We thank the kind donations of AAV5 sample by Mavis Agbandje-McKenna and Antonette Bennett, and of TMV sample by Ruben Diaz. This work is supported by American Heart Association grant 14GRNT19660003 and VCU startup funds to MS.

1. Cryo-tutucu Hazırlama ve Bakım NOT: Kuru pompa istasyonu, turbo pompa istasyonu ve bir veya daha fazla soğuk sahne kontrolörleri oluşan, öncelikle üç amaçlar için kullanılır: a) kullanılmadıkları zaman cryo sahipleri saklamak için güvenli bir yerdir. sahipleri saklamak için doğru yolu vakum altında istasyonunda onları terk etmektir. b) Sıvı azot Dewar ve maruz kriyo tutucunun ucundan kaldırıldığında oluşan don ve nem oluşumunu buharlaştırılması için; Bu ısınma döngüsü ile elde edilir. c) zeolit ​​kurutucu yeniden oluşturmak için ve cryoholder Dewars yüksek vakum elde etmek. Bu kriyo elektron mikroskopisi yaparken bir sabit sıcaklık tutulması için gereklidir. <ol><li> Isınma Döngüsü. <ol><li> Pompalama istasyonu pompa limanlarından birine cryo tutucu yerleştirin. Sahibinin vakum valfi altında metal çıkışına tahliye tüplerden birini bağla. Yapmakistasyon (V1, V2, V3 ve) ve cryo tutucu tüm vanalar kapalı olduğundan emin olun. </li><li> Soğuk sahne denetleyicisi açın ve kontrol kablosu aracılığıyla sahibine bağlayın. Turbo pompa istasyonu güç anahtarını açın. </li><li> Soğuk sahne denetleyicisi Isınma döngü seçeneği başlatın. Turbo pompa istasyonu vakum 10 -3 Torr&#39;a veya daha okuduğunda, kelebek vana V2 açmak vakum stabilize kadar bekleyin ve ardından kelebek vana V1 açın. </li><li> Tutucu sıcaklık 20 ° C&#39;nin üzerinde stabil olana kadar yaklaşık 30 dakika ısınma döngüsü çalıştırın. Yakın V1 ve ardından döngüsünü durdurun. </li></ol></li><li> Zeolit ​​döngüsü. 4 saat ve O Arasında Zeolit ​​Döngüsü çalıştırın / N cryoEM Oturum öncesinde ve Hafta kez eğer Değil Kullanımı. <ol><li> Zeolit ​​döngüsü seçeneği başlatın ve 1-2 x 10 -4 Torr aralığında, iyi bir vakum ulaşmak için gerekli zamanı seçin, ve böylece uzun bekleme süresi. Ne zaman vakum 10 ulaşır -3Torr, V3 Dewar tahliye vanasını açın. pompa istasyonu daha sonra sahibine hattı tahliye edecek; Vakum stabilize kadar bekleyin. </li><li> Cryo tutucu vanayı açın. Döngüsü tamamlandığında, onlar açıldı edildiği ters sırayla vanalarını kapatın: vana tutucu, daha sonra V3, V2 ve nihayet V1. Turbo pompa istasyonu ve soğuk sahne denetleyicisi kapatın ve soğuk sahne denetleyicisi ve turbo pompa istasyonundan cryo tutucu ayırın. </li></ol></li></ol> 2. Izgara Hazırlık <ol><li> Temizleme. Not: Ticari Delikli tablosunu kullanarak, bu üretim işleminde kullanılacak olan herhangi bir artık polimerin çıkarılması için, kullanımdan önce bunları temizlemek için tavsiye edilir. Alt yayılmış filtre kağıdı 5 kat, cam bir Petri tabağına yapın. <ol><li> Delikli karbon tarafı yukarı bakacak şekilde filtre kağıdı üzerinde ızgaraları yerleştirin. </li><li> Bir cam Pasteur pipeti kullanarak, o birkaç damla ile kağıt ıslakızgaraları etrafında f kloroform sadece yüzen başlayana kadar. </li><li> Bir davlumbaz Ç / N biraz açık kapak ile Petri örtün. </li></ol></li><li> NOT: Buz tabakası doğrudan holey karbon ızgara küçük delikler arasında oluşturulabilir ince karbon desteği (2,2-2,3 adımları) ihmal edilebilir. <ol><li> Bir çift cımbız kullanarak, iki yeni yüzeyler ortaya çıkarmak için mika bir parça bölmektedir. Bir Petri kabındaki beyaz bir kâğıt parçası üzerinde mika yüzü yukarı yeni maruz yüzeyleri yerleştirin. </li><li> Bir karbon evaporatör çan kavanoza Petri kabı yerleştirin. Vakum altında 2 x 10 -6 Torr kadar pompa aşağı dizisini başlatın. C çubuk yüzeyi üzerinde herhangi bir istenmeyen maddeyi buharlaştırmak için, kapalı bir Petri kabı ile bir ön-buharlaştırma gerçekleştirin. Sonra çan kavanoz hava ve Petri kabı kapağı çıkarın. </li><li> Vakum karbon ince bir tabaka (~ 5 nm) ile mika 10 -6 Torr ve ceket altına kadar pompa aşağı dizisi gerçekleştirin. Karbon sırasında göz koruması kullanınbuharlaşma. Mika yaprak altına olmuştu kağıt üzerinde ortaya çıkan karanlık karbon film kalınlığını izleyin. </li></ol></li><li> TEM Grid İnce Carbon aktarın. <ol><li> Kaplanmış mika, 0.5 x 1 cm parça kesin ve süzüldü, iyonu giderilmiş su, düz yüzey üzerine karbonun yüzer. Düz bir su yüzeyi elde etmek için optik lens kağıdı kullanın. Cımbız kullanarak, yüzen karbon tabakasının üst yüzeyi ile temas halinde ızgara holey karbon yan koymak ve onu almak. </li><li> Izgaraları yeterli sayıda hazırlanır kadar tekrarlayın 2.3.1 ve 2.3.2 adımları. </li></ol></li><li> Deşarj Glow. NOT: ışıltılı tahliye hidrofil içine ızgaraları doğal hidrofobik karbon kaplama tabakası dönüştürür. Bu adım isteğe bağlıdır. <ol><li> Karbon yan Parafilm ile kaplı 7.5 x 2.5 cm cam slayt yukarı bakacak şekilde yerleştirin ızgaraları. Kızaran deşarj ekipman odasına yerleştirin ve odasına kapatın. </li><li> Pompa25 mA 20 saniye ve 7 x 10 -2 mbar için çan kavanoz ve parlaklık deşarj. NOT: Bir açık mor parlaklık görünür hale bu süre zarfında. Aksi takdirde, onlar kızdırma tekrar taburcu olması gerekir, ızgaraları ile cam slayt çıkarın ve 1 saat içinde bunları kullanmak. </li></ol></li></ol> 3. Numune Dalma-dondurma NOT: Sıvı azot ve etan sıçramalarına karşı korumak için bu aleti kullanırken koruyucu gözlük ve uygun ayakkabı kullanın. <ol><li> Dalma-dondurma aparatı açın. Damıtılmış suyla nemlendirici doldurun. Istenen sıcaklık, bağıl nem ve leke kez dalma koşulları, leke kuvvet ve tutma süresi (22 ° C,% 95, 2 saniye, burada sunulan örnek 2 ve 40 sn). Yeni lekeleme filtre kağıdı yerleştirin. </li><li> Stabilite (yaklaşık 10 dakika) elde edilene kadar sıvı nitrojen ile dış hazne doldurarak etan kap soğutun. Sıvı azot Boilin durduğundag, iç odasında etan tankından gelen tüp ucu yerleştirin ve çok yavaş vanayı açın. Iç hazne içinde etan sıvılaştırılması ve üstten 1 mm kadar doldurun. Etan dondurma kaçının. DİKKAT: etan, son derece yanıcı ve patlayıcıdır. </li><li> Emin cımbız dalma dondurma aygıtı içinde hizalanır olun. </li><li> Nem açın. Cımbız üzerine bir ızgara yerleştirin ve holey ızgara karbon yüzeyine (donuk tarafı) üzerine numunenin 3-5 ul yükleyin. Örnek ızgarasına adsorbe ve ince bir sıvı tabakası elde etmek blot gerçekleştirmek için bekleyin. </li><li> Sıvı etan içine dalan tarafından ızgara Flash dondurma. Sürekli cımbız tutan sıvı etan gelen cımbız-ızgara aksamını çıkarın, ve sıvı azot ile dış odasına transfer. Sıvı azot içinde dalmış küçük ızgara kutusuna ızgara aktarın. Ya depolama tankına transferi sırasında sıvı azot içinde her zaman vitrifiye örnek tutmak emin olunya cryo sahibine. NOT: Izgara kutuları en az 1 yıl süreyle büyük bir kapasite (35-50 L) sıvı azot Dewar saklanabilir. Uygun şekilde saklanması için iki delinmiş üstünde delikler ve termosun ağzından çekilebilir olan kapağa bağlı bir olta bir 50 ml Falcon tüpü içine yerleştirilmiş olabilir. </li></ol> 4. TEM Cryo-grid transfer <ol><li> Cryo transfer istasyonu içine cryo tutucu yerleştirin. Yerleştirilmesi sırasında sahibinin ucu zarar vermemeye özen gösterin. Herhangi bir optik lens kağıdı ile kaldırmak varsa, çubuk ve bir büyüteç kullanarak cryo sahibinin O-ring küçük liflerin varlığı ve toz kontrol edin. </li><li> Cryo sahibinin Dewar ve sıvı azot ile iş istasyonu gemi doldurun. Iş istasyonu ile birlikte geliyor tuzağa huni kullanılarak sıvı azot dökmekten kaçının. </li><li> Sıcaklığını izlemek, ve sıvı azot &amp; # eklemeye devam soğuk sahne denetleyicisi cryo tutucu bağlayın160; sıcaklık yaklaşık -194 ° C&#39;de stabilize kadar. Sıvı azot düzeyi iş istasyonu gemi ve cryo tutucu Dewar hem vakum mühür seviyesinin altında olduğundan emin olun. Izgara cımbız, klip