precoce (Figura 2A) con una bassa concentrazione Silwet-77 di 0,003%, seguito dauna seconda fase di immersione con germoglio centrale (Figura 2B) a maggiore concentrazione Silwet-77 allo 0,05%. In questo protocollo, altri parametri sono stati tentato di ottimizzare la velocità di trasformazione, ma ha trovato ad avere effetti sul risultato finale. Esempi includono l&#39;estensione del tempo di immersione, dopo che le piante laici al loro fianco e rivestiti in plastica da un giorno a due giorni; utilizzando un OD superiore a 1 per la cultura Agrobacterium, invece di 0,5 - 1; aumentando il tempo di immersione 5 - 15 min invece di 1 - 2 min. Ancora una volta non abbiamo notato alcun effetto sul tasso di trasformazione utilizzando queste strategie. I fattori più efficaci, tuttavia, sono stati trovati a utilizzare piante sane nelle fasi di fiori corretti, e con la migliore concentrazione Silwet-77. Abbiamo notato che due intervalli di immersione, in qualche modo funziona meglio di una volta, anche se una immersione volta funziona anche. Modifiche a questo protocollo può essere raggiunto reducing concentrazione Silwet-77 per il meno 0,003% nel secondo o terzo dipping. Dal Silwet-77 è tossico, troppo alto risultati concentrazione nei fiori sviluppando male, con conseguente non resa in semi. La frequenza immersione può essere ridotta a uno, con il secondo o terzo eventi eliminati se le piante non stanno cercando sano e le gemme non stanno sviluppando bene. Una limitazione importante di questa tecnica è il basso numero di fiori prodotti dal lino, il numero limitato di semi ottenuti da ogni fiore, e la lunga durata di lino. Ci vogliono 6-8 settimane dalla semina di sementi di avere le gemme primarie pronto per la prima immersione e un ulteriore 8 - 10 settimane dopo l&#39;immersione per arrivare alla generazione T1. In totale, una gamma di 5 - è necessaria sei mesi per ottenere la generazione T1. A differenza di altre specie di piante, che fioriscono in qualsiasi momento dell&#39;anno, alcune varietà di lino fiore meglio in momenti specifici dell&#39;anno. Pianificazione così premuroso di questa tecnica è importante. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; In sintesi, i risultati del dip floreale con due diverse varietà di lino: il lino fibra, Stormont Cirrus (plastica reattivo e), e del lino olio, Bethune (stabili e non reattivi), mostrano che Agrobacterium - trasformazione vegetale mediata tramite floreale-dip è un metodo applicabile ed efficiente per la trasformazione di lino e può essere utilizzato per sostituire le tecniche utilizzate in precedenza per la trasformazione di lino. Le modifiche del metodo floreale-dip in questo protocollo saranno applicabili per l&#39;uso con altre specie vegetali e non limitato a lino.

