We thank the kind donations of AAV5 sample by Mavis Agbandje-McKenna and Antonette Bennett, and of TMV sample by Ruben Diaz. This work is supported by American Heart Association grant 14GRNT19660003 and VCU startup funds to MS.

1.クライオホルダーの準備およびメンテナンス注：ドライポンプステーション、ターボポンプステーションと1つ以上のコールドステージコントローラからなるが、主に3つの目的のために使用した：a）それは、それらが使用されていないときにクライオホルダを格納するための安全な場所である。所有者を格納するための正しい方法は、真空下駅でそれらを残すことである。 b）は、液体窒素デュワーから取り出し、クライオホルダの先端が露出したときに発生する霜や湿気の蓄積を蒸発すること。これは、ウォームアップサイクルで達成される。 C）ゼオライト乾燥剤を再生するために、とcryoholderデュアーで高真空を達成すること。これは、低温電子顕微鏡法を行う際に、一定の温度を保持する必要がある。 <ol><li>ウォームアップサイクル。 <ol><li>ポンプ場のポンプポートのいずれかにクライオホルダーを挿入します。ホルダーの真空バルブの下に金属コンセントに避難管の1をフック。作る駅（V1、V2、およびV3）上及びクライオホルダー上のすべてのバルブが閉じていることを確認してください。 </li><li>コー​​ルドステージコントローラをオンにして、制御コードを介してホルダーに接続します。ターボポンプ場の電源スイッチをオンにします。 </li><li>コー​​ルドステージコントローラ内のウォームアップサイクル·オプションを起動します。ターボポンプ場における真空は10 -3トルまたはより良いを読み取ると、バタフライバルブV2を開き、真空が安定するまで待ってから、バタフライ弁V1を開きます。 </li><li>ホルダー内の温度が20℃以上で安定するまで約30分間ウォームアップサイクルを実行します。 [閉じるV1、およびサイクルを停止します。 </li></ol></li><li>ゼオライトサイクル。 4時間とO / N CryoEMセッションの前に、そして週に一度使用しない場合においてゼオライトサイクルを実行します。 <ol><li>ゼオライトサイクルオプションを起動し、1〜2×10 -4トルの範囲で、良好な真空を達成するために必要な時間を選択し、したがって、長いホールド時間。真空10 -3に達するとトールは、デュワー排気バルブ、V3を開きます。ポンプステーションは、その後ホルダーに行を避難されます。真空が安定するまで待ちます。 </li><li>クライオホルダーのバルブを開きます。ホルダーのバルブは、V3、V2、および最終的にV1：サイクルが完了すると、それらがオープンされた逆の順序で弁を閉じる。ターボポンプ場とコールドステージコントローラの電源を切り、コールドステージコントローラとターボポンプ場からクライオホルダーを外してください。 </li></ol></li></ol> 2.グリッドの準備<ol><li>クリーニング。 注：商業ホーリーグリッドを使用する際には、製造工程で使用された残留ポリマーを除去するために、使用前にそれらをきれいにすることが推奨される。一番下に敷設ろ紙の5層のガラスシャーレにこれを行います。 <ol><li>ホーリー炭素側を上にして濾紙上にグリッドを配置します。 </li><li>ガラスパスツールピペットを用いて、数滴Oで紙を濡らすグリッドの周りにFクロロホルム、彼らは単に浮動開始するまで。 </li><li>ヒュームフードO / Nでわずかに開いた蓋をペトリ皿をカバーしています。 </li></ol></li><li> NOTE：氷層に直接穴あきカーボングリッド内の小孔を横切って形成することができるように薄いカーボン担体（2.2〜2.3ステップ）を省略することができる。 <ol><li>ピンセットを使用して、2つの新たな表面を露出するために雲母の一部を切断する。ペトリ皿に白い紙に雲母フェイスアップの新たな露出面を配置します。 </li><li>カーボン蒸発器のベルジャーでペトリ皿を置きます。真空は、2×10 -6トル未満になるまでのシーケンスをポンプダウンし始める。炭素棒の表面上の不純物を揮発させ、被覆されたペトリ皿で​​予備蒸発を行う。その後ベルジャーを放送し、ペトリ皿からカバーを取り外します。 </li><li>真空はカーボンの薄層（〜5 nm）を持つマイカは10 -6トルとコートを下回るまでポンプダウンシーケンスを実行します。炭素中に眼の保護を使用して、蒸発。マイカシートの下に置かれていた紙に生じた闇に炭素膜の厚さを監視します。 </li></ol></li><li> TEMグリッドに炭素薄膜を転送します。 <ol><li>被覆された雲母の0.5×1cmの部分をカットし、ろ過し、脱イオン水の平らな表面上に炭素から浮上。平らな水面を取得するために、光学レンズペーパーを使用してください。ピンセットを使用して、浮遊炭素層の上面に接して、グリッドの穴あきカーボン側を入れて、それを拾う。 </li><li>グリッドの十分な数が用意されるまで、ステップ2.3.1と2.3.2を繰り返します。 </li></ol></li><li>グロー放電。 NOTE：グロー放電は、親水性にグリッドの天然に疎水性炭素被覆層に変換する。この手順はオプションです。 <ol><li>炭素側はパラフィルムで覆われた7.5×2.5センチのガラススライド上に上向きにグリッドを配置します。グロー放電装置のチャンバにそれを置き、チャンバーを閉じます。 </li><li>ポンプ25ミリアンペアで20秒、7×10 -2ミリバールのためのベルジャーとグロー放電。 注：この時間の間に光紫色の輝きが見えるようになる。グリッドとのスライドガラスを削除し、1時間以内にそれらを使用し、そうでなければ、彼らは再び放電グローする必要があります。 </li></ol></li></ol> 3.サンプルプランジ凍結注：液体窒素とエタン飛沫から保護するために、この機器を使用する際、安全メガネと適切な靴を使用してください。 <ol><li>プランジ​​凍結装置の電源をオンにします。蒸留水で加湿器リザーバーを記入してください。所望の温度に設定された相対湿度及びブロット時間の条件を急落、ブロット力と吸着時間（22°C、95％、2秒、ここに示した例における2及び40秒）。新しいブロッティング濾紙を置きます。 </li><li>安定性（約10分）達成されるまで液体窒素で外側容器を充填することによってエタン容器を冷却する。液体窒素はboilin停止するとGは、内側チャンバー内エタンタンクからのチューブの先端を配置し、非常にゆっくりとバルブを開きます。内室にエタンを液化して、上から1ミリメートルにそれを埋める。エタンを凍結しないでください。注意：エタンが極めて引火性と爆発性のある。 </li><li>ピンセットは、装置の凍結プランジ内に整列していることを確認します。 </li><li>湿度の電源をオンにします。ピンセット上にグリッドをロードし、ホーリーグリッドの炭素表面（鈍い側）にサンプルの3-5μlのをロードします。