halka ve iş istasyonunda klip halka aracının künt ucunu ön-serin. Ayrıca, büyük cımbız bir dizi ve sıvı azot ile doldurulan bir termosun bir tornavida ön soğutulur. </li><li> Hızla büyük cımbız kullanarak iş istasyonu sıvı azot dondurulmuş hidratlı ızgaraları içeren cryo ızgara kutusunu aktarın. , Tornavida ile cryo grid kutusunu açın dondurulmuş hidratlı ızgara almak ve numune tutucu yuvasına yerleştirin. </li><li> Izgara üstüne klip halka yerleştirin ve sıkıca yerine oturana kadar klip halka aracı künt uçlu basın yavaşça. Cryo-deklanşör kapatın. Iş istasyonundan araçları ve cryo ızgara kutusunu çıkarın. </li><li> Mini amacıyla mikroskop konsoluna tutucu ve ızgara ile tüm iş istasyonu taşıyınoda havasında ızgara transfer süresi rımızı azamiye. </li><li> Önceden doldurulmuş ve en az 20 dakika boyunca soğutulur olan sıvı azot ile TEM anti contaminator kapalı üst. -60 ° mikroskop sahne Ön eğin. Not: tutucu havalandırma süzgeci içine yerleştirildiğinde, bu sıvı azot kaybını en aza indirir. </li><li> Mikroskop öncesi pompa hava kilidi döngüsü başlar. (Bir FEG TEM özellikle varsa) elektron tabancası valf kapalı olduğundan emin olun. Ön-pompa hava kilidi dizisi cryo tutucu takmadan önce (yaklaşık 2 dakika) bitirmek için bekleyin. NOT: Bu aşama sönmüş olan kırmızı ışıkla belirtilir. </li><li> Hava kilidi içine yerleştirilir ve bu 90 ° saat yönünde döndürmek; sıcaklığını izlemek için cryo sahibine soğuk sahne denetleyici kablosunu bağlayın. Kırmızı ışık sönene kadar tekrar bekleyin ve TEM en hi içine tutucu eklemek için sahne ve arka 0 ° pozisyonuna tutucu hem döndürmekgh vakum sütun. </li><li> Sıcaklık asla kristal buz oluşumunu önlemek için -160 ° C&#39;nin üzerine çıkması emin olun. </li><li> Cryo sahibinin Dewar doldurun. Tutucu termal dengeye ve TEM vakum görüntüleri kaydederken önce iyileşene kadar 45 dakika - 15 bekleyin. </li><li> Sıvı azot kabarcıkları tespit edilirse, sıvı azot dolum yüksekliğini değiştirmek, ya da hafifçe bir pamuklu çubukla köpürme kökenli dokunun. </li></ol> 5. Düşük doz Veri Toplama NOT: Düşük doz veri toplama tekniği / Å 2 20 elektronlara miktarının sınırlandırılması ile örnek elektron radyasyon hasarı en aza indirmek için kullanılır. Bu üç yapılandırmaları arasında değişen elde edilir: yüksek büyütme (~ 150,000X) ve bakış küçük alan ve &quot;maruz kalma&quot; ile, düşük büyütme (~ 5,000X) ve görüntüsü, &quot;odak&quot; geniş alanıyla, &quot;arama&quot;, istenen son Magni ileSınıflamasına ve ilgi alanı içeren kaydedilecek. Modları arasında ışın Boş. <ol><li> TEM ve düşük doz Programı Kurma <ol><li> Cryo-deklanşör çekin ve sütun vanalarını açın. </li><li> Sahne ortala ve 15 ° ± sahne rock alfa wobbler kullanarak eucentric yüksekliği (Z) ayarlayın. Sahne sallanan iken hiçbir kayda değer bir hareket kalmayıncaya kadar Z konumunu ayarlayın. Düşük doz programı etkinleştirin ve her mod için dedektör seçin. </li><li> Pozlama modunda, herhangi bir karbon olan ızgara bir alan bulmak kaydedilecek alanı tamamen aydınlatılmış böylece optimum kondansatör diyafram ve spot boyutu seçerek aydınlatma ayarlayın. Sürkondensasyon yönünde ışını yaymak için emin olun. </li><li> Arama modunda, yüksek büyütmede kolay tanımlanabilir olacak küçük bir özelliği bulmak. Pozlama modunda, joystick (xy sahne denetleyicisi) ile bu özelliği merkezi. Feat eğer düşük büyütme başlayınure görüş alanında değil. </li><li> Arama modunda, düşük doz xy görüntü kaydırma kontrolleri kullanarak alanının merkezine bu özelliği getirmek. Pozlama moduna gidin ve kaydedilecek alanı dışında olduğu kadar joystick&#39;i kullanarak eksen eğim boyunca özelliğini taşımak (0,5-3 mikron). Modunu odak gidin ve xy görüntü kaydırma kontrolleri kullanarak özelliğini merkezi. Özellik görüş alanında değilse düşük büyütme başlayın. </li><li> Her zaman merkezli ışın tutun. </li></ol></li><li> Bilgi toplama <ol><li> Cryo-deklanşör çekin ve sütun vanalarını açın. Düşük doz programı etkinleştirin. </li><li> Arama modunda, ince, homojen buz içeren bir ızgara kare tespit. </li><li> Uygun delik seçin ve alanın ortasına yerleştirin. Modunu odak ve görüntü odak geçin. 4.5 mikron - O 0.5 görüntü underfocus. </li><li> Pozlama moduna geçer ve görüntüyü kaydedebilirsiniz. </li><li> 5.2.3-5.2.4 modu arama ve adımları tekrar geçin.Kaçınarak ızgara Meydanın karşısında hareket öncesi açığa iyi delikleri kaydedilecek. </li><li> Izgara kare bitirin ve başka iyi bir hareket. </li><li> Yüksekliği (Z) yeniden ayarlayın ve veri toplama devam ediyor. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+viruses.">Cryo-electron microscopy of viruses.</a> Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).</li><li>Franzini-Armstrong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RyRs:+Their+Disposition,+Frequency,+and+Relationships+with+Other+Proteins+of+Calcium+Release+Units.">RyRs: Their Disposition, Frequency, and Relationships with Other Proteins of Calcium Release Units.</a> Curr Top Membr. 66C, 3-26 (2010).</li><li>Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+proteins+and+macromolecular+complexes+by+negative+stain+EM:+from+grid+preparation+to+image+acquisition.">Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: from grid preparation to image acquisition.</a> J Vis Exp. (58), (2011).</li><li>Shaikh, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nat Protoc. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li><li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FREALIGN:+high-resolution+refinement+of+single+particle+structures.">FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures.</a> J Struct Biol. 157 (1), 117-125 (2007).</li><li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+structures+of+macromolecules+using+single-particle+analysis+in+EMAN.">3-D structures of macromolecules using single-particle analysis in EMAN.</a> Methods Mol Biol. 673, 157-173 (2010).</li><li>Radermacher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+and+three-dimensional+reconstruction+of+the+calcium+release+channel/ryanodine+receptor+from+skeletal+muscle.">Cryo-electron microscopy and three-dimensional reconstruction of the calcium release channel/ryanodine receptor from skeletal muscle.</a> J Cell Biol. 127 (2), 411-423 (1994).</li><li>Stewart, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+bias+in+the+refinement+of+structures+derived+from+single+particles.">Noise bias in the refinement of structures derived from single particles.</a> Ultramicroscopy. 102, 67-84 (2004).</li><li>Serysheva, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryomicroscopy+and+angular+reconstitution+used+to+visualize+the+skeletal+muscle+calcium+release+channel.">Electron cryomicroscopy and angular reconstitution used to visualize the skeletal muscle calcium release channel.</a> Nat Struct Biol. 2, 18-24 (1995).</li><li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+reconstructions+of+the+transferrin-transferrin+receptor+complex+obtained+with+different+specimen+preparation+techniques.">Single particle reconstructions of the transferrin-transferrin receptor complex obtained with different specimen preparation techniques.</a> J Mol Biol. 355 (5), 1048-1065 (2006).</li><li>Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GraFix:+stabilization+of+fragile+macromolecular+complexes+for+single+particle+cryo-EM.">GraFix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM.</a> Methods Enzymol. 481, 109-126 (2010).