Lino (Linum usitatissimum) è una coltura importante coltivato ampiamente per le sue fibre e oli. Trasformazione del genoma di lino è possibile con tecniche come ferite, infezioni Agrobacterium, e co-coltivazione in coltura tissutale, applicando particelle Biolistic o ultrasuoni ultrasuoni seguita da rigenerazione. Tuttavia, queste tecniche hanno molti svantaggi, tra cui propensione a molti eventi mutazionali e un tempo prolungato per ottenere le linee transgeniche. Alcuni di questi metodi possono anche essere costosi e richiedono la manipolazione abile ed efficiente degli strumenti, con conseguente recupero piantine basse. Ancora più importante, queste tecniche spesso sfociano in un basso tasso di trasformazione 2,6. Agrobacterium trasformazione impianto mediata tramite floreale-dip è un approccio semplice ed efficace per generare piante transgeniche. È stato regolarmente ed usato con successo per molte specie vegetali come Arabidopsis Thalianun 1,4, Medicago truncatula 11, pomodoro 12, 13 grano e mais 10. Tuttavia, non è stato pensato come una tecnica praticabile per la trasformazione di lino a causa di diversi fattori, quali il basso numero di fiori prodotti da lino, il numero limitato di semi ottenuti da ogni fiore, la dimensione del seme grande, e il cappotto spesso, che potrebbe anche essere problematico per tale processo di trasformazione genetica. Inoltre, il segmento selezione della tecnica floreale-dip richiede germinare semi trasformati su un supporto di pianta che contiene un antibiotico, con progenie trasformate distinguono in base alla loro capacità di germogliare e rimanere verde, mentre progenie non trasformati o non germinare o germinare, ma candeggina rapidamente e morire. Nella letteratura, è stato notato che wild-type di lino tende a sfuggire alta concentrazione di selezioni antibiotici, producendo risultati falsi positivi, e rendendo la selezione di progenie T1 basatosulla resistenza agli antibiotici più difficile 6,14. Inoltre, quando una elevata concentrazione di antibiotico è stato aggiunto al mezzo di selezione, il tasso di trasformazione osservato sceso drasticamente 9. In questo protocollo, abbiamo utilizzato Agrobacterium e il metodo floreale-dip per trasformare una linea di lino tessile, Stormont Cirrus (reattivo e plastica), che ha dimostrato di rispondere alle sollecitazioni del contesto alterando suo genoma 3,5. Per superare il problema di fuga antibiotico, abbiamo scelto di fare il test del DNA PCR diretta da foglie T1, invece di selezione aggiungendo l&#39;antibiotico ai media dell&#39;impianto. Abbiamo approfittato della semplice anatomia del lino per tenere traccia dei fiori specifici al momento del trattamento. Questo sistema di monitoraggio ha consentito la selezione di semi di fiori specifici e germinazione sul suolo, senza l&#39;aggiunta di antibiotico. Trasformanti positivi sono stati semplicemente identificati con il test del DNA ottenuto dalle foglie utilizzando il veloce ed efficiente metodo of PCR diretta. I nostri risultati dimostrano che il metodo floreale-dip ha lavorato molto bene in questa linea di lino e sorprendentemente portato ad un tasso di trasformazione molto elevata (50 - 60%), superiori a quelli precedentemente osservati per Arabidopsis thaliana, che è stato segnalato per essere 0,1-1 1%, e anche più elevato rispetto ad altre specie vegetali 10,12. Abbiamo anche provato un&#39;altra varietà di semi di lino (lino olio), Bethune (stabili e non reattivi), e nostri dati preliminari indicano che floreale-dip funziona anche per questa varietà di lino. L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare che Agrobacterium e floreale-dip possono essere utilizzati per generare il lino transgenico. Abbiamo dimostrato che questa tecnica è semplice, poco costoso, e più veloce di altri metodi di trasformazione di lino. Ancora più importante risulta in una velocità di trasformazione molto più alto rispetto agli altri metodi di lino trasformazione 2,6. L&#39;anatomia di Arabidopsis thaliana, che ha molti rami e fiori, maKES difficile distinguere immerso e fiori non tuffato sulla stessa pianta. Pertanto, un gran numero di semi, circa 20.000 semi per piante, devono essere sottoposti a screening per identificare trasformanti positivi 8. Lino, d&#39;altro canto, ha meno filiali (un ramo principale e alcuni rami laterali) e un minor numero di fiori, che producono circa 100 semi per piante, che permette di monitorare i singoli fiori e per selezionare i semi specifici durante il processo di screening. Proponiamo che floreale-dip è un metodo applicabile per trasformare qualsiasi specie affini di lino, un genere di circa 200 specie. Questo metodo fornisce velocità di trasformazione molto più elevato rispetto ad altri metodi di trasformazione di lino. Proponiamo inoltre che la proiezione diretta PCR di T1 foglia DNA è un modo efficace per superare il problema della fuga resistenza agli antibiotici che spesso produce molti falsi positivi. Proiezione diretta PCR può essere applicato ad altre specie vegetali e non è limitata to di lino. La semplice tecnica di inseguimento sementi impiegata in questo protocollo può essere applicato ad altre specie vegetali con ramificazione anatomia simile al lino.

<table><tbody><tr><td>Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety (PL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5&quot; pots</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potting soil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Greenhouse with appropriate light setting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose gel electropheresis equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digital imaging setup</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silwet-77</td><td>LEHLE SEEDS</td><td>VIS-01</td><td>Toxic, wear gloves</td></tr><tr><td>GoTaq Green Master Mix</td><td>Promega</td><td>Part# 9PIM712</td><td></td></tr><tr><td>Terra PCR Direct Polymerase Mix</td><td>Clontech</td><td>639270</td><td></td></tr><tr><td>Binary vector PRI 909</td><td>Takara</td><td>3260</td><td></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens LBA4404 E</td><td>Takara</td><td>9115</td><td></td></tr><tr><td>TOPO TA cloning kit</td><td>Invitrogen</td><td>K4595-01</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electroporator and cuvettes</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2092</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spinner</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic wrap and aluminum foil wrap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>speedSTAR DNA polymerase</td><td>Takara</td><td>RR070A/B</td><td></td></tr><tr><td>QlAquick gel extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN plasmid mini kit</td><td>Qiagen</td><td>12123</td><td></td></tr><tr><td>SalI-HF enzyme</td><td>NEB</td><td>R3138S</td><td></td></tr><tr><td>SacI-HF enzyme</td><td>NEB</td><td>R3156S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligation kit</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>Murashige Skoog</td><td>Sigma</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>A360-500</td><td></td></tr></tbody></table>

