Bu protokol, araştırmacıların canlı hücrelerde ekzo ve endositozu izlemesine olanak tanıyan, hücre zarlarına özgü, pH'a duyarlı yeni bir floresan lipid probunun karakterizasyonunu ve uygulamasını açıklar. Membran proteini ile ilgili önceki raporların çoğu, dolaylı olan pH'a duyarlı yeşil floresan proteinine dayanmaktadır. Bir lipid taklitçisi olarak ND6, hücre zarına entegre olur ve böylece lipid zarı trafiğini aslına uygun olarak rapor eder.
ND6 probu sadece biyolojik membran ortamına gömüldüğünde floresan olur. Bu probun floresan yoğunluğu, piperazin kafa grubunun protonasyonu ve protondan arındırılması ile ilişkilidir. Böylece, daha düşük pH'ta çok daha güçlü floresan verir.
Ekzositoz ve endositoz, birçok sinyal molekülünün salgılanmasının ve alınmasının altında yatan her yerde bulunan süreçlerdir. Bu nedenle, ND6, hücre biyolojisi ve biyomedikal bilimlerdeki bazı temel soruları incelemek için kullanılabilir. Prosedürü gösterenler, laboratuvarımdan öğrenciler olan Haley, Oliver ve Jonathan olacak.
Canlı hücre floresan görüntüleme için sıcaklık kontrolüne ve çözelti giriş çıkışına izin veren bir görüntüleme odası hazırlayarak başlayın. Perfüzyon solüsyonlarını değiştirmek ve görüntüleme sırasında tanımlanmış zaman noktalarında elektrik uyarıcısı vermek için programlanabilir bir cihaz kurun. Uygun miktarda ND6 tartın.
Dimetil sülfoksit içinde çözün ve oda sıcaklığında çözünmesine izin verin. Sonra çözeltiyi kısaca sonikleştirin. Büyük boya agregalarını çıkarmak için 0,22 mikrometrelik bir filtre kullanarak ham stok çözeltisini filtreleyin.
Konvansiyonel veya mikro hacimli bir spektrofotometre kullanarak, 405 nanometrede boya konsantrasyonunu belirleyin. Uygulamadan önce, banyo çözeltisini kullanarak stok çözeltisini mililitre başına bir miligram konsantrasyona seyreltin. Stok çözeltisini karanlıkta oda sıcaklığında tutun.
Mikrolitre başına bir mikrogramlık son konsantrasyonda kültür ortamına ND6 stok çözeltisi ekleyin ve endozomlar gibi endositozlu membran bölmelerini her yerde etiketlemek için inkübe edin. Sinaptik vezikül etiketlemesinin kapsamını azaltmak için, spontan nöronal aktiviteyi farmakolojik olarak baskılayın. Sinaptik vezikülleri el yazmasında tarif edildiği gibi seçici olarak etiketledikten sonra, hücreleri içeren kapak fişini görüntüleme odasına monte edin.
Sıcaklık sensörünü, perfüzyon girişini ve vakum ucunu görüntüleme odasına bağlayın. Perfüzyon hızını saniyede yaklaşık 0.2 mililitreye ayarlayın ve kültürdeki aşırı ND6'yı gidermek için NBQX ve DAP5 içeren önceden ısıtılmış normal tiroz çözeltisinin perfüzyonunu başlatın. Odağı ayarlayın ve bağlı nöritler taşıyan sağlıklı ve iyi yayılmış nöronları içeren uygun görüş alanını bulun.
Çözülmemiş Dikolloidler içeren alanlardan kaçınmak. En iyi görüntüleme ayarlarını belirlemek için ND6 yüklü hücreleri farklı pozlama süreleriyle görüntülemeyi deneyin. Metin yazısındaki bilgileri kullanarak stimülasyon ve perfüzyon protokolünü, çerçeve aralığını ve toplam süreyi ayarlayın.
Senkronize stimülasyon ve perfüzyon eşliğinde görüntü alımını başlatın. Görüntüleme sırasında stimülasyonu ve çözelti değişimini izleyin. Görüntüleme bittikten sonra perfüzyonu durdurun.