薄い液体層を達成するためにグリッドに吸着し、ブロッティングを行うために、サンプルを待ちます。 </li><li>液体エタンにそれを沈めることで、グリッドをフラッシュ凍結。着実にピンセットを保持する液体エタンからピンセット·グリッドアセンブリを取り外し、液体窒素で外室に移す。液体窒素中に浸漬し、小さなグリッドボックスにグリッドを転送します。貯蔵タンクのいずれかへの転送中に液体窒素中ですべての時間をガラス化したサンプルを維持することを確認してくださいまたはクライオホルダーに。 注：グリッドボックスは、少なくとも1年間の大容量（35〜50 L）、液体窒素デュワー内に格納することができる。収納に便利な、彼らは2と50ミリリットルファルコンチューブに配置することができます上部とデュワーの口から引き出すことができる、そのキャップに添付釣り糸で穴を掘削。 </li></ol> 4. TEMにクライオグリッドを転送<ol><li>クライオ転送ワークステーションにクライオホルダーを挿入します。挿入中にホルダーの先端を傷つけないように注意してください。任意の光学レンズペーパーでそれを削除がある場合は、ルーペを使ってロッドとクライオホルダーのOリング上の小さな繊維や粉塵の存在を確認してください。 </li><li>クライオホルダーのデュワー、液体窒素で、ワークステーションの容器を埋める。ワークステーションが付属して閉じ込められたロートを用いて液体窒素をこぼさないようにしてください。 </li><li>温度を監視するためのコールドステージコントローラにクライオホルダーを接続し、液体窒素＆＃を追加し続ける160、温度が約-194℃で安定するまで。液体窒素のレベルがワークステーション容器とクライオホルダーデュワー内の両方の真空シールのレベルの下にあることを確認します。グリッドピンセット、クリップリングとワークステーション上のクリップリングツールの平滑末端を事前に冷却する。また、大規模なピンセットのセットと、液体窒素で満たされた別のデュワーでドライバーを事前に冷却する。 </li><li>すぐに大規模なピンセットを使用してワークステーションでの液体窒素に凍結し、水和グリッドを含む低温グリッドボックスを転送する。ドライバーで低温グリッドボックスを開き、凍結された水和したグリッドを取り、試料ホルダースロットに配置します。 </li><li>グリッドの上にクリップリングを置き、静かにそれがしっかりと所定の位置に固定されるまでクリップリングツールの平滑末端でそれを押してください。クライオシャッターを閉じます。ワークステーションからツールや低温グリッドボックスを外します。 </li><li>ミニするために、顕微鏡コンソールにホルダーとグリッド全体のワークステーションを移動室内空気中のグリッドの転送時間をマイズ。 </li><li>以前に充填され、少なくとも20分間冷却された液体窒素、とTEM抗contaminator締めくくり。 -60℃に顕微鏡ステージをプレチルト。 注：ホルダは、エアロックの中に挿入されるように、これは、液体窒素の損失を最小にする。 </li><li>顕微鏡の事前ポンプエアロック·サイクルを開始します。電子銃にバルブが閉じていることを確認します（それはFEG TEMである場合は特に）。ポンプ前エアロックシーケンスはクライオホルダーを挿入する前に（約2分）を終了するのを待ちます。 注：これは消滅しているステージ上の赤い光で示されます。 </li><li>エアロックにホルダーを挿入し、90°時計回りに回転させる。温度を監視するためにクライオホルダーにコールドステージコントローラコードを接続します。赤色光が消えるまで、再び待機し、TEMのハイテクにホルダーを挿入するために戻って0°位置にステージとホルダーの両方を回転させるGH真空コラム。 </li><li>温度が決して、結晶氷の形成を回避するために-160℃以上になっていないことを確認してください。 </li><li>クライオホルダーのデュワーを補充。ホルダーが熱平衡化し、TEMの真空が画像を記録する前に回復するまで45分 - 15を待ちます。 </li><li>液体窒素のバブリングが検出された場合には、液体窒素の充填高さを変更し、または穏やかに綿棒でバブリング原点に触れる。 </li></ol> 5.低線量データの収集注：低用量のデータ収集技術は/Å2 20電子への曝露を制限することにより、試料に電子線損傷を最小限に抑えるために使用される。これは、3つの構成の間で交互にすることにより達成される：高倍率（〜150,000X）と小さい視野、および「露光」で、低倍率（〜5,000倍）、ビュー、「フォーカス」の幅広い分野で、「検索」、所望の最終マグニ付きfication及び関心領域を含むが記録される。モード間でのビームブランク。 <ol><li> TEMおよび低用量プログラムを設定<ol><li>クライオシャッターを撤回し、カラムバルブを開きます。 </li><li>舞台を中心に、15°±段階を揺するためにアルファワブラーを使用してユーセントリックの高さ（Z）を設定します。ステージが揺れている間に目立った動きがなくなるまでのZ位置を調整します。低用量のプログラムをアクティブにして、各モードの検出器を選択します。 </li><li>露出モードでは、炭素を有さないグリッドの領域を見つける記録する領域が完全に照明されるように、最適なコンデンサ絞りとスポットサイズを選択することによって、照明を調整します。 overcondensation方向にビームを広げるようにしてください。 </li><li>検索モードでは、より高い倍率で容易に識別されます小さな機能を見つける。露光モードでは、ジョイスティック（のxyステージコントローラ）でこの機能をセンタリング。偉業あれば低倍率で起動しますUREは視野にありません。 </li><li>検索モードでは、低用量のxy画像シフトコントロールを使用して、フィールドの中央には、この機能をもたらす。 （ - 3ミクロン0.5）露出モードに移動し、それが記録されるエリア外になるまで、ジョイスティックを使用して傾斜軸に沿って機能を移動します。モードを集中し、XY画像シフトコントロールを使用して機能を中央に移動します。特徴は視野にない場合に低倍率で起動します。 </li><li>常に中心としたビームにしてください。 </li></ol></li><li>データ収集<ol><li>クライオシャッターを撤回し、カラムバルブを開きます。低用量プログラムを起動します。 </li><li>検索モードでは、薄い、均質な氷を含むグリッドの正方形を識別する。 </li><li>適切な穴を選択し、フィールドの中央に配置します。モードを集中し、画像の焦点に切り替えます。 4.5ミクロン - 0.5間の画像アンダーフォーカス。 </li><li>露出モードに切り替えて、画像を記録する。 </li><li> 5.2.3-5.2.4モードを検索し、手順を繰り返して切り替えます。記録する前露光良い穴を避け、グリッドの正方形を横切って移動する。 </li><li>グリッドの正方形を終了し、別の良い1に移動する。 </li><li>高さ（Z）を再調整し、データ収集を継続する。 </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