floral-dip transformation of flax (linum usitatissimum) to generate transgenic progenies with a high transformation rate

Agrobacterium trasformazione vegetale mediata tramite floreale-dip è una tecnica ampiamente usato nel campo della trasformazione delle piante e &#39;stato segnalato successo per molte specie vegetali. Tuttavia, non è stato riportato il lino (Linum usitatissimum) trasformazione da floreale-dip. L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di stabilire che Agrobacterium e il metodo floreale-dip può essere utilizzato per generare il lino transgenico. Abbiamo dimostrato che questa tecnica è semplice, economico, efficiente e, soprattutto, fornisce una velocità di trasformazione superiori alle attuali metodi disponibili per trasformazione di lino. In sintesi, infiorescenze di lino sono stati immersi in una soluzione di Agrobacterium trasportano un plasmide vettore binario (frammento di T-DNA più la sequenza di inserimento Linum, LIS-1) per 1 - 2 min. Le piante sono state poste su di un lato per 24 ore. Poi, le piante sono stati mantenuti in condizioni normali di crescita fino al trattamento successivo. Le process di immersione è stata ripetuta 2 - 3 volte, con circa 10-14 giorni d&#39;intervallo tra immersione. I semi sono stati raccolti e T1 germinati sul suolo. Dopo circa due settimane, progenie trattati sono stati testati con PCR diretta; 2 - 3 foglie sono stati utilizzati per pianta più appropriati primer T-DNA. Trasformanti positivi sono stati selezionati e coltivati ​​a scadenza. La velocità di trasformazione è stato inaspettatamente elevata, con 50 - 60% dei semi di piante trattate essendo trasformanti positivi. Si tratta di un tasso di trasformazione superiori a quelli riportati per Arabidopsis thaliana e di altre specie di piante, utilizzando floreale-dip trasformazione. È anche la più alta, che è stato segnalato finora, per la trasformazione di lino utilizzando altri metodi per la trasformazione.

