Biz içtenlikle jel elektroforezi ile yardım Dr. Cindy N. Chiu teşekkür ve DNA ve sınırlama enzimi onların cömert bağış için Andy Zhou ve Michael Grodick. Biz minnetle ekipman ve malzeme cömert erişim için Profesör J. Heath ve Profesör D. Prober kabul. Biz yararlı öneriler Dr. Karn Sorasaenee teşekkür ederim. Biz video şematik genel olarak kullanılan illüstrasyon oluşturmak için Mary H. Tang teşekkür ederim. Fon Johnson &amp; Johnson ve BDT Y86786 tarafından sağlandı.

NOT: RNA çalışırken DNA ve RNA aşağılamak DNaz ve RNaz enzimleri tarafından kirlenmeyi önlemek için temiz bir çalışma ortamı sağlamak. Bu pipet uçları ve tüpler DNaz ve RNazsız olduğundan emin olun. Böyle bir dekontaminasyon solüsyonu vb pipetler, tüp sahipleri, gibi laboratuvar yüzeyleri ve ekipmanı silin da yararlıdır. Corrole Tedavi 1. RNA transkripsiyonu <ol><li> Corrole hazırlayın ve 0.01 inhibitör bileşikleri: [DNA]: [kompleksi] 1 mol oranında. NOT: 0.43 pmol DNA kullanılan DNA şablon E. liga geni ile APET-28c vektör oldu: Bizim durumumuzda, bu oran 4.3 finol karmaşık T7 promoterinin kontrolü altında E. coli. T7 promotörü ile diğer DNA aynı zamanda, transkripsiyon deneyi çalıştırmak için geçerli bir adaydır. <ol><li> Aktinomisin D, temiz, ayrı kaplar içinde Triptolide, tpfc ve dimetil sülfoksit içinde Ga (tpfc) (DMSO) içinde çözülür. [C: 1 molar oranında bir 0.01 nihai konsantrasyonu elde ediliromplex]: nükleaz içermeyen su ile seri dilüsyonları kullanılarak [DNA]. <ol><li> 1.8 ml DMSO içindeki 1 mg Aktinomisin D çözündürülür. Kısım 10, ayrı bir kaba ul ve 1/100 seyreltme oluşturmak için nükleaz içermeyen su ile 1 ml&#39;ye seyreltin. Kısım 1, ayrı bir kaba seyreltme ul 1 / 1,000 seyreltme oluşturmak için nükleaz içermeyen su ile 1 ml&#39;ye seyreltin. NOT: Aktinomisin D nihai çözüm konsantrasyonu 4.3 finol olduğunu. </li><li> 0.64 ml DMSO içindeki 1 mg Triptolide çözülür. Kısım 1, ayrı bir kaba ul 1 / 1,000 seyreltme oluşturmak için nükleaz içermeyen su ile 1 ml&#39;ye seyreltin. Kısım 1, ayrı bir kaba seyreltme ul ve bir ikinci 1 / 1,000 seyreltme oluşturmak için nükleaz içermeyen su ile 1 ml&#39;ye seyreltin. NOT: Triptolide nihai çözeltinin konsantrasyonu 4.3 finol olduğunu. </li><li> 2.9 ml DMSO içindeki 1 mg tpfc çözülür. 10 ul ayrı bir kapta ve nükleaz içermeyen su ile 1 ml&#39;ye seyreltin kısım 1/100 d oluşturmakilution. Kısım 1, ayrı bir kaba seyreltme ul 1 / 1,000 seyreltme oluşturmak için nükleaz içermeyen su ile 1 ml&#39;ye seyreltin. NOT: tpfc nihai çözeltinin konsantrasyonu 4.3 finol olduğunu. </li><li> 2.6 ml DMSO içindeki 1 mg Ga (tpfc) içinde çözülür. Kısım 10, ayrı bir kaba ul ve 1/100 seyreltme oluşturmak için nükleaz içermeyen su ile 1 ml&#39;ye seyreltin. Kısım 1, ayrı bir kaba seyreltme ul 1 / 1,000 seyreltme oluşturmak için nükleaz içermeyen su ile 1 ml&#39;ye seyreltin. NOT: Ga (tpfc) nihai çözeltinin konsantrasyonu 4.3 finol olduğunu. NOT: Bu corroles ve inhibitörler suda çözünür değildir ve daha önce DMSO içinde çözünmüş olmalıdır. (% 1) DMSO az miktarda hücreler (yayınlanmamış veri), sitotoksisiteye yol yoktur. </li></ol></li></ol></li><li> Önceki transkripsiyon reaksiyonu başlamadan, ayrı ayrı gerekli reaktifleri hazırlamak veya ticari bir satıcıdan bunları satın. <ol><li> Buz tüm dondu üzerinde çözülmen reaktifler (dondurulmuş reaktif bir listesi için Tablo 1&#39;e bakınız). </li><li> Tamamen çözelti içinde çözülene kadar karıştırın 10x reaksiyon tamponu ve 4 ribonükleotid (ATP, CTP, GTP ve UTP) çözümleri bekleyin. </li><li> Kısaca tüpün kenarına madde kaybını önlemek için tüm reaktifler santrifüj. Oda sıcaklığında 10x Reaksiyon Tamponu tutarken kez buz üzerinde, mağaza ribonükleotidleri çözülmüş. </li><li> Oda sıcaklığında transkripsiyon reaksiyonu için reaktif birleştirin (reaktif bir listesi Tablo 2 ye