SPA続いTEMは、所与の巨大分子のために、低解像度の3D構造は、第higher-が続いてもよいNSデータから決定され、一般的に、ミッド2014年EMDBで2000エントリに近づいて、多くの巨大分子の3D構造が寄与してい解像度cryoEM 3D構造。最初の3D再構成を容易にNSによって提供分子境界の高コントラストが、後で、完全に水和した状態で巨大分子、およびより高い解像度を達成する可能性の内部構造をマッピングする能力でcryoEMによって精製される。 cryoEMの別の利点は、巨大分子の崩壊につながる可能性が脱水ストレスの排除である。また、可能な表面吸収の影響を排除し、高分子が溶液中で採用ホメーションを示すカーボン担体を省略できる可能性がある。クライオネガティブ染色、cryoEM及びNSの組み合わせは、完全にhydは高コントラストを与える染色自体が巨大分子31の完全性を妨害する可能性があるため、評価試料ともSPAを使用して3D再構成をもたらすことができるが、しかし、それはより少ない頻度で部分的には、10未満EMDBのエントリで、使用されてきた。 3D再構成を助長する他の二つのTEM技術は、2D電子線結晶学と電子線トモグラフィーである。 2次元電子線結晶学は、平面または管状の結晶が必要です。結晶の電子回折は、潜在的に、原子分解能32に至る3次元再構成のために使用される。ビトリファイドまたは伝統的に固定した標本の電子線トモグラフィーでは、高分子またはサブ細胞成分は、単数形のオブジェクトを再構築することができるという利点と、その後の断層復興33のためのTEMの内側に回転させられる。現状では、この技術は、40〜34,35〜20オングストロームの範囲の解像限界を有する。すべてのこれらの分子のTEM技術の中で、NSとcryoEMデータのSPAは最も広くなっている使用。プロトコルは、ここに示したSPAの分析に適しcryoEM画像を取得するに専用されている。それにもかかわらず、プロトコルのほとんどはまたcryoEM 2Dの結晶断層サンプルに適用可能である。 成功cryoEMセッションは多くの重要なステップの組み合わせの成功に依存します。心に共通cryoEMアーチファクトの説明を続けると、それらを回避する方法の重要な側面は、以下の段落に記載されている。このセクションでは、SPA法を用いた高品質の3D再構成を得るために、データ収集のガイドラインが記載されている。 氷の結晶質への移行は避けてください。中央の側面サンプルはTEM観察を通してクライオ急落の瞬間からガラス状態に滞在する必要があることです。したがって、液体エタン中に試料を急落した後、全ての後続ステップは、液体窒素（-196℃）又は液体ヘリウム（-269℃）の温度で行われる。 -135℃以上に加温することで硝子体に水を変換する結晶性の水;その後、巨大分子再配列が行われてもよいし、水の結晶が画像（ 図3A）を支配する。サンプルは捨ててください。取り扱いピンセットが不十分前ならば偶然のサンプルウォームアップは、クライオプランジングは、TEMに（gridboxで保護されている場合でも）コンテナ、および/またはクライオホルダーの挿入の間に凍結されたグリッドの移動が遅すぎる場合に発生する、または可能性があり冷却された。クライオ転送時のTEMにおける重要な真空劣化（冷たいサンプルは暖かい入ってくる空気をトラップし）、サンプルを温めることがあります。最後に、過剰照射の試料は、結晶氷への移行につながる可能性があります。 氷の汚染を最小限に抑えます 。少量のサンプル（3-5μL）をTEMグリッドに適用さを考えると、蒸発が緩衝成分（塩、洗剤）を集中するため、多量体状態の損失を含む巨大分子整合性に影響を与える可能性があります。高い相対湿度（RH）の微小環境またはチャンバ回避sのこの問題。代わりクライオプランジングが十分に換気され 、環境低温室で行うことができます。クライオプランジRH後に自身がコールドトラップとして作用する低温グリッドとして、氷の汚染、または低温グリッド上の周囲の湿度の凝縮を防ぐために可能な限り低くすべきである。アイス汚染は高コントラスト、〜5 nmおよび妨害またはさえ完全に画​​像をブロック数ミクロンの間の範囲の大きさの無い部分構造を有する粒子で構成されています。空気転送時の低温グリッドに向けて/呼吸を話して、空気ドラフトを避け、周囲のRHを減らす。 （白懸濁粒子として見える）凝縮水とのオープン液体窒素容器も廃棄されるべきである。 巨大分子の向き/ビューを最大化します。サンプルのサポートについては、なされるべき選択は、真のホーリーグリッドとホーリーグリッド上に薄い炭素の間にある。これは、サンプルが炭素孔対炭素膜の上に広がる方法は、（i）、（ii）の利用可能なサンプルconceに依存ntration、裸の穴（約0.02〜2μM）から画像上の同様の粒子密度のために、炭素担体よりも100倍高い濃度を必要とすること、及び（iii）高分子の配向の分布がどのようにランダムである。炭素親水性となるようにグロー放電を、注意、すべての3つの面で重要な効果を有し、これは、サンプル依存すること。高解像度の3D再構成を改良する際再発ビューランダム円錐再建による初期構造決定のために望ましいが、巨大分子の配向については、高分子のビューのランダム性が望ましい。この例では、RyR1のは大好きな「4倍」ビュー（ 図2D）と炭素と相互作用し、配向のランダム性と高い解像度36ホーリー·グリッドが必要です。 SNR。SNRを増加するための最良の戦略は、ノイズのバックグラウンド源を減少させることで最大化する 。過度の氷厚さ及び（存在する場合）をサポートし、タンパク質は、余分なノイズが追加さ埋め込むために必要とされるものを超えた炭素膜の厚さ。したがって、氷の厚さは、ブロッティング時間、圧力、相対湿度、およびフィルター紙の品質を制御することにより、必要最小限に低減されるべきである。カーボン担体の場合は、薄い（〜5 nm）のカーボン膜が厚く、穴あきカーボン膜上に積層されている：サンプルは薄いカーボンで覆われた穴の上に結像されている間厚いホーリー炭素は機械的な抵抗を提供する。一方で、その非常に薄い氷の点に注意して、および/ ​​または炭素は、Web（ 図3D）になることができます簡単に壊れてサポートすることがあります。 SNRを最大化するために、不要な緩衝液成分は避けるべきである。膜タンパク質のために、洗剤は対照的に大きな打撃を与えた（ 図2D、右側のパネルを参照してください）かかり。表面張力を減少させることによりさらに界面活性剤は、サンプル支持体上に広がっている方法を変更します。いくつかの膜タンパク質は、detとに加えて、脂質の存在を必要とするさらにコントラストを低下させるergent、。これを克服するために、サンプルは、単に凍結急落37の前に低い界面活性剤濃度で脂質なしで緩衝液中に希釈することができる。新しい代替洗剤16および膜貫通ドメイン成分を安定化するナノディスク38の使用はcryoEMによる撮像膜タンパク質のための成功したアプローチであると思われる。 高品質の画像のために努力し、CTF補正のために準備する。ビトリファイド標本がなくはあり指していないもので、CTF、周波数に強度を関連付ける機能は、いくつかのゼロ遷移を持って十分な画像（位相）のコントラストを生成するために、高いデフォーカス値を必要とする情報。 CTF補正は、低解像度の3D再構成のために必要ではないが、より高い解像度を目指すとき、3Dオブジェクトの正確な表現を回復するために、異なるdefociの画像は、計算CTF補正を行うことができるように、収集される必要がある。CTFの決定及び補正は、主要なSPAソフトウェアパッケージ4-7に含まれています。詳細は別の場所で39見つけることができます。最適CTF補正のため、defociの範囲を使用。良い戦略は、3-4デフォーカス値の間で交互にある。値は、巨大分子のサイズに依存（大きいサイズが少なく、デフォーカスを必要とする）、氷/カーボンの厚さ（シンナーサンプルが少ないフォーカスを必要とする）、及び電圧（低電圧が少なく、デフォーカスが必要です）。 200 kVの場合、値の良い出発範囲は2.5、3、3.5と4μmのデフォーカスである。 CTFは、逆格子空間表現、パワースペクトルにおいて、高および低強度の環（トーンリング40）を交互として現れる。パワースペクトルを表示する解像度の可能性を明らかにする。最も広い可視のトーンリングの周波数は、達成可能な解像度の事前推定最も近い。パワースペクトルは、定期的にチェックし、乱視（非円形）のトーンリングされるべきである（ 図3C）は、客観的なスティグマを修正する必要があります。トーンリングは、少なくとも所望の解像度まで表示されるはずです。 このプロトコルを使用して得られたcryoEMデータセットを直接3D再構成を生成するために、SPAによって処理することができる。でも、理想的なサンプルで、3D再構成の品質がTEM機器の性能仕様の、画像処理に依存するであろう。これらの両方の前線の継続的な改善をし、最近開発された直接の電子検出器への特別な言及に、より一貫して、原子分解能での3D再構成を得る可能性は、それが今までにあったより近いです。