Figura 1 - 4 illustrano alcuni dei passaggi all&#39;interno del protocollo. Nelle figure 1 e 2, le foglie intorno ai germogli vengono tagliati infiorescenza esporle alle cellule tumefaciens e le diverse fasi germoglio che sono stati utilizzati per sviluppare il protocollo. La Figura 3 mostra il processo di lino floreale-dip. Figura 4, mostra un esempio di come le principali e laterali rami possono essere etichettati e come fiori individuo può essere rintracciato e identificato. Figura 5 mostra come le progenie T1 possono germinare sul supporto dell&#39;impianto MS e poi trapiantato a terra per la maturità. Figura 6 illustra come Wild- Tipo di lino può sfuggire alte concentrazioni di kanamicina, confermando i risultati precedenti in letteratura 6,9,14. La figura 7 mostra un esempio di amplificazione diretta PCR da trasformanti positivi T1. I fiori T1 sono stati raccolti dal main e germogli laterali di una singola pianta T0. Come si può vedere dalla PCR diretta, 8/12 piante T1 risultati positivi mediante PCR e hanno amplificato le diverse regioni del T-DNA. I nostri primer sono stati progettati anche tra i LIS-1 inserto ei siti di clonaggio multipli (Figura 7b e C). Abbiamo usato primer aggiuntivi dalla pianta vettore binario per amplificare diversi segmenti del T-DNA, come il bordo sinistro e il terminatore NOS (dati non mostrati) o il bordo destro e il sito di clonaggio multiplo (Figura 7D). Primers specifici all&#39;inserto LIS-1 sono stati usati anche in questo protocollo (dati non mostrati). Un elenco di primer è fornita in Tabella 1. Tuttavia, le sequenze di questi primer dipende dalla sequenza della pianta T-DNA vettore binario e l&#39;inserto usato per il floreale-dip. Abbiamo anche notato che non vi era alcuna differenza significativa nel tasso di trasformazione tra i fiori raccolti dalle principali e laterali rami. Figura 1. Tagliare le foglie intorno alle gemme infiorescenza principali per esporli alle cellule Agrobacterim. (A) I boccioli sono coperti da foglie. (B) Foglie sono stati tagliati intorno alle gemme per esporre loro. (C) ingrandita dell&#39;immagine da pianta in (A) dopo il taglio per esporre gemme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig2highres.jpg" /> Figura 2. Le diverse fasi del germoglio che sono stati utilizzati in questo protocollo per determinare il miglior palcoscenico da utilizzare per il tuffo floreale. (A) La fase germogliamento precoce è approssi<html> tamente 2 mm. (B) La fase di bocciolo centrale è di circa 5 mm. (C) La fase di germoglio tardivo è di circa 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig3highres.jpg" /> Figura 3. Il processo di lino floreale-dipping. (A) Le infiorescenze primarie sono immersi nei media infiltrazione contenenti le cellule tumefaciens. (B) ingrandita da (A). (C) Le piante anabbaglianti sono posati fino al giorno successivo, e le filiali anabbaglianti sono coperti di plastica per mantenere alto tasso di umidità. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> jove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig4highres.jpg" /> . Figura 4. Il processo di monitoraggio fiori e sementi collezioni, dalle piante T0 trattato (A) Un esempio di tutto l&#39;impianto con il ramo principale (il ramo più alto al centro) e il lato rami (B - D). An . esempio dei fiori delle diverse branche (E) Un esempio dei semi raccolti da singoli fiori (etichettato come - k). dal ramo principale <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig4highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig5highres.jpg" /> Figura 5. Le piantine T1 sono coltivati ​​senza selezione antibiotica. (A) semi T1 sonogerminato sul supporto dell&#39;impianto MS. (B) trasformanti positivi, come determinato mediante PCR diretta, vengono trapiantate nel terreno e cresciuto fino a scadenza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig6highres.jpg" /> Figura 6. fuga antibiotici, un problema per la selezione T1, è superata dalla proiezione diretta PCR. (A) Wild-tipo semi di lino germinati su supporti pianta MS senza antibiotico. (B) Wild-tipo semi di lino germinati su supporti vegetali ms + concentrazioni crescenti di kanamicina (200 mcg / ml, 600 pg / ml, 1 mg / ml). (C) wild-type semi di lino germinati MS supporti pianta con 2 mg / ml kanamicina. (D) PCR da wild-type lino e T1 piantina utilizzando primer kanamicina, tutto AMPLcato i geni kanamicina (leggende: EZ1: marcatori del DNA, FlaxS, wild-type flaxS, C: controllare non-tuffato ramo, Ma: T1 progenie di fiore &quot;a&quot; raccolti dal ramo principale, Sc, Sd, Se, Sf: T1 progenie di fiori diversi &quot;c, d, e, f&quot; raccolti dal ramo laterale, W:. no-DNA) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig6large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig7highres.jpg" /> Figura 7. Un esempio di successo amplificazioni di progenie T1 utilizzando il metodo diretto PCR. (A) Schema della pianta vettore binario + il clonato LIS-1 inserto. Le frecce blu indicano la posizione di primer PCR utilizzati nello screening PCR diretta (modificato da Takara). (B) PCR con primer M13F + 3 &#39;(C) PCR con primers M13R + 18a <strong&gt; (D) PCR con primer bordo destro (RB) e multiple sito clonazione (MCS) ** Ogni corsia rappresenta T1 da singoli fiori raccolti da C: ramo di controllo (non immersi), M: principale ramo di fiori ag, S: lato ramo di fiori bc &#39;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig7large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Primer Forward fonte sequenza </td><td> sequenza 5&#39;-3 &#39; </td><td> Reverse fonte sequenza di fondo </td><td> Sequenza 5&#39;-3 &#39; </td><td> Ricottura Temprature (° C) </td><td> Tempo Extension (Sec) </td><td> Dimensioni previste (bp) </td></tr><tr><td> M13F (T-DNA) </td><td> CTGCAAGGCG ATTAAGTTGG </td><td> 3 &#39;(LIS-1 inserto) </td><td> GAGGATGGAA GATGAAGAAGG </td><td> 57 </td><td> 40 </td><td> 450 </td></tr><tr><td> 18a (LIS-1 inserto) </td><td> TATTTTAACCC <td> M13R (T-DNA) </td><td> ATTAGGCACC CCAGGCTTTA </td><td> 57 </td><td> 40 </td><td> 520 </td></tr><tr><td> MCS (T-DNA) </td><td> TGGTCATAGC TGTTTCCTGTG </td><td> RB (T-DNA) </td><td> TTTAAACTGA AGGCGGGAAA </td><td> 60 </td><td> 20 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> LB (T-DNA) </td><td> TTTGATGGTG GTTCCGAAAT </td><td> NOS (T-DNA) </td><td> GAATCCTGTT GCCGGTCTT </td><td> 60 </td><td> 30 </td><td> 380 </td></tr><tr><td> NPTII (T-DNA) </td><td> GCGATACCGT AAAGCACGAG </td><td> NTPII (T-DNA) </td><td> GCTCGACGTT GTCACTGAAG </td><td> 65 </td><td> 45 </td><td> 502 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Alcuni dei primer utilizzati per la sperimentazione diretta PCR.