</li><li>Wang, L., Lashuel, H. A., Walz, T., Colon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+apolipoprotein+serum+amyloid+A+in+solution+forms+a+hexamer+containing+a+central+channel.">Murine apolipoprotein serum amyloid A in solution forms a hexamer containing a central channel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (25), 15947-15952 (2002).</li><li>Amunts, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+yeast+mitochondrial+large+ribosomal+subunit.">Structure of the yeast mitochondrial large ribosomal subunit.</a> Science. 343 (6178), 1485-1489 (2014).</li><li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+molecular+microscopy:+the+new+Leginon+system.">Automated molecular microscopy: the new Leginon system.</a> J Struct Biol. 151 (1), 41-60 (2005).</li><li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy.">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).</li><li>Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+structures+to+near-atomic+resolution+from+thirty+thousand+cryo-EM+particles.">Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles.</a> Elife. 2, e00461 (2013).</li><li>Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-atomic+resolution+reconstructions+of+icosahedral+viruses+from+electron+cryo-microscopy.">Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy.</a> Curr Opin Struct Biol. 21, 265-273 (2011).</li><li>Lerch, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+AAV-DJ,+a+retargeted+gene+therapy+vector:+cryo-electron+microscopy+at+4.5+A+resolution.">Structure of AAV-DJ, a retargeted gene therapy vector: cryo-electron microscopy at 4.5 A resolution.</a> Structure. 20 (8), 1310-1320 (2012).</li><li>Govindasamy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+adeno-associated+virus+serotype+5.">Structural insights into adeno-associated virus serotype 5.</a> J Virol. 87 (20), 11187-11199 (2013).</li><li>Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+algorithm+for+the+reconstruction+of+helical+filaments+using+single-particle+methods.">A robust algorithm for the reconstruction of helical filaments using single-particle methods.</a> Ultramicroscopy. 85 (4), 225-234 (2000).</li><li>Ge, P., Zhou, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen-bonding+networks+and+RNA+bases+revealed+by+cryo+electron+microscopy+suggest+a+triggering+mechanism+for+calcium+switches.">Hydrogen-bonding networks and RNA bases revealed by cryo electron microscopy suggest a triggering mechanism for calcium switches.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (23), 9637-9642 (2011).</li><li>Clare, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-triggered+conformational+changes+delineate+substrate-binding+and+-folding+mechanics+of+the+GroEL+chaperonin.">ATP-triggered conformational changes delineate substrate-binding and -folding mechanics of the GroEL chaperonin.</a> Cell. 149 (1), 113-123 (2012).</li><li>Fonseca, P. C., He, J., Morris, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+model+of+the+human+26S+proteasome.">Molecular model of the human 26S proteasome.</a> Mol Cell. 46 (1), 54-66 (2012).</li><li>Gatsogiannis, C., Markl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keyhole+limpet+hemocyanin:+9-A+CryoEM+structure+and+molecular+model+of+the+KLH1+didecamer+reveal+the+interfaces+and+intricate+topology+of+the+160+functional+units.">Keyhole limpet hemocyanin: 9-A CryoEM structure and molecular model of the KLH1 didecamer reveal the interfaces and intricate topology of the 160 functional units.</a> J Mol Biol. 385 (3), 963-983 (2009).</li><li>Torres, J., Stevens, T. J., Samso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins:+the+'Wild+West'+of+structural+biology.">Membrane proteins: the 'Wild West' of structural biology.</a> Trends Biochem Sci. 28 (3), 137-144 (2003).</li><li>Samso, M., Feng, W., Pessah, I. N., Allen, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Coordinated Movement of Cytoplasmic and Transmembrane Domains of RyR1 upon Gating. PLoS Biology. 7 (4), 980-995 (2009).</li><li>DiMattia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+structural+studies+of+adeno-associated+virus+serotype+5.">purification, crystallization and preliminary X-ray structural studies of adeno-associated virus serotype 5.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 61 (Pt 10), 917-921 (2005).</li><li>Samso, M., Shen, X., Allen, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+the+RyR1-FKBP12+interaction.">Structural characterization of the RyR1-FKBP12 interaction.</a> J Mol Biol. 356 (4), 917-927 (2006).</li><li>Lobo, P. A., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+the+N-terminal+domains+of+cardiac+and+skeletal+muscle+ryanodine+receptors:+insights+into+disease+mutations.">Crystal structures of the N-terminal domains of cardiac and skeletal muscle ryanodine receptors: insights into disease mutations.</a> Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).</li><li>De Carlo, S., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+and+cryo-negative+staining+of+macromolecules+and+viruses+for+TEM.">Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM.</a> Micron. 42 (2), 117-131 (2011).</li><li>Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+electron+crystallography.">Introduction to electron crystallography.</a> Methods Mol Biol. 955, 1-16 (2013).</li><li>Yahav, T., Maimon, T., Grossman, E., Dahan, I., Medalia, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography:+gaining+insight+into+cellular+processes+by+structural+approaches.">Cryo-electron tomography: gaining insight into cellular processes by structural approaches.</a> Curr Opin Struct Biol. 21 (5), 670-677 (2011).</li><li>Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+in+situ--the+potential+of+subtomogram+averaging.">Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging.</a> Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 261-267 (2013).</li><li>Harapin, J., Eibauer, M., Medalia, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+supramolecular+assemblies+by+cryo-electron+tomography.">Structural analysis of supramolecular assemblies by cryo-electron tomography.</a> Structure. 21 (9), 1522-1530 (2013).</li><li>Samso, M., Wagenknecht, T., Allen, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+structure+and+visualization+of+transmembrane+domains+of+the+RyR1+calcium+release+channel+by+cryo-EM.">Internal structure and visualization of transmembrane domains of the RyR1 calcium release channel by cryo-EM.</a> Nat Struct Mol Biol. 12 (6), 539-544 (2005).</li><li>Sharma, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryoelectron+microscopy+and+image+analysis+of+the+cardiac+ryanodine+receptor.">Cryoelectron microscopy and image analysis of the cardiac ryanodine receptor.</a> J Biol Chem. 273 (29), 18429-18434 (1998).</li><li>Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+self-assembly+of+monodisperse+phospholipid+bilayer+Nanodiscs+with+controlled+size.">Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size.</a> J Am Chem Soc. 126 (11), 3477-3487 (2004).</li><li>Zhu, J., Penczek, P. A., Schroder, R., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+with+contrast+transfer+function+correction+from+energy-filtered+cryoelectron+micrographs:+procedure+and+application+to+the+70S+Escherichia+coli+ribosome.">Three-dimensional reconstruction with contrast transfer function correction from energy-filtered cryoelectron micrographs: procedure and application to the 70S Escherichia coli ribosome.</a> J Struct Biol. 118 (3), 197-219 (1997).</li><li>Thon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Phase contrast electron microscopy. , (1971).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

