Bu in vitro görüntüleme tahlili, farklı hücre tedavilerinin veya farklı genotiplerin mikroglial fagositoz üzerindeki etkisini ölçmeyi mümkün kılar. Nörodejeneratif hastalıkla ilgili iki hücre tipi kullanarak, büyük yüksek içerikli görüntüleme ekranları tarafından kolayca ve ucuza ölçeklendirilebilecek şekilde hazırlanan fagositik kargo için ölü nöroblastom hücreleri kullanıyoruz. Sınıf 2 biyolojik güvenlik kabininde, ortamı aspire ederek SH-SY5Y'leri ayrıştırın.
4 ml hücre ayrıştırma tamponu ekleyin ve tamponu hemen çıkarın, böylece hücreleri kaplayan ince bir film olarak 1 ml'den az kalır. 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 2 ila 3 dakika kuluçkaya yatır. Sonra 10 ml HBSS'de T-75 şişesine.
Ve SH-SY5Y'leri 15 ml konik santrifüj tüpüne pipetle. 5 dakika boyunca 400xG'de santrifüj. Süpernatantı aspire edin ve hücreleri 2 ml fenol kırmızı içermeyen HEPES tamponlu ortamda yeniden askıya alın, sabitlemeden önce kümeleri parçaladığından emin olun.
Tüpe 2 ml% 4 güç formaldehit ekleyerek ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca ara sıra hafif ajitasyonla inkübe ederek hücreleri sabitleyin. Tüpe 10 ml HBSS ekleyin. Ardından, 7 dakika boyunca 1200xG'de santrifüj.
Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini 2 ml fenol kırmızı içermeyen HEPES tamponlu ortamda yeniden askıya alın. 1 milyon HS-SY5Y hücreini 2 ml düşük protein bağlayıcı bir tüpe sayın ve çıkarın. Fenol kırmızı içermeyen HEPES tamponlu ortam ile toplam hacmi 300 ila 500 mikrolitreye getirin.
Daha sonra tüpü 37 santigrat derecelik bir su banyosunda kısa bir süre ısıtın. pH'a duyarlı kırmızı floresan boya STP esterini üreticinin talimatlarına göre yeniden inşa edin. Daha sonra milyon SH-SY5Y hücresi başına 12,5 mikrogram boya ekleyin.
Tüpü sallayarak hafifçe karıştırın. Ve tüpü oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inküb tüpe bırakın, ışıktan kornun. 7 dakika ve 4 santigrat derece için 1200xG'de 1 ml HBSS ve santrifüj ekleyin.
Üstnatant atın. Ve 2 ml HBSS ile yıkayın. Fenol kırmızı içermeyen makrofaj ortamlarındaki hücre peletini ml başına 0,2 ila 1,2 milyon hücre konsantrasyonuna yeniden askıya alın, böylece 50 mikrolitre 10.000 ila 60.000 hücre içerir.
Biyolojik bir güvenlik kabininde, makrofaj ortamlarında derin kırmızı floresan hücre permeant süksinimsal ester-reaktif boya çözeltisi hazırlayın. Hoechst 33342'yi ekleyin ve çalışma sokucuyu bir su banyosunda 37 santigrat dereceye ısıtın. Hücre üstnatantını çok kanallı bir pipetle steril bir rezervuara pipetle keserek iPSC makrofaj ortamını nazikçe epire edin.
Çok kanallı pipet kullanarak iPSC makrofajlarına boya çözeltisinin kuyusu başına 70 mikrolitre ekleyin. 37 santigrat derecede 1 saat kuluçkaya yatır ve %5 karbondioksit. Fenol kırmızı içermeyen makrofaj ortamlarında deneysel tedavileri onarın.
Kuluçkadan sonra, iPSC makrofaj ortamını çok kanallı bir pipetle çok nazikçe epire edin ve kuyu başına 100 mikrolitre HBSS ekleyin. HBSS'yi hemen hafif pipetleme ile çıkarın. Daha sonra 100 mikrolitre fenol kırmızı içermeyen makrofaj ortamı ve ayrı kuyularda deneysel tedaviler ekleyin.
37 santigrat derecede 10 dakika ila 1 saat kuluçkaya yatır ve% 5 karbondioksit. Sıvının kenarındaki her kuyunun yanlarından kuyu başına 50 mikrolitre SH-SY5Y eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın. Daha sonra 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve 3 ila 5 saat boyunca% 5 karbondioksit.