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Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Qui, vi presentiamo un protocollo per trasformare il lino con Agrobacterium trasformazione dell&#39;impianto mediata tramite floreale-dip. Questo protocollo è semplice da eseguire e poco costoso, ma produce un tasso trasformazione superiori alle attuali metodi disponibili per la trasformazione di lino.

Trasformazione Floral-Dip di lino (<em&gt; Linum usitatissimum</em&gt;) Per generare transgenici progenie con una trasformazione Tasso alta

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

floral-dip-transformation-flax-linum-usitatissimum-to-generate

Research

JoVE Journal

Biology

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

29.1K Views.  Case Western Reserve University.  Qui, vi presentiamo un protocollo per trasformare il lino con Agrobacterium trasformazione dell'impianto mediata tramite floreale-dip. Questo protocollo è semplice da eseguire e poco costoso, ma produce un tasso trasformazione superiori alle attuali metodi disponibili per la trasformazione di lino. 

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Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the transgene, as multi-copy integrations are often subjected to gene silencing. The Gateway-compatible binary vector based on bacterial artificial chromosomes (pBIBAC-GW), like other pBIBAC derivatives, allows the insertion of single-copy transgenes with high efficiency. As an improvement to the original pBIBAC, a Gateway cassette has been cloned into pBIBAC-GW, so that the sequences of interest can now be easily incorporated into the vector transfer DNA (T-DNA) by Gateway cloning. Commonly, the transformation with pBIBAC-GW results in an efficiency of 0.2&#8211;0.5%, whereby half of the transgenics carry an intact single-copy integration of the T-DNA. The pBIBAC-GW vectors are available with resistance to Glufosinate-ammonium or DsRed fluorescence in seed coats for selection in plants, and with resistance to kanamycin as a selection in bacteria. Here, a series of protocols is presented that guide the reader through the process of generating transgenic plants using pBIBAC-GW: starting from recombining the sequences of interest into the pBIBAC-GW vector of choice, to plant transformation with Agrobacterium, selection of the transgenics, and testing the plants for intactness and copy number of the inserts using DNA blotting. Attention is given to designing a DNA blotting strategy to recognize single- and multi-copy integrations at single and multiple loci.

Using a pBIBAC-GW binary vector makes generating transgenic plants with intact single-copy insertions, an easy process. Here, a series of protocols is presented that guide the reader through the process of generating transgenic Arabidopsis plants, and testing the plants for intactness and copy number of the inserts.

Generazione di piante transgeniche con inserimenti di copia singola utilizzando il vettore binario BIBAC-GW

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the ...