SPA ardından TEM verilen makromolekülü için, düşük çözünürlüklü 3D yapısı ilk daha-yüksek takip edebilir NS verilerden belirlenir, genel olarak orta 2014 yılına EMDB 2.000 girdileri yaklaşıyor, birçok makromoleküler 3D yapılar katkıda bulunmuştur çözünürlüklü cryoEM 3D yapısı. İlk 3 boyutlu rekonstrüksiyon kolaylaştırır NS tarafından sağlanan moleküler sınırları yüksek kontrast, daha sonra onun, tam hidrate durumda makromolekül iç yapısını harita yeteneği, ve çok daha yüksek çözünürlük elde etmek imkanı ile cryoEM rafine edilir. CryoEM diğer bir avantajı, makromolekül çökmesine neden olabilir dehidrasyon stres ortadan kaldırılmasıdır. Buna ek olarak, olası yüzey absorpsiyon etkilerini ortadan kaldırır ve makromolekül çözeltisi içinde benimser yapıyı gösteren karbon desteği, ihmal etmek imkanı vardır. Cryo-negatif boyama, cryoEM ve NS bir arada, tam HYD yüksek kontrast verirörnek puan ve leke kendisi makromolekül 31 bütünlüğüne müdahale edebilir, çünkü aynı zamanda kısmen, 10&#39;dan az EMDB girişleri ile, ancak daha az sıklıkla kullanılır olmuştur, SPA kullanarak 3 boyutlu rekonstrüksiyon yol açabilir. 3D rekonstrüksiyon elverişli diğer iki TEM teknikleri 2D elektron kristalografisi ve elektron tomografi vardır. 2D elektron kristalografisi, düzlemsel ya da boru şekilli kristal gerektirir; kristalin en elektron kırınımı potansiyel atomik çözünürlükte 32 öncü 3D rekonstrüksiyon için kullanılır. Vitrifiye ya da geleneksel sabit örneklerde elektron tomografisinde, bir makromolekül ya da alt-hücresel bileşeni tek nesnelerin yeniden edilebilir avantajı ile, daha sonra tomografik yeniden 33 için TEM içinde döndürülür; Ancak bugüne kadar bu teknik, 34,35 40-20 arasında değişen bir çözünürlük sınırı vardır. Tüm bu moleküler TEM teknikleri arasında, NS ve cryoEM verileri SPA en yaygın olmuşturkullanılır. Burada gösterilen protokol SPA analizi için uygun cryoEM görüntüleri elde adamıştır; Bununla birlikte protokolünün çok da cryoEM 2D kristaller ve tomografik örnekleri için de geçerlidir. Başarılı bir cryoEM oturumu birçok kritik adımlar kombine başarısına bağlıdır; önemli yönleri, akılda tutmak ortak cryoEM eserler açıklama ve onları aşağıdaki paragraflarda açıklanmıştır önlemek için nasıl. Bu bölümde ayrıca SPA yöntemi kullanarak yüksek kaliteli 3D rekonstrüksiyon elde etmek veri toplama kurallarına anlatılmaktadır. Buz kristal geçiş kaçının. Merkezi bir yönü örnek cryo-dalan TEM gözlem boyunca andan itibaren camsı halde kalmak gerekiyor. Bu yüzden, sıvı etan bakımından örnek dalan sonra takip eden tüm adımlar sıvı azot (-196 ° C) ya da sıvı helyum (-269 ° C) sıcaklıklarda gerçekleştirilir. -135 ° C&#39;nin üzerinde ısıtıldıktan vitreus su dönüşümleriKristal su; Daha sonra makromoleküler düzenlenmeleri yer alabilir ve su kristalleri görüntü (Şekil 3A) hakim; Numune atılmalıdır. Taşıma cımbız yeterince öncesi olsaydı Kaza örnek ısınma cryo-dalma, TEM içine (bir gridbox tarafından korunan bile) kaplarda ve / veya cryo tutucu ekleme arasındaki dondurulmuş ızgara transferi çok yavaş ise ne, ya da olabilir soğutulmuştur. Cryo-transferi üzerine TEM belirgin vakum bozulma (soğuk örnek tuzakları sıcak gelen hava) da örnek ısınabilir. Son olarak, aşırı ışınlama numunenin ayrıca buz kristal geçiş neden olabilir. Buz kontaminasyonu en aza indirin. Küçük bir örnek hacmi (3-5 ul) TEM ızgara uygulanan göz önüne alındığında, buharlaşma tampon bileşenleri (tuz, deterjanlar) konsantre ve dolayısıyla multimerik devletin kaybı da dahil olmak üzere makromoleküler bütünlüğünü etkileyebilir. Yüksek bağıl nem (RH) mikro-ortam veya oda circumvents Bu sorun. Alternatif Cryo-dalma yeterince havalandırılmış çevre soğuk odada yapılabilir. Cryo-dalan RH sonra kendisini soğuk bir tuzak olarak görür cryo-grid gibi, buz kontaminasyonu veya krio-ızgara üzerinde ortamdaki nem yoğunlaşmasını önlemek için mümkün olduğunca düşük olmalıdır. Buz kirlenme yüksek kontrast ve 5 ° arasında nm arasında değişen boyutlarda ve müdahale etmesi ya da hatta tamamen görüntü blok birkaç mikron ile bir alt sahip parçacıklardan oluşmaktadır. Hava transferi sırasında cryo-grid doğru nefes / konuşurken, hava taslaklar kaçının ve ortam RH azaltır. (Beyaz asılı parçacıklar gibi görünür) yoğunlaşmış su ile açın sıvı azot kapları da atılmalıdır. Makromoleküler yönelimler / görüşlerini maksimuma çıkarın. Örnek desteği için, yapılacak bir seçim, gerçek holey ızgaraları ve holey ızgaraları üzerinde ince karbon arasındadır. Bu örnek karbon delikleri karşı karbon filmi yayılır nasıl (i), (ii) kullanılabilir örnek conce bağlıdırntration, çıplak delikleri görüntünün üzerinde benzer bir parçacık yoğunluğu, karbon desteği daha yüksek bir konsantrasyon 100X gerektirebilir (~ 0.02 uM 2), ve (iii) makromolekül yönelimleri dağılımı ne kadar rastgeledir. Karbon hidrofil yapar kızdırma akıntı, Not, her üç açıdan önemli bir etkiye sahip olacaktır ve bu örnek bağımlı olacak. Yüksek çözünürlüklerde 3D rekonstrüksiyon hassaslaştırırken tekrarlayan görünümü rastgele konik yeniden başlangıç ​​yapısal belirlenmesi için arzu edilir ise, makromolekül yönünü ilgili olarak, makromoleküler görüş rastlantısallığı arzu edilir. Bizim örneğimizde, RyR1 bir favori &#39;dört kat&#39; görünümü (Şekil 2B) ile karbon ile etkileşime ve yönelimlerin rastgelelik ve daha yüksek çözünürlükte 36 Delikli ızgaraları gerektirir. SNR. SNR artırmak için en iyi strateji gürültü arka kaynaklarını azaltmak için üst düzeye çıkarın. Aşırı buzkalınlık ve gerekli ötesinde karbon film kalınlığı desteklemek ve protein ekstra gürültü katacak gömmek için (varsa). Böylece buz kalınlığı blot zaman, basınç, RH, ve filtre kağıdı kalitesini kontrol ederek gerekli minimum azaltılmalıdır. Karbon desteği için, ince (~ 5 nm) karbon film kalın holey karbon film üzerinde katmanlı: numune ince karbon kaplı delik üzerinden görüntülü ise kalın holey karbon mekanik direnç sağlar. Öte yandan, son derece ince bir buz not edin ve / veya C-bir ağ (Şekil 3D) dönüşebilir bir kolay kırılan destek neden olabilir. SNR en üst düzeye çıkarmak için, herhangi bir gereksiz tampon bileşenleri kaçınılmalıdır. Membran proteinleri için, deterjan aksine önemli bir otoyol (Şekil 2D, sağ paneli bakınız) alır. Yüzey gerilimini azaltarak ek deterjan örnek desteği yayılır biçimini değiştirir. Bazı membran proteinleri det ek olarak lipid varlığını gerektirirayrıca kontrast azaltır ergent. Bu örnek üstesinden gelmek için, sadece 37 cryo dalan önce düşük deterjan konsantrasyonuna ve lipid olmayan bir tampon içinde seyreltilebilir. Yeni bir alternatif deterjanlar 16 ve transmembran alanı komponentinin stabilizasyonu için nanodisks 38 kullanılması cryoEM da görüntüleme zar proteinleri başarılı yaklaşımlar gibi görünmektedir. Yüksek kaliteli görüntüler için çabala ve CTF düzeltme için hazırlık. Vitrifiye örnekleri hangi orada hiçbir işaret, CTF, frekansa yoğunluğunu ilgilidir fonksiyonu, çeşitli sıfır geçişler vardır kontrast yeterli görüntü (faz) oluşturmak için yüksek bulanıklaştırma değerleri gerektirir bilgi. CTF düzeltme düşük çözünürlüklü 3D rekonstrüksiyon için gerekli olmasa da daha yüksek çözünürlük hedefleyen zaman, 3D nesnenin doğru sunumunu kurtarmak için, farklı defoci ile görüntüleri hesaplama CTF düzeltme yapılabilir ve böylece toplanan gerekir.CTF belirlenmesi ve düzeltilmesi önemli SPA yazılım paketleri 4-7 dahildir; detaylar başka bir yerde 39 bulunabilir. Optimum CTF düzeltme için, defoci bir dizi kullanın. İyi bir strateji 3-4 bulanıklaştırma değerleri arasında dönüşümlü etmektir. değerleri, buz / karbon kalınlığı (ince numune az bulanıklaştırma gerektirir) ve gerilim (voltaj düşük az bulanıklaştırma gerektirir) makromolekül (büyük boyutlarda daha az bulanıklaştırma gerektiren) büyüklüğüne bağlıdır. 200 kV için, değerlerin iyi bir başlangıç ​​aralığı 2.5, 3, 3.5 ve 4 mikron bulanıklaştırma olduğunu. CTF karşılıklı uzay gösterimi, güç spektrumunda (Thon 40 halkaları) yüksek ve düşük yoğunluktaki halkaları alternatif olarak tezahür eder. Çözünürlük potansiyelini ortaya çıkaracaktır güç spektrumunu gösteriliyor; geniş görünür Thon halka sıklığı ulaşılabilir çözünürlük önsel tahmini en yakın. güç spektrumu periyodik olarak kontrol, ve astigmat (dairesel olmayan) Thon halkaları olmalıdır (Şekil 3C) objektif stigmator ile düzeltilmelidir. Thon halkalar en azından istenen çözünürlüğe kadar görünür olmalıdır. Bu protokolü kullanılarak elde edilen bir cryoEM kümesi doğrudan 3D rekonstrüksiyon oluşturmak amacıyla SPA tarafından işlenebilir. Hatta ideal örneği ile, 3D rekonstrüksiyon kalite performansı ve TEM ekipman özelliklerine bağlıdır, ve görüntü işleme olacaktır. Bu iki cephede de, ve son zamanlarda geliştirilen doğrudan elektron dedektörleri ile anılmayı devam iyileştirmeler sayesinde, olasılık daha tutarlı atomik çözünürlükte 3D rekonstrüksiyon elde hiç olmadığı daha yakın için.