cryoEMの目標は、それらの天然の水和状態で巨大分子の電子顕微鏡像を得ることである。ガラス化した水に高分子の埋め込みによって、凍結、水和サンプルを直接TEM装置に導入し、可視化することができる。ガラス化は、凍結フラッシュ（10,000 Oの C /秒）によって達成、水の結晶化せずにサンプルを凍結し、凍結中の分子の再配列が重要であることを保証する。周囲のバッファについてのサンプルの電子散乱の過剰は、あらゆる汚れ1が存在しない場合に巨大分子を参照するには小さいながらも十分なコントラストを提供しています。コンピュータ化された画像処理は、その後、巨大分子の3次元構造を再作成するために使用することができる。 〜500 kDa-マルチMDA範囲の大きな高分子は、（電子顕微鏡データバンク（EMDB）エントリの80％以上に相当）cryoEMのための理想的なサンプルです。これらは、タンパク質、タンパク質複合体、タンパク質 - 核酸cを含むomplexes、および膜タンパク質は、脂質二重層に埋め込まれた。これらの高分子は、（PDBデータベースに2％未満のエントリで）結晶化しにくく、まだそれは、X線結晶学またはNMRによって解決小片がcryoEMによって作成された3Dエンベロープにドッキングすることができ、多くの場合そうである。一方、cryoEMによって解決最大の構造の一部が薄切片のTEM 2によって完全な細胞内で識別可能である。したがって、cryoEMが効果的に細胞内と原子構造間のサイズと解像度のギャップを埋める。 CryoEMは汚れ除外の領域が強く対比「負」の画像3を作成し、それによって巨大分子が脱水重金属汚れの層に囲まれてネガティブ染色のより古典的な方法（NS）、より優れた高分子の天然の構造を反映している。両方の場合において、電子ビームは、ここで、sは、粒子と呼ばれる、巨大分子の2次元投影画像を生成するHAPEは、電子ビームに対する巨大分子の配向に依存する。多くの粒子が、少なくとも〜1,000のない上限は、信号対雑音比（SNR）の平均も、信号を増加させるために、粒子の空間的配向パラメータを見つけるために「単粒子解析」（SPA）はソフトウェアをコンピュータ上で解析することができる逆投影4-7による巨大分子の3次元構造を再作成する必要がありました。 NSは、高いSNRで、予備試料の特徴付けのために使用され、 新規の三次元再構成を生成する。その解像度はめったに重金属粒の脱水とサイズによって課されている20オングストローム、超えない。一般に、cryoEM次元構造決定のために、低解像度の3D再構成は、最初NSから取得され、次いでcryoEMはさらに、その内部構造を見るために、その天然の水和状態で巨大分子を研究するために、この低解像度の最初のマップを改善するために使用されその解像度を向上させる。ノーTEそのNSモデルが歪んでいた（最も一般的な例は、脱水8起因する平坦化されている）とcryoEM粒子が低いSNR、その後歪みが低SNRで一般的なcryoEMモデル（モデルバイアスアーティファクト、に運ぶことができるがあった場合データセット9）。構造的なゆがみはNSとcryoEM原料粒子間及び生cryoEM粒子および平坦化方向に直交する3次元モデルの対応する突起間の不一致をもたらす。 3Dモデルは、連続した洗練サイクルを受けるなどのモデルバイアスはそれ自体で解決することがあります。その3Dモデルからの生cryoEM粒子と対応する突起間の対応関係の欠如が検出されるであろう、発生してはならないし、デノボモデルはcryoEMデータから構成されるべきである。良い方法は、可能な限り最高のcryoEMモデルを選択するいくつかの可能な3Dボリュームを生じ得る角度再構成アルゴリズム10を使用し、NS 3Dモデルを使用することができそれは、さらに洗練された11になります。より良い戦略は、（議論の専用セクションを参照してください）​​cryoEMデータセットのSNRを高めることである。 精製された巨大分子の生化学的品質は、最終的な結果で最大限の影響力を持っています。巨大分子、組織から精製されるか、または異種系において発現は、高純度を有し、構造的に無傷であることが必要である。これは、凝集体を形成するべきではないどちらもそれが分解しなければならない。特定のコンホメーションを定義するには、調製条件は、均一な立体配座状態を促進すべきである。複合体を研究するために、それはそうでなければ固定剤が正常より低い親和性相互作用12,13を安定化するために使用されており、それらのk Dは、nM範囲にあることが最適である。 未処理cryoEM画像は、寸法上の貴重な情報、概要、アグリゲーション/多量、均質性の状態、およびmacromolecuの内部構造をもたらすル。それにもかかわらず、技術の可能性を大幅に画像処理によって強化される。 3D構造は、巨大分子の全体的なアーキテクチャ、リガンド及びサブユニットの3D位置、立体構造変化を明らかにし、X線結晶学またはNMRによって決定原子構造のドッキングを可能にします。解像度が増加すると、3D再構成の情報量が段階的に増加させる。一般的に15〜20Åの分解能は原子構造の明確な結合を可能にする、9-10オングストロームのαヘリックスで5Åでそれを識別することが可能である、棒として表示されているβシート、及び3.5オングストロームより良いの解像度で、原子モデル14を構築することが可能である。 少なくとも0.05ミリグラム/ mlの3-5μlの一つTEMグリッドを調製するのに十分であるように、サンプルの比較的少量のSPAを使用して有益な画像と3次元再構成を得るための可能性は、cryoEM魅力的な手法にする。最低限のインストゥルメンタル要件cryoEMために自家製又は市販冷凍プランジャ、そのポンプステーション、グロー放電装置、及び蒸発器を有する超高真空、画像記録媒体及び低用量キット、クライオホルダー電子顕微鏡である。 TEMでの非必須しかしさらなる望ましい特徴（すべての近代のTEM内に存在する）は、CCDカメラまたは直接電子検出器、電界放射電子銃（FEG）、エネルギーフィルタリング、および高スループットのデータ収集ソフトウェアである。原則として、このソフトウェアは、しかし、増加したデータストレージの必要性及びそれに続く教師後処理時間が必要で考慮しなければ、単一cryoEMセッション15万の粒子の数千の収集を可能にする。コントラスト伝達関数（CTF）の補正と組み合わせFEGはαヘリックスを視覚化するのに十分な解像度に達したほとんどの3D再構成の基礎となる。その時点で、解像度のレベルはまた、サンプルに依存する：10Åの分解能に達すること、膜タンパク質のためのあまり一般的であるかのに対し、対称性の高い順序は、原子分解能がより実現可能である存在です。直接電子検出器の最近の開発は、低（4×）またはcryoEM電子密度マップの品質は、これらのX線回折データ16,17から導出一致しない対称性を有する巨大分子のための原子分解能を可能にした。 技術の機能を説明するための具体例としてはcryoEMが彼らの構造決定の継続チーフ役割を持っている巨大分子の4つの重要なタイプのためにここに提供されている。 60倍と忠実なと再現可能なアライメントを可能にする、その大きなサイズによって、データセットが増加し、その二十面体の対称性を有する（i）は、いくつかの正二十面体ウイルスの構造はSPA 18に続くcryoEM近く-原子分解能に解決されています。私たちは、cryoEMによる及びcryoEM / X線HYによるため、近接原子構造正二十面体ウイルス、アデノ随伴ウイルス（のAAV）、のクラスの例を示しているBRIDの方法は19,20存在する。 （II）らせん構造を持つ高分子は、微小管、フィラメントおよびウイルスが挙げられる。螺旋軸に沿ったそれらの繰り返し単位は、螺旋幾何21に適合SPAのより複雑なバージョンによって分析することができる。例では、タバコモザイクウイルス（TMV）、cryoEM 22により原子レベルの分解能に解決されたRNAウイルスを示す。 （iii）の大型の可溶性タンパク質が十分に研究されている。これらのうち、対称的な多量のシリンダを形成する巨大分子は、しばしば、サブナノメートルの分解能23,24で解か定期的なアーキテクチャを構成している。ここでは、KLH、ハイブリッド分子モデルがcryoEM / X線結晶学のハイブリッド法25から作成された無脊椎動物酸素運搬体の画像を示す。 （iv）の膜タンパク質は、タンパク質の重要なクラスである。これらは、ヒトゲノムによってコードされるタンパク質の約1/3を構成する、まだそれらは、trを伴う複雑に構造的に特徴付けることが困難である合わせた任意の構造技術によって解析された構造の1.5％未満を構成するansmembraneドメインの安定化26、。それらの構造決定におけるcryoEMと3D再構成の役割は、リアノジン受容体（RyRの）、筋収縮および脳シグナル伝達において重要な大きな真核細胞内Ca 2+チャネルを用いて例示されている。現在までの最高解像度cryoEM構造は、10Åの分解能で、二次構造27を明らかにする。