Ricerca

Genetica

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

Schrenkiella parvula is an extremophyte adapted to various abiotic stresses, including multiple ion toxicity stresses. Despite high-quality genomic resources available to study how plants adapt to environmental stresses, its value as a functional genomics model and tool has been limited by the lack of a feasible transformation system. In this protocol, we report how to generate stable transgenic S. parvula lines using an Agrobacterium-mediated floral-dip method. We modified the transformation protocol used for A. thaliana to account for unique traits of S. parvula, such as an indeterminate flowering habit and a high epicuticular wax content on leaves. Briefly, S. parvula seeds were stratified at 4 &#176;C for five days before planting. Plants were grown at a photoperiod of a 14 h light and 10 h dark and a 130 &#181;mol m-2s-1 light intensity, at 22 &#176;C to 24 &#176;C. Eight to nine week-old plants with multiple inflorescences were selected for transformation. These inflorescences were dipped in an infiltration solution of Agrobacterium tumefaciens GV3101 carrying the pMP90RK plasmid. We performed two rounds of flower dipping with an interval of three to four weeks to increase the transformation efficiency. The T1 seeds were collected and dried for four weeks in a container with desiccants before germination to screen for candidate transformed lines. Resistance to BASTA was used to screen T1 plants. We sprayed the BASTA solution three times with an interval of three days starting at two week-old plants to reduce false positives. A BASTA drop test was performed on surviving individual plants to identify true positive transformants. The transformation efficiency was 0.033%, yielding 3&#8211;4 transgenic plants per 10,000 T1 seeds propagated.

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

Agrobacterium-mediated transformation using a floral-dip method can be successfully employed to create stable transgenic lines of the extremophyte model Schrenkiella parvula. We present a protocol modified from that for Arabidopsis thaliana, considering different growth habits and physiological characteristics of the extremophyte.

Pianta di crescita e trasformazione di Floral-dip mediata da Agrobacterium della Extremophyte Schrenkiella parvula

Schrenkiella parvula is an extremophyte adapted to various abiotic stresses, including multiple ion toxicity stresses. Despite high-quality genomic ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the flexible and efficient GreenGate cloning system with the proven and benchmarked LhGR system (here termed GR-LhG4) for the inducible expression, we have generated a set of transgenic Arabidopsis lines that can drive the expression of an effector cassette in a range of specific cell types in the three main plant meristems. To this end, we chose the previously developed GR-LhG4 system based on a chimeric transcription factor and a cognate pOp-type promoter ensuring tight control over a wide range of expression levels. In addition, to visualize the expression domain where the synthetic transcription factor is active, an ER-localized mTurquoise2 fluorescent reporter under control of the pOp4 or pOp6 promoter is encoded in driver lines. Here, we describe the steps necessary to generate a driver or effector line and demonstrate how cell type specific expression can be induced and followed in the shoot apical meristem, the root apical meristem and the cambium of Arabidopsis. By using several or all driver lines, the context specific effect of expressing one or multiple factors (effectors) under control of the synthetic pOp promoter can be assessed rapidly, for example in F1 plants of a cross between one effector and multiple driver lines. This approach is exemplified by the ectopic expression of VND7, a NAC transcription factor capable of inducing ectopic secondary cell wall deposition in a cell autonomous manner.

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Here, we describe the generation and application of a set of transgenic Arabidopsis thaliana lines enabling inducible, tissue-specific expression in the three main meristems, the shoot apical meristem, the root apical meristem, and the cambium.

Viscoelastica, espressione di tipo specifico delle cellule in Arabidopsis thaliana attraverso LhGR-mediata Trans-attivazione

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS!

Lignin is one of the most prevalent biopolymers on the planet and a major component of lignocellulosic biomass. This phenolic polymer plays a vital structural and protective role in the development and life of higher plants. Although the intricate mechanisms regulating lignification processes in vivo strongly impact the industrial valorization of many plant-derived products, the scientific community still has a long way to go to decipher them. In a simple three-step workflow, the dual labeling protocol presented herein enables bioimaging studies of actively lignifying zones of plant tissues. The first step consists in the metabolic incorporation of two independent chemical reporters, surrogates of the two native monolignols that give rise to lignin H- and G-units. After incorporation into growing lignin polymers, each reporter is then specifically labeled with its own fluorescent probe via a sequential combination of bioorthogonal SPAAC/CuAAC click reactions. Combined with lignin autofluorescence, this approach leads to the generation of three-color localization maps of lignin within plant cell walls by confocal fluorescence microscopy and provides precise spatial information on the presence or absence of active lignification machinery at the scale of plant tissues, cells and different cell wall layers.

BLISS, a dual labeling protocol for studying lignification dynamics, was developed. Using synthetic monolignol reporters and a sequential combination of SPAAC and CuAAC bioorthogonal click reactions, this methodology paves the way to in-depth analysis of the factors that regulate the biogenesis of lignins in planta.

Visualizzazione di lignificazione Dynamics in piante con chimica clicca: doppia etichettatura è beatitudine!