cryoEM hedefi kendi ana hidre edilmiş halde makromoleküllerin elektron mikroskopik görüntü elde etmektir. Vitrifiye suda makromolekül gömme sayesinde, bir dondurulmuş sulu örnek doğrudan sokulabilir ve TEM cihazda görselleştirilmiştir. Vitrifikasyon dondurma, flaş (10.000 o C / sn) tarafından elde, su kristalleşme olmadan örnek donuyor ve donma sırasında moleküler düzenlenmeleri önemsiz olmasını sağlar. Çevredeki tampon göre numunenin elektron saçılması aşırı herhangi bir leke 1 yokluğunda makromolekül görmek için küçük ama yeterli kontrast sağlar. Bilgisayarlı görüntü işleme sonra makromoleküle 3D yapısını yeniden oluşturmak için kullanılabilir. ~ 500 kDa- çok MDa aralığında Büyük makromoleküller (Elektron Mikroskobu Bilgi Bankası (EMDB) girişleri over% 80 temsil eden) cryoEM için ideal örnekler vardır; Bu proteinler, protein kompleksleri, protein-nükleik asit, C içeriromplexes ve zar proteinlerinin, bir iki-tabaka içinde gömülü. Bu makromoleküller (PDB veritabanı az% 2 girişleri ile) kristalize olması daha az olasıdır henüz x-ışını kristalografisi veya NMR tarafından çözüldü küçük parçalar cryoEM tarafından oluşturulan 3D zarfın içine yerleştirilmiş olabilir sık ​​sık bir durumdur. Öte yandan, cryoEM çözülmüştür büyük yapıların bazı ince kesitli TEM 2 tam hücre içinde tanımlanabilir. Böylece, cryoEM etkili bir hücre içi ve atomik yapıları arasındaki boyut ve çözünürlük boşluğu kapatıyor. CryoEM leke dışlama bölgesi güçlü bir tezat &quot;negatif&quot; imajını 3 yaratır sayede makromolekül susuz ve ağır metal leke tabakası ile çevrili olan negatif boyanma daha klasik yöntemle (NS), daha iyi makromoleküle doğal yapısını yansıtmaktadır. Her iki durumda da elektron ışını makromoleküllerin 2D projeksiyon görüntüleri denilen parçacıklar, s üretirhape elektron ışını ile ilgili olarak bir makro molekülün yönüne bağlıdır. Birçok parçacıklar, en azından ~ 1.000 ve hiçbir üst sınırı ile, gürültü oranı (SNR) ortalamaya rağmen sinyal artırmak için, ve parçacığın mekansal oryantasyon parametrelerini bulmak için &#39;tek parçacık analizi&#39; (SPA) yazılımı ile bilgisayarda analiz edilebilir arka projeksiyon 4-7 makromoleküle 3D yapısını yeniden gerekiyordu. Yüksek SNR NS, ön örnek karakterizasyonu için kullanılır ve de novo 3D yeniden üretmek üzere programlanabilen; çözünürlüğü nadiren ağır metal tahıl dehidrasyon ve boyutuna göre dayatılan 20 Å aşıyor. Genel olarak, cryoEM 3D yapısal belirlenmesi için, düşük çözünürlüklü 3D rekonstrüksiyon, ilk NS elde edilir ve daha sonra cryoEM daha da iç yapısını görmek için, onun yerli hidrate durumda makromolekül incelemek için bu düşük çözünürlüklü ilk haritayı rafine için kullanılan ve çözünürlüğü artırmak için. Hayırte ki NS modeli bozuk edildi (en yaygın örneği dehidratasyon 8 kaynaklanan düzleşme) ve cryoEM parçacıklar düşük SNR, daha sonra bozulma, düşük SNR yaygındır cryoEM modeli (model önyargı dışlayıcı, içine taşımak olabilir olsaydı gerçekleştirmede 9). Yapısal bozukluk NS ve cryoEM ham tanecikler arasında ve ham cryoEM parçacıkları ve düzleştirme yönüne dik 3D modeli, karşılık gelen projeksiyonlar arasındaki uyumsuzluk ile sonuçlanacaktır. 3D modeli ardışık arıtma döngülerine maruz gibi model önyargı başına çözebilir. Bu 3D modeli ham cryoEM parçacıklar ve ilgili projeksiyonlar arasındaki yazışma eksikliği olarak tespit edileceği, meydana olmamalı, daha sonra bir de novo modeli cryoEM verilerinden inşa edilmelidir. İyi bir yaklaşım mümkün olan en iyi cryoEM modelini seçmek için birkaç olası 3D hacimleri verebilir açısal sulandırma algoritması 10, kullanımı, ve sonra NS 3D modeli kullanmak için olabilirBu 11 daha rafine olacak. Daha iyi bir strateji (Tartışma adanmış bölümüne bakınız) cryoEM dataset SNR artırmaktır. saflaştırılmış makromolekül biyokimyasal kalitesi nihai sonucu bir derece etkiye sahiptir. Makromolekül, heterolog sistemlerde dokudan arıtılır veya eksprese, yüksek saflık derecesine sahip ve yapısal olarak sağlam olmalıdır. Bu ne agrega oluşturmalıdır ne de parçalamak gerekir. Belirli bir yapıyı tanımlamak için, hazırlama koşulları muntazam bir oluşum durumunu teşvik etmelidir. Kompleksleri incelemek için, başka türlü fiksatif başarılı düşük afiniteli etkileşimler 12,13 stabilize etmek için kullanılmaktadır, bunların Kd nM aralığında olması en iyisidir. İşlenmemiş cryoEM görüntüleri boyutları hakkında değerli bilgiler, genel hatlarıyla, toplama / multimerizasyon, homojenlik durumunu ve macromolecu iç yapısını verimle. Yine tekniğin potansiyel ölçüde görüntü işleme ile geliştirilmiştir. Bir 3D yapı, makromolekül genel mimarisini, ligand ve alt-birimleri, bu şekilsel değişikliklere ve 3D konum ortaya çıkarır ve X-ışını kristalografisi veya NMR yolu ile belirlenen atomik yapılarının yerleştirme sağlar. çözünürlük arttıkça 3D rekonstrüksiyon bilgi miktarı adım adım artar: Genel 15-20 Å çözünürlükte 9-10 Å alfa heliksler de, atom yapıların kesin yerleştirme izin 5 Å azından ayırt etmek mümkün, çubuklar gibi görünür Beta levhalar ve 3.5 Å ve daha iyi çözünürlükte bir atom modeli 14 inşa etmek mümkündür. olasılığı en az 0.05 mg 3-5 ul / mL olarak bir TEM ızgara hazırlamak için yeterli olan, bilgi görüntü ve cryoEM çekici bir teknik bu örnek, nispeten küçük miktarlardaki SPA kullanılarak bir 3D yeniden elde edildi. Minimum gereksinimler enstrümantalcryoEM bir ev yapımı veya ticari kriyo-piston, ultra yüksek vakum, görüntü kayıt ortamı ve düşük doz kiti olarak, pompa istasyonu, bir ışıma boşaltma aygıtı ile bir kriyo-tutucu ve bir buharlaştırıcı ile bir elektron mikroskobu bulunmaktadır. TEM&#39;de zorunlu olmayan ancak daha arzu edilen özellikler (tüm modern dardı mevcut) CCD kamera veya doğrudan elektron dedektörü, alan emisyon tabanca (FEG), enerji filtreleme ve yüksek verimlilik veri toplama yazılımı vardır. Prensip olarak bu yazılım, ancak artan veri depolama ihtiyaçlarını ve sonraki denetimli sonrası işlem süresi ihtiyacı dikkate alınacak, bir tek cryoEM oturumda 15 onlarca parçacıkların binlerce toplama sağlar. Kontrast transfer fonksiyonu (CTF) düzeltme ile birlikte FEG alfa helis görselleştirmek için yeterli çözünürlük ulaştı çoğu 3D rekonstrüksiyon yatmaktadır. Bu noktada, çözünürlük düzeyi de örnek-bağımlı: 10 Å çözüme ulaşma zar proteinleri için daha az yaygın olup olmadığını isesimetri yüksek mertebeden atomik çözünürlük daha ulaşılabilir sonra mevcut. doğrudan elektron dedektörü son gelişmeler cryoEM elektron yoğunluğu haritaları kalitesi, bu X-ışını kırınım verileri 16,17 türetilen uygundur (4x) düşük ya da hiç simetrisi bile moleküller için atomik çözünürlük sağladı. Tekniğin yeteneklerini gösteren Pratik örnekler cryoEM yapısal kararlılık devam eden bir baş rolü vardır makromoleküllerin dört önemli türleri için burada verilmektedir. 60-kat ve sadık ve tekrarlanabilir uyum izin onların büyük boyutuna göre veri kümesi artar kendi ikosahedral simetri ile (i), birkaç ikosahedral virüslerin yapıları SPA 18, ardından cryoEM tarafından yakın atom çözünürlüğe çözüme kavuşturuldu. Bu ikosahedral virüslerinden, adeno-bağlantılı virüsler (AAVler) içindeki bir sınıfın bir örneği göstermektedir olan cryoEM tarafından ve cryoEM / X-ışını hy yakınında atom yapılarıbrid yöntemler 19,20 vardır. (Ii) sarmal yapıya sahip makromoleküller mikrotübüller, filamentler ve virüsleri içermektedir. Sarmal eksen boyunca Onların tekrarlayan birimler sarmal geometri 21 adapte SPA daha karmaşık bir sürümü ile analiz edilebilir. Örneğimizde, tütün mozaik virüsü (TMV), cryoEM 22 vasıtasıyla atomik ayırım çözüldüğü bir RNA virüsü göstermektedir. (Iii) geniş çözünür proteinler fazlasıyla incelenmiştir. Bunlar arasında, simetrik multimerik silindir oluşturan makromoleküller genellikle subnanometer çözünürlükte 23,24 çözülmüş bir yinelenen mimari oluşturmaktadır. Burada bir melez moleküler modeli cryoEM / x-ışını kristalografisi hibrid yöntemleri 25 oluşturulduğu KLH, bir omurgasız oksijen taşıyıcı görüntüleri gösterir. (Iv) Membran proteinleri proteinlerin önemli bir sınıfıdır; insan genomu tarafından kodlanan proteinlerin yaklaşık 1/3 oluşturan, henüz vadesi tr ile ilgili karmaşıklıklar yapısal karakterize etmek zordurBirleştirilen herhangi bir yapısal olan teknikle çözülen yapılar az% 1.5 oluşturan ansmembrane alan sabitleme 26. yapısal tespiti cryoEM ve 3B yeniden rolü riyanodin alıcısı (RyR), kas kasılması ve beyin sinyal verme açısından önemli büyük bir ökariyotik hücre içi Ca + 2 kanal ile örneklenmiştir. Bugüne kadar en yüksek çözünürlükte cryoEM yapıları, 10 Å çözünürlük ile, ikincil yapıyı 27 göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>Ethane</td><td>Airgas</td><td>371745</td><td>99.99% purity very important, impurities can lead to high-contrast contaminants on the grid. CAUTION: flammable</td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td>Airgas</td><td>27135</td><td>99% purity. CAUTION: handling liquid nitrogen in a cold room poses a serious asphyxia hazard since nitrogen displaces oxygen without any warning signs.</td></tr><tr><td>Dumont no. 5 Antimagnetic tweezers</td><td>Ted Pella</td><td>5326</td><td></td></tr><tr><td>Mica sheets, 1 x 4 cm</td><td>Ted Pella</td><td>54</td><td></td></tr><tr><td>Graphite rods, presharpened size 1/8&amp;rdquo; dia x 2 &amp;frac14;&amp;rdquo; long tip 0.039&amp;rdquo; dia neck type</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70220-45</td><td></td></tr><tr><td>350 ml cryo-dewars</td><td>Pope</td><td>8600</td><td></td></tr><tr><td>Cu 400 mesh holey grids&amp;nbsp; Quantifoil</td><td>Quantifoil</td><td>Q10525</td><td></td></tr><tr><td>Cu 400 mesh holey grids C-Flat</td><td>Protochips</td><td>CF-1.2/1.3-4C</td><td></td></tr><tr><td>Glow discharge device</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Model E7620</td><td></td></tr><tr><td>Turbo pumping station</td><td>Gatan</td><td>Model 655</td><td></td></tr><tr><td>Carbon evaporator</td><td>Denton Vaccum</td><td>Model 502B</td><td></td></tr><tr><td>Freeze plunger</td><td>FEI</td><td>Vitrobot Mark IV</td><td></td></tr><tr><td>Transmission electron microscope 200 kV</td><td>FEI</td><td>Model Tecnai F20</td><td></td></tr><tr><td>CCD Camera 4k x 4k</td><td>Gatan</td><td>UltraScan 4000 UHS</td><td></td></tr><tr><td>Image Processing software CTFFIND3/CTFTILT</td><td></td><td></td><td>http://grigoriefflab.janelia.org/ctf</td></tr><tr><td>Image Processing software EMAN</td><td></td><td></td><td>http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2</td></tr><tr><td>Image Processing software Spider</td><td></td><td></td><td>http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</td></tr><tr><td>Image Processing software Freealign&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>http://grigoriefflab.janelia.org/frealign</td></tr><tr><td>3D visualization software Chimera</td><td></td><td></td><td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td></tr><tr><td>Native Keyhole Limpet Hemocyanin</td><td>Biosyn</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