Fagositoz inkübasyonundan sonra, çok kanallı bir pipetle pipetle pipetleme yaparak hücre süpernatantlarını hafifçe aspire edin ve atın. 100 mikrolitre PBS ile bir kez yıkayın. Daha sonra% 2 güç formaldehit 100 mikrolitre ekleyerek ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırarak hücreleri sabitleyin.
Kuyuları aspire edin ve 100 mikrolitre PBS ekleyin. Yüksek içerikli mikroskopla doğrudan görüntülemeye devam edin veya plaka sızdırmazlık ve folyo ile örtün ve plakayı gerekli olana kadar 4 santigrat derecede saklayın. Yüksek içerikli görüntüleme mikroskobu açın ve görüntü yakalama yazılımını açın.
Ekranın üst kısmındaki LOAD"i tıklayarak test plakasını mikroskopa yükleyin. KUR"sekmesini seçin. Sol üstteki açılır menülerde uygun plaka türünü seçin.
Otomatik odaklama seçeneği:iki tepe"Amaç:40x Su, NA 1.1"Konfokal"modu ve Binning 1. Ayarlar menüsünden kullanmadan önce 40x Su hedefini yıkayın. Kanal seçim kutusunda, DAPI, Alexa 647 ve Alexa 568 kanallarını eklemek için artı simgesini kullanın.
Bunları bir mikrometrenin tek bir düzlemini ölçecek şekilde ayarlayın. Test plakasının boyama verimliliği için zaman ve güç ayarlarını optimize edin. Kanalları ayırmak için kanal sırasına tıklayarak kanalların aynı anda ölçülmediğine emin olun.
Gezinti altında ve düzeni tanımlayın, ölçüm kuyularını seçin ve kuyu başına 9 ila 12 alan seçin. Kurulum sırasında, plaka haritasında temsili bir alana tıklayın. Ve boyamanın mevcut olduğundan ve kanal uzaklığını ayarlayarak görüntülerin odaklandığından emin olmak için her ölçüm kanalını sırayla kontrol edin.
Verileri uzaktan analiz için bir sunucuya yüklemek için çevrimiçi işler"kutusunu ve ilgili ekran adını tıklatın. Kaydet" düğmesine tıklayarak test protokolünü kaydedin ve üstteki Denemeyi çalıştır sekmesine tıklayın. Deney plakasını adlandırın, sonra başla'ya tıklayın "Canlı bir hücre zamanı fagositoz yaşar tahlil, 10 ile gösterdi, Kuyu başına 000 SH-SY5Ys, hücre başına fagositoz parçacıklarının sayısı zamanla doğrusal olarak arttı ve Cytochalasin D. tarafından yaklaşık% 50 oranında inhibe edildi Kuyu başına daha yüksek miktarda SH-SY5Ys ile, fagositoz muhtemelen iPSC'nin zayıf segmentasyonu nedeniyle zayıf doğrusallık gösterdi, makrofajlar ve daha kalabalık bir görüş alanında SH-SY5Y'ler.
Aşağıdaki sonuçlar, fagositozun bu temsili görüntüsü de dahil olmak üzere sabit hücreli yüksek içerikli bir görüntüleme yapılarak elde edilmiştir. SH-SY5Y miktarının arttırılması, hücre başına daha fazla sayıda fagositozlu parçacıkla sonuçlandı. Fagositoz tahlilleri, fagositozun çeşitli inhibitörleri kullanılarak doğrulandı.
Sitochalasin D ve Jasplakinolide sırasıyla yüzde 91 ve 90 oranında fagositozu önemli ölçüde inhibe etti. Ve Bafilomycin A1, fagositozdan önce 1 saat önceden inkübe edildiğinde fagositozu% 31 oranında önemli ölçüde azalttı. Rekombinant Annexin 5'in eklenmesi, SH-SY5Y ilavesinden hemen önce kuyulara eklendiğinde fagositozu önemli ölçüde azalttı.
Sh-SY5Y'ler düzeltildi Floresan Annexin 5 probu kullanarak Fosfatidiylserine maruz bıraktığımız doğrulandı. Canlı SH-SY5Y'ler Ekin 5 boyama için negatifti. 1 ila 5 saat arasında çeşitli fagositoz süresi, fagositik kargonun kademeli ilavesi kullanılarak test edildi.
Bu protocall'un genel uzunluğu, fagositik kargonun hazırlanması ve iPSC makrofajlarının paralel olarak boyanmasına bağlı olarak kısaltılabilir. Bunu yapmak istiyorsanız, zamanlamaları önceden çalışın ve gelecekteki adımlara çözümler hazırlamak için kuluçkalarınızı kullanın.