Lignin is one of the most prevalent biopolymers on the planet and a major component of lignocellulosic biomass. This phenolic polymer plays a vital ...

Chimica

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent proteins and generation of fluorescent fusion proteins have been wildly used as an effective tool to directly visualize the protein localization and dynamics in cells. It is especially useful to compare them with well-known organelle markers after co-expression with the protein of interest. Nevertheless, classical approaches for protein co-expression in plants usually involve multiple independent expression plasmids, and therefore have drawbacks that include low co-expression efficiency, expression-level variation, and high time expenditure in genetic crossing and screening. In this study, we describe a robust and novel method for co-expression of multiple chimeric fluorescent proteins in plants. It overcomes the limitations of the conventional methods by using a single expression vector that is composed of multiple semi-independent expressing cassettes. Each protein expression cassette contains its own functional protein expression elements, and therefore it can be flexibly adjusted to meet diverse expression demand. Also, it is easy and convenient to perform the assembly and manipulation of DNA fragments in the expression plasmid by using an optimized one-step reaction without additional digestion and ligation steps. Furthermore, it is fully compatible with current fluorescent protein derived bio-imaging technologies and applications, such as FRET and BiFC. As a validation of the method, we employed this new system to co-express fluorescently fused vacuolar sorting receptor and secretory carrier membrane proteins. The results show that their perspective subcellular localizations are the same as in previous studies by both transient expression and genetic transformation in plants.

We have developed a novel method for co-expressing multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants to overcome the difficulties of conventional methods. It takes advantage of using a single expression plasmid that contains multiple functionally independent protein expressing cassettes to achieve protein co-expression.

Co-espressione delle proteine chimeriche fluorescenti Fusion Multiple in modo efficiente nelle piante

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

CcCIPK14 Gene Function Analysis to Illuminate the Efficient Root Transgenic System

An efficient and stable transformation system is fundamental for gene function study and molecular breeding of plants. Here, we describe the use of an Agrobacterium rhizogenes mediated transformation system on pigeon pea. The stem is infected with A. rhizogenes carrying a binary vector, which induced callus after 7 days and adventitious roots 14 days later. The generated transgenic hairy root was identified by morphological analysis and a GFP reporter gene.To further illustrate the application range of this system, CcCIPK14 (Calcineurin B-like protein-interacting protein kinases) was transformed into pigeon pea using this transformation method. The transgenic plants were treated with jasmonic acid (JA) and abscisic acid (ABA), respectively, for the purpose of testing whether CcCIPK14 responds to those hormones. The results demonstrated that (1) exogenous hormones could significantly upregulate the expression levelof CcCIPK14, especially in CcCIPK14 over-expression (OE) plants; (2) the content of Genistein in CcCIPK14-OE lines was significantly higher than the control; (3) the expression level of two downstream key flavonoid synthase genes, CcHIDH1 and CcHIDH2, were up-regulated in the CcCIPK14-OE lines; and (4) the hairy root transgenic system can be used to study metabolically functional genes in non-model plants.

CcCIPK14 Gene Function Analysis to Illuminate the Efficient Root Transgenic System

Here we present an efficient and stable transformation system for the functional analysis of the CcCIPK14 gene as an example, providing a technical basis for studying the metabolism of non-model plants.

An efficient and stable transformation system is fundamental for gene function study and molecular breeding of plants. Here, we describe the use of an ...

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

Floreale-dip Trasformazione Arabidopsis thaliana Per esaminare PTSO2:: β-glucuronidasi Reporter espressione genica

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Biologia

Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also associated with these genomic changes are heritable phenotypic variations 1,2. The flax variety Stormont Cirrus (Pl) when grown under three different nutrient conditions can either remain inducible (under the control conditions), or become stably modified to either the large or small genotroph by growth under high or low nutrient conditions respectively. The lines resulting from the initial growth under each of these conditions appear to grow better when grown under the same conditions in subsequent generations, notably the Pl line grows best under the control treatment indicating that the plants growing under both the high and low nutrients are under stress. One of the genomic changes that are associated with the induction of heritable changes is the appearance of an insertion element (LIS-1) 3, 4 while the plants are growing under the nutrient stress. With respect to this insertion event, the flax variety Stormont Cirrus (Pl) when grown under three different nutrient conditions can either remain unchanged (under the control conditions), have the insertion appear in all the plants (under low nutrients) and have this transmitted to the next generation, or have the insertion (or parts of it) appear but not be transmitted through generations (under high nutrients) 4. The frequency of the appearance of this insertion indicates that it is under positive selection, which is also consistent with the growth response in subsequent generations. Leaves or meristems harvested at various stages of growth are used for DNA and RNA isolation. The RNA is used to identify variation in expression associated with the various growth environments and/or t he presence/absence of LIS-1. The isolated DNA is used to identify those plants in which the insertion has occurred.