<table><tbody><tr><td>Ethane</td><td>Airgas</td><td>371745</td><td>99.99% purity very important, impurities can lead to high-contrast contaminants on the grid. CAUTION: flammable</td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td>Airgas</td><td>27135</td><td>99% purity. CAUTION: handling liquid nitrogen in a cold room poses a serious asphyxia hazard since nitrogen displaces oxygen without any warning signs.</td></tr><tr><td>Dumont no. 5 Antimagnetic tweezers</td><td>Ted Pella</td><td>5326</td><td></td></tr><tr><td>Mica sheets, 1 x 4 cm</td><td>Ted Pella</td><td>54</td><td></td></tr><tr><td>Graphite rods, presharpened size 1/8&amp;rdquo; dia x 2 &amp;frac14;&amp;rdquo; long tip 0.039&amp;rdquo; dia neck type</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70220-45</td><td></td></tr><tr><td>350 ml cryo-dewars</td><td>Pope</td><td>8600</td><td></td></tr><tr><td>Cu 400 mesh holey grids&amp;nbsp; Quantifoil</td><td>Quantifoil</td><td>Q10525</td><td></td></tr><tr><td>Cu 400 mesh holey grids C-Flat</td><td>Protochips</td><td>CF-1.2/1.3-4C</td><td></td></tr><tr><td>Glow discharge device</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Model E7620</td><td></td></tr><tr><td>Turbo pumping station</td><td>Gatan</td><td>Model 655</td><td></td></tr><tr><td>Carbon evaporator</td><td>Denton Vaccum</td><td>Model 502B</td><td></td></tr><tr><td>Freeze plunger</td><td>FEI</td><td>Vitrobot Mark IV</td><td></td></tr><tr><td>Transmission electron microscope 200 kV</td><td>FEI</td><td>Model Tecnai F20</td><td></td></tr><tr><td>CCD Camera 4k x 4k</td><td>Gatan</td><td>UltraScan 4000 UHS</td><td></td></tr><tr><td>Image Processing software CTFFIND3/CTFTILT</td><td></td><td></td><td>http://grigoriefflab.janelia.org/ctf</td></tr><tr><td>Image Processing software EMAN</td><td></td><td></td><td>http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2</td></tr><tr><td>Image Processing software Spider</td><td></td><td></td><td>http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</td></tr><tr><td>Image Processing software Freealign&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>http://grigoriefflab.janelia.org/frealign</td></tr><tr><td>3D visualization software Chimera</td><td></td><td></td><td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td></tr><tr><td>Native Keyhole Limpet Hemocyanin</td><td>Biosyn</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

do's and don'ts of cryo-electron microscopy: a primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3d reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules. 
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules. 
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.