Kapak fişini çıkarın ve bir sonraki deneme için görüntüleme odasını temizleyin. Tüm görüntü dosyalarını yedekleyin ve elektronik bir kopyasını alın. Veri ayıklama için analiz programını seçin ve açın.
Bir görüntü yığınını açın veya analiz programına aktarın. İkili bir maske oluşturduktan sonra, hücre zarlarına, endozomlara, lizozomlara veya sinaptik butonlara karşılık gelen ilgilenilen bölgeleri veya ROI'leri istemek için uygun alan boyutu ve dairesellik ile parçacığı analiz etme işlevini kullanın. Görüş alanı içindeki hücresiz bölgelerde dört arka plan ROI'si seçin.
Ardından seçilen tüm ROI'leri kaydedin. ND6 zaman atlamalı görüntü yığınlarındaki tüm kareleri hizalayın. İlk görüntüyü referans olarak ayarlayın ve geri kalanını katı kayıt kullanarak hizalayın, bu da XY kaymasından kaynaklanan artefaktları azaltacaktır.
Ardından, hizalanmış görüntü yığınlarını kaydedin. Kaydedilen ROI'leri hizalanmış ND6 görüntü yığınlarına uygulayın. Görüntü yığınının her karesindeki her ROI için ND6 floresansının ortalama piksel yoğunluklarını ölçün.
Ardından sonuçları istatistiksel analiz için dışa aktarın. Seçilen tüm ROI'lerden çıkarılacak olan temel gürültüyü elde etmek için arka plan ROI'lerinin ortalama yoğunluğunu hesaplayın. Normalizasyon için %100 olarak tanımlanan maksimum floresan yoğunluğunu elde etmek için pH 5.5 tiroz çözeltisinin uygulanması sırasında seçilen her ROI için en yüksek üç ortalama yoğunluğun ortalamasını alın.
Normalizasyon için %0 olarak tanımlanan minimum floresan yoğunluğunu ayarlamak için 50 milimolar amonyum klorür uygulaması sırasında seçilen her ROI için en düşük üç ortalama yoğunluğun ortalamasını alın. Her ROI için kendi %0 ve %100 yoğunluklarına göre bağıl floresan değişikliklerini hesaplayın. Bireysel ROI verilerinden ortalama floresan değişikliklerini, değişiklik kinetiğini ve diğer değerleri veya grafikleri türetin.
Nöronal süreçler boyunca parlak yeşil floresan punkta, nöronal hücrelere ND6 yüklendikten sonra görülebildi. ND6 ve FM464 floresan yoğunlukları arasında güçlü bir korelasyon da ND6 ile sinaptik vezikül boyamasını önerdi. Hem elektrik stimülasyonuna hem de yüksek potasyum stimülasyonuna yanıt olarak ND6 floresansında bir azalma gözlendi, bu da ND6'nın sinaptik vezikül zarında bulunduğunu ve salım sırasında sinaptik vezikül lümeninin nötralize olduğunu düşündürdü.
Kapsamlı bir elektrik stimülasyonu altında, M beta CD tedavisi, ND görüntüleme ile ölçülen sinaptik vezikül salınımını ve alımını önemli ölçüde azalttı, bu da membran kolesterolün sinaptik vezikül ekzositozunu ve endositozu kolaylaştırdığını düşündürdü. Baf A1, alınan sinaptik veziküllerin yeniden asitlenmesini akut olarak bloke ederek stimülasyondan sonra ND6 floresan geri kazanımını önledi. Floresan mikroskobunun temel anlayışı bir zorunluluktur.
Canlı hücre görüntülemeyi desteklemek için fizyolojik koşulların dikkatli bir şekilde planlanması çok önemlidir. ND stok çözeltisinin konsantrasyonunu kesin olarak belirlemek çok önemlidir. Mümkünse, her kullanımdan önce stok çözelti konsantrasyonunu yeniden ölçün.
Fotoğraf ağartmasını ve prob ayrışmasını önlemek için lütfen doğrudan güneş ışığından uzak tutun.