do's and don'ts of cryo-electron microscopy: a primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3d reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules. 
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules. 
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.

Şekil 1&#39;de özetlenen tüm protokol adımları dikkatli yürütme dondurulmuş sulu olmayan lekeli makromoleküllerin görselleştirme sağlar. Farklı yapısal özelliklere sahip dört temsilci örnekler için sonuçlar gösterilmiştir. NS ve cryoEM yöntemleriyle elde edilen mikroskopik görüntü (Şekil 2) karşılaştırılır. AAV5 (i) AD görüntüleri 130 Â çaplı virüs benzeri partiküller ortaya koymaktadır. Dolu ve boş yapıların birlikteliği sırasıyla, ve yapısal olarak sağlam capsids (leke girişine izin olduğunu) kırık karşılık gelir. CryoEM eşit boş yapıları göstermektedir; Gerçekten de, bu viral partiküller genetik malzeme 28 ihtiva etmez. CryoEM kendi ikozahedral formunu yansıtan, çoğunlukla altıgen parçacıklar gösterir ise NS baskın yuvarlak parçacıkları gösterir. (Ii) her iki 23, görünür bir sarmal tekrar ile sık sık uzun süre 0.1 um 180 bir çapa ve değişken uzunlukta sarmal TMV göstermektedir çubuklar görüntüleri,NS ve cryoEM içinde. 40, merkezi bir kanal cryoEM görüntü NS görüntülerde leke ve boş ile doldurulur. (Iii) Yerli KLH, 8 MDA bir didecamer, 350 Å çapı ve 400 Å uzunluğu karakteristik varil toplanır. NS ve cryoEM KLH en dikdörtgen yan görünümleri ve dairesel görünümler sonu üzerinde ortaya. Her iki teknik altı simetri eksenine dik yarıkları ve her katman içinde eşit aralıklı morfolojik birimleri ortaya koymaktadır. CryoEM boş iç yapısını ortaya koymaktadır. (Iv) Riyanodin reseptörü, 2.26 MDA büyük bir tetramerik hücre içi kanal, 275 x 275 Å 2 kare olarak görülüyor. Böyle bir merkezi haç ve NS tarafından leke birikimi olarak tezahür merkezi depresyon gibi cryoEM tarafından düşük yoğunluklu bölgeler gibi Girift yüzey özellikleri. NS dört test edilen numunelerde içindeki kontrast gösterirken, cryoEM panellerin Bu karşılaştırma, bu membran proteini çözünür hale getirmek için deterjan bulunması RyR1 alt SNR (kontrast) ortaya koyar. Kristal buz, buz kirlenme, astigmatizma ve web-benzeri yapılar (Şekil 3): cryoEM eserler tipik örnekleri RyR1 için gösterilmiştir. Onların nedenleri ve önleme daha tartışma bölümünde açıklanmıştır. Dondurulmuş sulu RyR1 SPA ve 3D rekonstrüksiyon proteinin homotetramerik organizasyonu (Şekil 4A) yansıtan dört kat simetrik yapısını ortaya koymaktadır. sitoplazmik alan Å 3 275 x 275 x 120 bir kare prizma oluşturur ve bir iskele-benzeri bir yapı oluşturan birçok tekrarlanabilir küresel etki içerir. transmembran 115 x 115 x 60 Å 3 maksimum boyutları ile daha küçük konik kare prizma oluşturur. 10 Å çözünürlükte alfa helis (Şekil 4B) görselleştirmek mümkündür. 3D fark haritalama, bu durumda, bir 12 kD proteini düşünüldüğü bir FKBP12 3D farkı ilk önemli ligandların konumunu ortaya çıkarabilirRyR1 kırmızı bir alt-birimi, RyR1 (Şekil 4C) 29 üzerine bindirilir. Son olarak, yapısal değişiklikler makromolekül dinamik bir görünüm sağlar. Bu durumda RyR1 önce açık durumda (Şekil 4D) 27 kapalı bir kitle translokasyon kapalı ya da açık koşullarda ortaya stabilize. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52311/52311fig1.jpg" /> Cryo elektron mikroskopisi tekniği Şekil 1. Akış şeması. Diyagram protokolü temel adımları vurgulamaktadır. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52311/52311fig2.jpg" /> Numunelerin çeşitli NS ve cryoEM 2. Karşılaştırma Şekil. (A), AAV5, bir ikosahedral virüsü. Helezoni virüsü (B), TMV. Insets 23 Å sarmal tekrarı, gösterir. (C) Yerli KLH. (D) RyR1; temsili görünümleri (f dört kat görünümü ve s, yan görünümü) vurgulanır. Bütün numuneler, düşük doz ve koşullar altında 200 kV bir hızlandırma gerilimi altında 50,000X bir aynı büyütmede görüntülü. Ölçek çubukları, 10 nm. Tüm NS örnekleri karbon desteği üzerinde, cryoEM örnekleri A, C, D quantifoil üzerinde ince karbon üzerinde, ve cryoEM örnek B quantifoil delikleri üzerinde doğrudan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52311/52311fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52311/52311fig3.jpg" /> Şekil, bir RyR1 cryoEM örnek ortak cryoEM eserler gösteren görüntü 3. Fotoğraflar. (A) kristal buz. (B) Buz kirlenme (oklar). (C) Astigmat. Astigmat görüntüde RyR1s zorlukla görülebilir. Sağdaki ilave güç SPECT gösterirAsimetrik Thon halkaları görüntünün rom. Soldaki ilave referans olmayan bir astigmat görüntünün güç spektrumunu gösterir. (D) Web-benzeri yapılar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52311/52311fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52311/52311fig4.jpg" /> Riyanodin reseptörünün 4. cryoEM ve 3 boyutlu rekonstrüksiyon Şekil. (A). Isosurface temsili (B), atomik koordinatlar ve cryoEM zarf arasında iyi bir uyum gösteren RyR1 en N-terminali 30 arasında bir kristal yapısının Yerleştirme; oklar yapıdan çıkan iki alfa heliksler işaret. Ok başı iyon kanalının gözenek çevreleyen dört sarmallarının birini gösterir. noktalı çizgiler, membran sınırlarını göstermektedir. (C), RyR1 ve 3B loFKBP12 ligandı (turuncu renk) katyon. (D) açık (siyah örgü) Uyum kapalı (turuncu) den gidiş RyR1 konformasyonel değişiklikler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52311/52311fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction at JoVE.com