図1に概説すべてのプロトコルステップを慎重に実行が凍結し、水和、非染色高分子の可視化を可能にします。異なる構造的特徴を持つ4つの代表的試験片の結果を示す。 NSとcryoEMの方法により得られる、それらの顕微鏡画像（ 図2）と比較される。 AAV5の（i）のNS画像は約130Åの直径のウイルス様粒子を明らかにする。フルと空の構造の共存はそれぞれ、（ステインエントリが許可されていることを）破壊し、構造的に無傷でキャプシドに相当する。 CryoEMを均一空の構造を示す。確かにこれらのウイルス粒子は遺伝物質28が含まれていません。 cryoEMが自分の正二十面体の形を反映して、主に六角形の粒子を示すのに対し、NSが優勢な丸い粒子を示す。 （II）の両方が見える23Åの螺旋の繰り返しで、多くの場合、長い0.1ミクロンより180オングストロームの直径と可変長の螺旋TMVショーの棒の画像を、NS中​​とcryoEMで。 40Å中央チャネルは、NS画像内の汚れとcryoEM画像内の空で満たされている。 （III）ネイティブKLH、8 MDAのdidecamerは、350オングストロームの直径と400オングストロームの長さの特性樽で組み立てる。 NSとcryoEMはKLHの長方形の側面図と円形のエンド意見を明らかにした。両方の技術は、6つの対称軸に垂直な条線と各階層内の等間隔の形態学的単位を明らかにした。 CryoEMは空の内部構造を明らかにする。 （iv）のリアノジン受容体、2.26 MDAの大きい四量体の細胞内チャンネルは、275のx 275Å2の正方形として見られる。そのような中央断面とNSによる汚れの蓄積など、及びcryoEM低い密度領域としてマニフェスト中央うつ病などの複雑な表面の特徴。 NSは、すべての4つの試験したサンプルにおいて同様のコントラストを示しているが、cryoEMパネルの比較が、この膜タンパク質を可溶化する界面活性剤の存在下にのRyR1の低いSNR（コントラスト）を露出させる。結晶質の氷、氷汚染、非点収差、ウェブ様構造（ 図3）：cryoEMアーティファクトの典型的な例は、RyR1のために示されている。その原因と予防は、さらなる議論の項に記載されている。 凍結された水和のRyR1のSPAおよび三次元再構成は、タンパク質のホモ四量体の組織（ 図4A）を反映し、その四重対称構造を、明らかにしている。細胞質ドメインは、275 X 275 X 120Å3の正方形の角柱を形成し、足場のような構造を形成するいくつかの再現性の球状ドメインが含まれています。膜貫通ドメインは、115 X 115×60Å3最大寸法が小さいテーパー正四角柱を形成している。 10Åの分解能ではαヘリックス（ 図4B）を可視化することが可能である。 3D差分マッピングは、この場合には、12 kDのタンパク質consideをFKBP12の3次元差分マップを重要なリガンドの位置を明らかにすることができるRyR1の赤色サブユニットは、RyR1の（ 図4C）29に重畳される。最後に、コンフォメーション変化は、巨大分子の動的なビューを提供します。この場合、以前クローズまたはオープンどちらの条件において安定化のRyR1は、閉鎖から開放状態（ 図4D）27質量転座を明らかにする。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52311/52311fig1.jpg" /> クライオ電子顕微鏡技術の図1のフロー図。図は、プロトコルの主なステップを強調しています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52311/52311fig2.jpg" /> 様々な試料のNSとcryoEMの2の比較図。 （A）AAV5、正二十面体ウイルス。（B）TMV、らせん状ウイルス。挿入図は23Åの螺旋の繰り返しを示している。（C）ネイティブKLH。（D）のRyR1。代表ビューは（F、四重ビューとs、側面図）をハイライト表示さ​​れます。全ての試料は、低用量条件下で200 kVの加速電圧下50,000Xの同じ倍率で画像化される。スケールバーは10nm。すべてのNSサンプルはカーボン担体上にあり、cryoEMサンプルA、C、Dはquantifoil上に薄い炭素上にあり、cryoEMサンプルBはquantifoil穴の真上にある。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52311/52311fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52311/52311fig3.jpg" /> のRyR1 cryoEMサンプルに共通cryoEMアーティファクトを示す画像図3.ギャラリー。 （A）結晶氷。（B）アイス汚染（矢印）。（C）、乱視。非点収差、画像内RyR1sはかろうじて見える。右の挿入図は、電力SPECTを示しています非対称のトーンリングとのイメージのラム酒。左の挿入図は、参考のために非乱視画像のパワースペクトルを示している。（D）は、Webのような構造。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52311/52311fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52311/52311fig4.jpg" /> リアノジン受容体の4 CryoEMと3D再図。 （A）isosurfaceの表現（B）原子座標とcryoEMエンベロープとの間の良好な一致を示すのRyR1のN末端​​30の結晶構造のドッキング。矢印は、構造体から突出して2つのαヘリックスを指す。矢じりは、イオンチャネルのポアを囲む4ヘリックスのいずれかを示している。点線は、膜の境界を示している。（C）のRyR1と3D見よFKBP12リガンド（オレンジ色）のカチオン。（D）オープン（黒メッシュ）配座に閉じた（オレンジ色）から行く中のRyR1の構造変化。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52311/52311fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

高分子の3次元再構成のための試料調製のプライマーおよび高品質データ収集：クライオ電子顕微鏡ののいいことといけないことをやる

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

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Research

JoVE Journal

Biology

46.0K ビュー.  Virginia Commonwealth University. This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

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Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at near-atomic resolution. In single-particle analysis, the vitrified sample is imaged by an electron beam and the detectors at the end of the microscope column produce movies of that sample. These movies contain thousands of images of identical particles in random orientations. The data need to go through an image processing workflow with multiple steps to obtain the final 3D reconstructed volume. The goal of the image processing workflow is to identify the acquisition parameters to be able to reconstruct the specimen under study. Scipion provides all the tools to create this workflow using several image processing packages in an integrative framework, also allowing the traceability of the results. In this article the whole image processing workflow in Scipion is presented and discussed with data coming from a real test case, giving all the details necessary to go from the movies obtained by the microscope to a high resolution final 3D reconstruction. Also, the power of using consensus tools that allow combining methods, and confirming results along every step of the workflow, improving the accuracy of the obtained results, is discussed.

Single-particle analysis in cryo-electron microscopy is one of the main techniques used to determine the structure of biological ensembles at high resolution. Scipion provides the tools to create the whole pipeline to process the information acquired by the microscope and achieve a 3D reconstruction of the biological specimen.