Growing some flax varieties under nutrient stress results in genomic variation within a subset of the genome and phenotypic variation. A complex insertion at a specific site is associated with growth under various nutrient regimes and with changes in gene expression around this site.

Indotta da fattori ambientali modifiche ereditabili nella Lino

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also ...

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic pest management strategies. The most used transposable element in insect transformation is piggyBac, and piggyBac-based germline transformation has been successfully conducted in model insects. However, it is still challenging to employ this technology in non-model insects that include agricultural pests. This paper reports on germline transformation of a global agricultural pest, the fall armyworm (FAW), Spodoptera frugiperda, using the hyperactive piggyBac transposase (hyPBase).
In this work, the hyPBase mRNA was produced and used in place of helper plasmid in embryo microinjections. This change led to the successful generation of transgenic FAW. Furthermore, the methods of screening transgenic animals, PCR-based rapid detection of transgene insertion, and thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR)-based determination of the integration site, are also described. Thus, this paper presents a protocol to produce transgenic FAW, which will facilitate piggyBac-based transgenesis in FAW and other lepidopteran insects.

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Successful germline transformation in the fall armyworm, Spodoptera frugiperda, was achieved using mRNA of hyperactive piggyBac transposase.

Piggy iperattivoTrasponsi-mediata dalla trasposizione della linea germinale nel verme dell'esercito autunnale, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic ...

Induzione e rigenerazione delle radici pelose mediate da agrobatteri nelle piante

Hairy Root Transformation and Regeneration in Arabidopsis thaliana and Brassica napus

Hairy root transformation represents a versatile tool for plant biotechnology in various species. Infection by an Agrobacterium strain carrying a Root-inducing (Ri) plasmid induces the formation of hairy roots at the wounding site after the transfer of T-DNA from the Ri plasmid into the plant genome. The protocol describes in detail the procedure of the injection-based hairy root induction in Brassica napus DH12075 and Arabidopsis thaliana Col-0. The hairy roots may be used to analyze a transgene of interest or processed for the generation of transgenic plants. Regeneration medium containing cytokinin 6-benzylaminopurine (5 mg/L) and auxin 1-naphthaleneacetic acid (8 mg/L) successfully elicits shoot formation in both species. The protocol covers the genotyping and selection of regenerants and T1 plants to obtain plants carrying a transgene of interest and free of T-DNA from the Ri plasmid. An alternative process leading to the formation of a composite plant is also depicted. In this case, hairy roots are kept on the shoot (instead of the natural roots), which enables the study of a transgene in hairy root cultures in the context of the whole plant.

Autore in primo piano: Ottimizzazione dei protocolli di trasformazione basati sulle radici pelose per una maggiore efficienza nelle Brassicaceae

The protocol describes hairy root induction using Arabidopsis primary inflorescence stems and Brassica napus hypocotyls. The hairy roots can be cultured and used as explants to regenerate transgenic plants.

Trasformazione Floral-Dip di lino (

Riepilogo

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Generazione di piante transgeniche con inserimenti di copia singola utilizzando il vettore binario BIBAC-GW

Pianta di crescita e trasformazione di Floral-dip mediata da Agrobacterium della Extremophyte Schrenkiella parvula

Viscoelastica, espressione di tipo specifico delle cellule in Arabidopsis thaliana attraverso LhGR-mediata Trans-attivazione

Visualizzazione di lignificazione Dynamics in piante con chimica clicca: doppia etichettatura è beatitudine!

Co-espressione delle proteine chimeriche fluorescenti Fusion Multiple in modo efficiente nelle piante

CcCIPK14 Gene Function Analysis to Illuminate the Efficient Root Transgenic System

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Indotta da fattori ambientali modifiche ereditabili nella Lino

Piggy iperattivoTrasponsi-mediata dalla trasposizione della linea germinale nel verme dell'esercito autunnale, Spodoptera frugiperda

Trasformazione e rigenerazione delle radici pelose in Arabidopsis thaliana e Brassica napus