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

Makromoleküler 3D İmar için bir örnek Hazırlanması Astar ve Yüksek Kalite Veri Toplama: Cryo-elektron mikroskobu Yapılması ve Yapılmaması Gerekenler

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

do-s-don-ts-cryo-electron-microscopy-primer-on-sample-preparation

Research

JoVE Journal

Biology

46.0K Görüntüleme.  Virginia Commonwealth University. This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

Video: Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at near-atomic resolution. In single-particle analysis, the vitrified sample is imaged by an electron beam and the detectors at the end of the microscope column produce movies of that sample. These movies contain thousands of images of identical particles in random orientations. The data need to go through an image processing workflow with multiple steps to obtain the final 3D reconstructed volume. The goal of the image processing workflow is to identify the acquisition parameters to be able to reconstruct the specimen under study. Scipion provides all the tools to create this workflow using several image processing packages in an integrative framework, also allowing the traceability of the results. In this article the whole image processing workflow in Scipion is presented and discussed with data coming from a real test case, giving all the details necessary to go from the movies obtained by the microscope to a high resolution final 3D reconstruction. Also, the power of using consensus tools that allow combining methods, and confirming results along every step of the workflow, improving the accuracy of the obtained results, is discussed.

Single-particle analysis in cryo-electron microscopy is one of the main techniques used to determine the structure of biological ensembles at high resolution. Scipion provides the tools to create the whole pipeline to process the information acquired by the microscope and achieve a 3D reconstruction of the biological specimen.

Scipion ile Kriyo-EM ve Tek Parçacık Analizi

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Biyokimya

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in situ. Owing to the strong interaction of an electron with the matter, high-resolution cryo-ET studies are limited to specimens with a thickness of less than 200 nm, which restricts the applicability of cryo-ET only to the peripheral regions of a cell. A complex workflow that comprises the preparation of thin cellular cross-sections by cryo-focused ion beam micromachining (cryo-FIBM) was introduced during the last decade to enable the acquisition of cryo-ET data from the interior of larger cells. We present a protocol for the preparation of cellular lamellae from a sample vitrified by plunge freezing utilizing Saccharomyces cerevisiae as a prototypical example of a eukaryotic cell with wide utilization in cellular and molecular biology research. We describe protocols for vitrification of S. cerevisiae into isolated patches of a few cells or a continuous monolayer of the cells on a TEM grid and provide a protocol for lamella preparation by cryo-FIB for these two samples.

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

We present a protocol for lamella preparation of plunge frozen biological specimens by cryo-focused ion beam micromachining for high-resolution structural studies of macromolecules in situ with cryo-electron tomography. The presented protocol provides guidelines for the preparation of high-quality lamellae with high reproducibility for structural characterization of macromolecules inside the&#160;Saccharomyces cerevisiae.

Kriyo-Elektron Tomografisi için Saccharomyces cerevisiae'nin Hazırlanması ve Kriyo-FIB mikromakinesi

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The overall process involves i) vitrifying the specimen in a thin film supported on a cryoEM grid; ii) screening the specimen to assess particle distribution and ice quality; iii) if the grid is suitable, collecting a single particle dataset for analysis; and iv) image processing to yield an EM density map. In this protocol, an overview for each of these steps is provided, with a focus on the variables which a user can modify during the workflow and the troubleshooting of common issues. With remote microscope operation becoming standard in many facilities, variations on imaging protocols to assist users in efficient operation and imaging when physical access to the microscope is limited will be described.

Structure determination of macromolecular complexes using cryoEM has become routine for certain classes of proteins and complexes. Here, this pipeline is summarized (sample preparation, screening, data acquisition and processing) and readers are directed towards further detailed resources and variables that may be altered in the case of more challenging specimens.

Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskopisi: Numuneden Yapıya

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method for structural biologists to determine high-resolution structures of a wide variety of macromolecules. Multiple software suites are available to new and expert users for image processing and structure calculation, which streamline the same basic workflow: movies acquired by the microscope detectors undergo correction for beam-induced motion and contrast transfer function (CTF) estimation. Next, particle images are selected and extracted from averaged movie frames for iterative 2D and 3D classification, followed by 3D reconstruction, refinement, and validation. Because various software packages employ different algorithms and require varying levels of expertise to operate, the 3D maps they generate often differ in quality and resolution. Thus, users regularly transfer data between a variety of programs for optimal results. This paper provides a guide for users to navigate a workflow across the popular software packages: cryoSPARC v3, RELION-3, and Scipion 3 to obtain a near-atomic resolution structure of the adeno-associated virus (AAV). We first detail an image processing pipeline with cryoSPARC v3, as its efficient algorithms and easy-to-use GUI allow users to quickly arrive at a 3D map. In the next step, we use PyEM and in-house scripts to convert and transfer particle coordinates from the best quality 3D reconstruction obtained in cryoSPARC v3 to RELION-3 and Scipion 3 and recalculate 3D maps. Finally, we outline steps for further refinement and validation of the resultant structures by integrating algorithms from RELION-3 and Scipion 3. In this article, we describe how to effectively utilize three processing platforms to create a single and robust workflow applicable to a variety of data sets for high-resolution structure determination.

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

This article describes how to effectively utilize three cryo-EM processing platforms, i.e., cryoSPARC v3, RELION-3, and Scipion 3, to create a single and robust workflow applicable to a variety of single-particle data sets for high-resolution structure determination.

CryoSPARC, RELION ve Scipion ile Sağlam Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskobu (cryo-EM) İşleme İş Akışı

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ever-increasing share of published structural data. Recent advances in TEM technology and automation have boosted both the speed of data collection and quality of acquired images while simultaneously decreasing the required level of expertise for obtaining cryo-EM maps at sub-3 &#197; resolutions. While most of such high-resolution structures have been obtained using state-of-the-art 300 kV cryo-TEM systems, high-resolution structures can be also obtained with 200 kV cryo-TEM systems, especially when equipped with an energy filter. Additionally, automation of microscope alignments and data collection with real-time image quality assessment reduces system complexity and assures optimal microscope settings, resulting in increased yield of high-quality images and overall throughput of data collection. This protocol demonstrates the implementation of recent technological advances and automation features on a 200 kV cryo-transmission electron microscope and shows how to collect data for the reconstruction of 3D maps that are sufficient for de novo atomic model building. We focus on best practices, critical variables, and common issues that must be considered to enable the routine collection of such high-resolution cryo-EM datasets. Particularly the following essential topics are reviewed in detail: i) automation of microscope alignments, ii) selection of suitable areas for data acquisition, iii) optimal optical parameters for high-quality, high-throughput data collection, iv) energy filter tuning for zero-loss imaging, and v) data management and quality assessment. Application of the best practices and improvement of achievable resolution using an energy filter will be demonstrated on the example of apo-ferritin that was reconstructed to 1.6 &#197;, and Thermoplasma acidophilum 20S proteasome reconstructed to 2.1-&#197; resolution using a 200 kV TEM equipped with an energy filter and a direct electron detector.

High-resolution cryo-EM maps of macromolecules can be also achieved by using 200 kV TEM microscopes. This protocol shows the best practices for setting accurate optics alignments, data acquisition schemes, and selection of imaging areas that are all essential for the successful collection of high-resolution datasets using a 200 kV TEM.

200 KV İletim Elektron Mikroskobu Kullanarak Yüksek Çözünürlüklü Kriyo-EM Veri Kümelerinin Rutin Toplanması

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure determination by SPA relies upon obtaining multiple distinct views of a macromolecular object vitrified within a thin layer of ice. Ideally, a collection of uniformly distributed random projection orientations would amount to all possible views of the object, giving rise to reconstructions characterized by isotropic directional resolution. However, in reality, many samples suffer from preferentially oriented particles adhering to the air-water interface. This leads to non-uniform angular orientation distributions in the dataset and inhomogeneous Fourier-space sampling in the reconstruction, translating into maps characterized by anisotropic resolution. Tilting the specimen stage provides a generalizable solution to overcoming resolution anisotropy by virtue of improving the uniformity of orientation distributions, and thus the isotropy of Fourier space sampling. The present protocol describes a tilted-stage automated data collection strategy using Leginon, a software for automated image acquisition. The procedure is simple to implement, does not require any additional equipment or software, and is compatible with most standard transmission electron microscopes (TEMs) used for imaging biological macromolecules.

The present protocol describes a generalized and easy-to-implement scheme for tilted single-particle data collection in cryo-EM experiments. Such a procedure is especially useful for obtaining a high-quality EM map for samples suffering from preferential orientation bias due to adherence to the air-water interface.

Leginon kullanarak Stage Tilt ile Tek Parçacıklı Cryo-EM Veri Toplama

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...

Optimizing Sample Preparation for Cryogenic Electron Microscopy

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) has revolutionized structural biology by enabling the study of macromolecular structures in near-native conditions, suspended in vitreous ice. This technique allows for the high-resolution visualization of proteins and other biomolecules without the need for crystallization, offering significant insights into their function and mechanism. Recent advancements in single-particle analysis, coupled with improved computational data processing, have made cryo-EM an indispensable tool in modern structural biology. Despite its growing adoption, cryo-EM faces persistent challenges that can limit its effectiveness, particularly uneven particle distribution. This issue often leads to poor resolution and reduced accuracy in reconstructed protein structures. This article outlines a simple, practical approach to address this challenge, using the small heat-shock protein from Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) as an example. The method optimizes sample preparation to minimize preferential adsorption, ensuring more homogeneous particle distribution and higher-quality protein cryo-EM structures. This technique offers valuable guidance for researchers aiming to overcome similar challenges in structural studies.

This protocol presents a practical method using Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) as an example to address uneven particle distribution through sample preparation optimization, providing a reference for researchers to efficiently elucidate macromolecular structures using cryogenic electron microscopy (cryo-EM).

Kriyojenik Elektron Mikroskobu için Numune Hazırlamanın Optimize Edilmesi

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) has revolutionized structural biology by enabling the study of macromolecular structures in near-native ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Yüksek basınç dondurucu, mikrodalga destekli kontrast geliştirme ve en az reçine birim görüntüleme için katıştırma tarafından biyolojik örnek hazırlama

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Biyoloji

A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these techniques, cryo soft X-ray tomography (SXT) allows imaging whole cryo-preserved cells in the water window X-ray energy range (284-543 eV), in which carbon structures have intrinsically higher absorption than water, allowing the 3D reconstruction of the linear absorption coefficient of the material contained in each voxel. Quantitative structural information at the level of whole cells up to 10 &#181;m thick is then achievable this way, with high throughput and spatial resolution down to 25-30 nm half-pitch. Cryo-SXT has proven itself relevant to current biomedical research, providing 3D information on cellular infection processes (virus, bacteria, or parasites), morphological changes due to diseases (such as recessive genetic diseases) and helping us understand drug action at the cellular level, or locating specific structures in the 3D cellular environment. In addition, by taking advantage of the tunable wavelength at synchrotron facilities, spectro-microscopy or its 3D counterpart, spectro-tomography, can also be used to image and quantify specific elements in the cell, such as calcium in biomineralization processes. Cryo-SXT provides complementary information to other biological imaging techniques such as electron microscopy, X-ray fluorescence or visible light fluorescence, and is generally used as a partner method for 2D or 3D correlative imaging at cryogenic conditions in order to link function, location, and morphology.

Here, a protocol describing the sample preparation and data collection steps required in cryo soft X-ray tomography (SXT) to image the ultrastructure of whole cryo-preserved cells at a resolution of 25 nm half pitch, is presented.

Cryo Soft X-ray Tomografisi ile Hücrenin 3D Kartografik Açıklaması

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these ...

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, frozen-hydrated state. However, cryo-ET requires that samples are thin enough to not scatter or block the incident electron beam. For thick cellular samples, this can be achieved by cryo-focused ion beam (FIB) milling. This protocol describes how to target specific cellular sites during FIB milling using a 3D-correlative approach, which combines three-dimensional fluorescence microscopy data with information from the FIB-scanning electron microscope. Using this technique, rare cellular events and structures can be targeted with high accuracy and visualized at molecular resolution using cryo-transmission electron microscopy (cryo-TEM).

Here, we present a pipeline for 3D-correlative focused ion beam milling on guiding the preparation of cellular samples for cryo-electron tomography. The 3D position of fluorescently tagged proteins of interest is first determined by cryo-fluorescence microscopy, and then targeted for milling. The protocol is suitable for mammalian, yeast, and bacterial cells.

Yüksek Çözünürlüklü Kriyo-Elektron Tomografisi için 3D Korbağıntılı Odaklanmış İyon Işını Frezeleme ile Numune Hazırlama

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...