クリオEMとシピオンによる単粒子分析

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

生化学

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in situ. Owing to the strong interaction of an electron with the matter, high-resolution cryo-ET studies are limited to specimens with a thickness of less than 200 nm, which restricts the applicability of cryo-ET only to the peripheral regions of a cell. A complex workflow that comprises the preparation of thin cellular cross-sections by cryo-focused ion beam micromachining (cryo-FIBM) was introduced during the last decade to enable the acquisition of cryo-ET data from the interior of larger cells. We present a protocol for the preparation of cellular lamellae from a sample vitrified by plunge freezing utilizing Saccharomyces cerevisiae as a prototypical example of a eukaryotic cell with wide utilization in cellular and molecular biology research. We describe protocols for vitrification of S. cerevisiae into isolated patches of a few cells or a continuous monolayer of the cells on a TEM grid and provide a protocol for lamella preparation by cryo-FIB for these two samples.

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

We present a protocol for lamella preparation of plunge frozen biological specimens by cryo-focused ion beam micromachining for high-resolution structural studies of macromolecules in situ with cryo-electron tomography. The presented protocol provides guidelines for the preparation of high-quality lamellae with high reproducibility for structural characterization of macromolecules inside the&#160;Saccharomyces cerevisiae.

クライオ電子断層撮影のための サッカロミセス・セレビシエ の調製とクライオFIBマイクロマシニング

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The overall process involves i) vitrifying the specimen in a thin film supported on a cryoEM grid; ii) screening the specimen to assess particle distribution and ice quality; iii) if the grid is suitable, collecting a single particle dataset for analysis; and iv) image processing to yield an EM density map. In this protocol, an overview for each of these steps is provided, with a focus on the variables which a user can modify during the workflow and the troubleshooting of common issues. With remote microscope operation becoming standard in many facilities, variations on imaging protocols to assist users in efficient operation and imaging when physical access to the microscope is limited will be described.

Structure determination of macromolecular complexes using cryoEM has become routine for certain classes of proteins and complexes. Here, this pipeline is summarized (sample preparation, screening, data acquisition and processing) and readers are directed towards further detailed resources and variables that may be altered in the case of more challenging specimens.

単粒子クライオ電子顕微鏡:試料から構造まで

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method for structural biologists to determine high-resolution structures of a wide variety of macromolecules. Multiple software suites are available to new and expert users for image processing and structure calculation, which streamline the same basic workflow: movies acquired by the microscope detectors undergo correction for beam-induced motion and contrast transfer function (CTF) estimation. Next, particle images are selected and extracted from averaged movie frames for iterative 2D and 3D classification, followed by 3D reconstruction, refinement, and validation. Because various software packages employ different algorithms and require varying levels of expertise to operate, the 3D maps they generate often differ in quality and resolution. Thus, users regularly transfer data between a variety of programs for optimal results. This paper provides a guide for users to navigate a workflow across the popular software packages: cryoSPARC v3, RELION-3, and Scipion 3 to obtain a near-atomic resolution structure of the adeno-associated virus (AAV). We first detail an image processing pipeline with cryoSPARC v3, as its efficient algorithms and easy-to-use GUI allow users to quickly arrive at a 3D map. In the next step, we use PyEM and in-house scripts to convert and transfer particle coordinates from the best quality 3D reconstruction obtained in cryoSPARC v3 to RELION-3 and Scipion 3 and recalculate 3D maps. Finally, we outline steps for further refinement and validation of the resultant structures by integrating algorithms from RELION-3 and Scipion 3. In this article, we describe how to effectively utilize three processing platforms to create a single and robust workflow applicable to a variety of data sets for high-resolution structure determination.

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

This article describes how to effectively utilize three cryo-EM processing platforms, i.e., cryoSPARC v3, RELION-3, and Scipion 3, to create a single and robust workflow applicable to a variety of single-particle data sets for high-resolution structure determination.

クライオスパーク、リオン、サイピオンによる堅牢な単一粒子クライオ電子顕微鏡(クライオEM)処理ワークフロー

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ever-increasing share of published structural data. Recent advances in TEM technology and automation have boosted both the speed of data collection and quality of acquired images while simultaneously decreasing the required level of expertise for obtaining cryo-EM maps at sub-3 &#197; resolutions. While most of such high-resolution structures have been obtained using state-of-the-art 300 kV cryo-TEM systems, high-resolution structures can be also obtained with 200 kV cryo-TEM systems, especially when equipped with an energy filter. Additionally, automation of microscope alignments and data collection with real-time image quality assessment reduces system complexity and assures optimal microscope settings, resulting in increased yield of high-quality images and overall throughput of data collection. This protocol demonstrates the implementation of recent technological advances and automation features on a 200 kV cryo-transmission electron microscope and shows how to collect data for the reconstruction of 3D maps that are sufficient for de novo atomic model building. We focus on best practices, critical variables, and common issues that must be considered to enable the routine collection of such high-resolution cryo-EM datasets. Particularly the following essential topics are reviewed in detail: i) automation of microscope alignments, ii) selection of suitable areas for data acquisition, iii) optimal optical parameters for high-quality, high-throughput data collection, iv) energy filter tuning for zero-loss imaging, and v) data management and quality assessment. Application of the best practices and improvement of achievable resolution using an energy filter will be demonstrated on the example of apo-ferritin that was reconstructed to 1.6 &#197;, and Thermoplasma acidophilum 20S proteasome reconstructed to 2.1-&#197; resolution using a 200 kV TEM equipped with an energy filter and a direct electron detector.

High-resolution cryo-EM maps of macromolecules can be also achieved by using 200 kV TEM microscopes. This protocol shows the best practices for setting accurate optics alignments, data acquisition schemes, and selection of imaging areas that are all essential for the successful collection of high-resolution datasets using a 200 kV TEM.

200KV透過型電子顕微鏡を用いた高分解能クライオEMデータセットのルーチンコレクション

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure determination by SPA relies upon obtaining multiple distinct views of a macromolecular object vitrified within a thin layer of ice. Ideally, a collection of uniformly distributed random projection orientations would amount to all possible views of the object, giving rise to reconstructions characterized by isotropic directional resolution. However, in reality, many samples suffer from preferentially oriented particles adhering to the air-water interface. This leads to non-uniform angular orientation distributions in the dataset and inhomogeneous Fourier-space sampling in the reconstruction, translating into maps characterized by anisotropic resolution. Tilting the specimen stage provides a generalizable solution to overcoming resolution anisotropy by virtue of improving the uniformity of orientation distributions, and thus the isotropy of Fourier space sampling. The present protocol describes a tilted-stage automated data collection strategy using Leginon, a software for automated image acquisition. The procedure is simple to implement, does not require any additional equipment or software, and is compatible with most standard transmission electron microscopes (TEMs) used for imaging biological macromolecules.

The present protocol describes a generalized and easy-to-implement scheme for tilted single-particle data collection in cryo-EM experiments. Such a procedure is especially useful for obtaining a high-quality EM map for samples suffering from preferential orientation bias due to adherence to the air-water interface.

レギノンを用いたステージチルトを用いた単粒子クライオ電子顕微鏡データ収集

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...

Optimizing Sample Preparation for Cryogenic Electron Microscopy

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) has revolutionized structural biology by enabling the study of macromolecular structures in near-native conditions, suspended in vitreous ice. This technique allows for the high-resolution visualization of proteins and other biomolecules without the need for crystallization, offering significant insights into their function and mechanism. Recent advancements in single-particle analysis, coupled with improved computational data processing, have made cryo-EM an indispensable tool in modern structural biology. Despite its growing adoption, cryo-EM faces persistent challenges that can limit its effectiveness, particularly uneven particle distribution. This issue often leads to poor resolution and reduced accuracy in reconstructed protein structures. This article outlines a simple, practical approach to address this challenge, using the small heat-shock protein from Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) as an example. The method optimizes sample preparation to minimize preferential adsorption, ensuring more homogeneous particle distribution and higher-quality protein cryo-EM structures. This technique offers valuable guidance for researchers aiming to overcome similar challenges in structural studies.

This protocol presents a practical method using Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) as an example to address uneven particle distribution through sample preparation optimization, providing a reference for researchers to efficiently elucidate macromolecular structures using cryogenic electron microscopy (cryo-EM).

極低温電子顕微鏡のためのサンプル調製の最適化

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) has revolutionized structural biology by enabling the study of macromolecular structures in near-native ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

高圧急速凍結、マイクロ波を用いたコントラスト強調、およびボリューム イメージングのために埋め込む最小限の樹脂による生体試料作製

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

生物学

A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these techniques, cryo soft X-ray tomography (SXT) allows imaging whole cryo-preserved cells in the water window X-ray energy range (284-543 eV), in which carbon structures have intrinsically higher absorption than water, allowing the 3D reconstruction of the linear absorption coefficient of the material contained in each voxel. Quantitative structural information at the level of whole cells up to 10 &#181;m thick is then achievable this way, with high throughput and spatial resolution down to 25-30 nm half-pitch. Cryo-SXT has proven itself relevant to current biomedical research, providing 3D information on cellular infection processes (virus, bacteria, or parasites), morphological changes due to diseases (such as recessive genetic diseases) and helping us understand drug action at the cellular level, or locating specific structures in the 3D cellular environment. In addition, by taking advantage of the tunable wavelength at synchrotron facilities, spectro-microscopy or its 3D counterpart, spectro-tomography, can also be used to image and quantify specific elements in the cell, such as calcium in biomineralization processes. Cryo-SXT provides complementary information to other biological imaging techniques such as electron microscopy, X-ray fluorescence or visible light fluorescence, and is generally used as a partner method for 2D or 3D correlative imaging at cryogenic conditions in order to link function, location, and morphology.

Here, a protocol describing the sample preparation and data collection steps required in cryo soft X-ray tomography (SXT) to image the ultrastructure of whole cryo-preserved cells at a resolution of 25 nm half pitch, is presented.

クライオ軟X線断層撮影による細胞の3D地図作成記述

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these ...

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, frozen-hydrated state. However, cryo-ET requires that samples are thin enough to not scatter or block the incident electron beam. For thick cellular samples, this can be achieved by cryo-focused ion beam (FIB) milling. This protocol describes how to target specific cellular sites during FIB milling using a 3D-correlative approach, which combines three-dimensional fluorescence microscopy data with information from the FIB-scanning electron microscope. Using this technique, rare cellular events and structures can be targeted with high accuracy and visualized at molecular resolution using cryo-transmission electron microscopy (cryo-TEM).

Here, we present a pipeline for 3D-correlative focused ion beam milling on guiding the preparation of cellular samples for cryo-electron tomography. The 3D position of fluorescently tagged proteins of interest is first determined by cryo-fluorescence microscopy, and then targeted for milling. The protocol is suitable for mammalian, yeast, and bacterial cells.

高分解能クライオ電子線トモグラフィーのための3D相関集束イオンビームミリングによるサンプル調製

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...

高分子の3次元再構成のための試料調製のプライマーおよび高品質データ収集：クライオ電子顕微鏡ののいいことといけないことをやる

要約

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クリオEMとシピオンによる単粒子分析

クライオ電子断層撮影のためのサッカロミセス・セレビシエの調製とクライオFIBマイクロマシニング

単粒子クライオ電子顕微鏡:試料から構造まで

クライオスパーク、リオン、サイピオンによる堅牢な単一粒子クライオ電子顕微鏡(クライオEM)処理ワークフロー

200KV透過型電子顕微鏡を用いた高分解能クライオEMデータセットのルーチンコレクション

レギノンを用いたステージチルトを用いた単粒子クライオ電子顕微鏡データ収集

極低温電子顕微鏡のためのサンプル調製の最適化

高圧急速凍結、マイクロ波を用いたコントラスト強調、およびボリュームイメージングのために埋め込む最小限の樹脂による生体試料作製

クライオ軟X線断層撮影による細胞の3D地図作成記述

高分解能クライオ電子線トモグラフィーのための3D相関集束イオンビームミリングによるサンプル調製

高分子の3次元再構成のための試料調製のプライマーおよび高品質データ収集：クライオ電子顕微鏡ののいいことといけないことをやる

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クライオ電子断層撮影のための サッカロミセス・セレビシエ の調製とクライオFIBマイクロマシニング

単粒子クライオ電子顕微鏡:試料から構造まで

クライオスパーク、リオン、サイピオンによる堅牢な単一粒子クライオ電子顕微鏡(クライオEM)処理ワークフロー

200KV透過型電子顕微鏡を用いた高分解能クライオEMデータセットのルーチンコレクション

レギノンを用いたステージチルトを用いた単粒子クライオ電子顕微鏡データ収集

極低温電子顕微鏡のためのサンプル調製の最適化

高圧急速凍結、マイクロ波を用いたコントラスト強調、およびボリューム イメージングのために埋め込む最小限の樹脂による生体試料作製

クライオ軟X線断層撮影による細胞の3D地図作成記述

高分解能クライオ電子線トモグラフィーのための3D相関集束イオンビームミリングによるサンプル調製

クライオ電子断層撮影のためのサッカロミセス・セレビシエの調製とクライオFIBマイクロマシニング

高圧急速凍結、マイクロ波を用いたコントラスト強調、およびボリュームイメージングのために埋め込む最小限の樹脂による生体試料作製