bakınız). NOT: Reaksiyon buz ziyade oda sıcaklığında monte ise 10x Reaksiyon Tampon spermidin şablon DNA coprecipitatlardan edebilirsiniz. </li><li> Tüp Flicking veya yukarı ve aşağı yavaşça karışımı pipetleme iyice karıştırın. Karıştırma işleminden sonra, kısaca santrifüj tüpünün tabanına bir reaksiyon karışımının toplanması için. </li><li> 2-4 saatlik bir toplam 37 ° C&#39;de, reaksiyon karışımı inkübe edin. NOT: Gerekli tepki süreleri değişirDNA şablonları, boyut ve dizi ile. Bu aşama, spesifik diziler için optimizasyon gerektirebilir. Kısa şablonları toplam RNA, yüksek verim için daha uzun reaksiyon süreleri gerekli olabilir. </li><li> -20 ° C de, her saat depo edilmesinden sonra her bir reaksiyon 4 ul alikotları çıkarın. İstenilen timepoints için gerektiği gibi değiştirin. </li></ol></li></ol> 2. RNA Spin kolon <ol><li> Transkripsiyon reaksiyonu takiben, bir mikrosantrifüj uyumlu kromatografi kolonları kullanarak, RNA yı temizler. Not:., RNA kolonlanyla kullanımı% 80&#39;den fazla iyileşme 20&#39;den fazla baz sonuçları ile RNA&#39;yı saflaştırmak için 44 Not: Kolon kromatografisi, RNA&#39;yı saflaştırmak için, yaygın ve uygun bir yöntemdir. Kloroform ekstraksiyonu, izopropanol çökeltme gibi diğer ticari olarak temin edilebilen kitler: Diğer saflaştırma yöntemleri, aynı zamanda, lityum klorür çökelmesi, fenol olarak mevcutturlar. <ol><li> Eşit şiddetle tersini kolon tampon Sephadex matris tekrar süspansiyonKolon, üç ya da daha çok kez. Keskin sütunu hafifçe vurarak bu yapın. </li><li> Sütununda üst kapağını çıkarın. Kap bazı kalıntı Sephadex matris olacaktır; kap matrisi ile dolu ise, kolona kapağını yerine takın ve matris çoğunluğu sütununda kadar önceki adımı tekrarlayın. </li><li> Kolonun alt ucunu çekin. NOT: Bazı sıvı sütunundan çıkabilir. </li><li> Sütun Paketi. <ol><li> Steril (RNaz&#39;ın ve Dnase ücretsiz) 1,5 ml mikrosantrifüj tüp içinde sütun yerleştirin. </li><li> 1 dakika boyunca 1.000 xg&#39;de bir masaüstü santrifüj tüp santrifüj. </li></ol></li><li> Kolondan taşınan tampon maddesi ile bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü atın. </li><li> Hemen yeni bir 1.5 mL steril mikrosantrifüj tüpü içinde sütun yerleştirin ve kolon yatağın merkezine örnek pipetle. Sütun aşırı yüklenmesini önlemek için numune 20-50 ul kullanın. </li><li> 1.000 xg&#39;de bir masaüstü santrifüj tüp santrifüj1 dakika karıştırıldı. NOT: yıkama sıvısı saflaştırılmış RNA örnek. </li></ol></li></ol> 3. Agaroz Jel Elektroforez (% 1 Agaroz Jel) 42 Not: Etidyum bromür, DNA ve RNA&#39;ya bağlanma üzerine fluoresces, bu nedenle, bu biyomoleküllerin 0.5 ug / ml etidyum bromür çözeltisi ile inkübe edilerek UV ışığı ile görselleştirilebilir. <ol><li> Su, 5 mg, etidyum bromür 10 ml eritilmesi ile, etidyum bromür (0.5 mg / ml) &#39;in bir 1,000x stok çözelti hazırlayın. </li><li> Jel elektroforezi için Tris Asetat EDTA (TAE) çalışan tampon hazırlayın. Bir 50x TAE tamponu, 2.0 M Tris-asetat, 0.05 M Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile birleştirmek ve pH değeri 8.5 olarak ayarlamak yapmak. </li><li> Tampon 1L 1x TAE 10 gr UltraPure Agaroz çözülmesi ve geleneksel bir mikrodalga fırında agarozun eritilmesi ile bir% 1 (ağırlık / hacim) agaroz jel hazırlayın. 50 ° C&#39;ye soğuduktan sonra,% 1 agaroz jel Solu için 1,000x etidyum bromid 1 ml ilaveyonu, yavaşça dönen ya da kapalı bir kap içinde baş aşağı çevirerek karıştırın, daha sonra, bir jel döküm platforma agaroz dökün ve jel oda sıcaklığında katılaşmaya sağlar. NOT: Etidyum bromür bir mutajen ve potansiyel kanserojendir. Eldiven giyin ve dikkatli çözümleri ele. Etidyum bromür uygun kullanım prosedürleri için, lütfen bkz: <a href="http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667">http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667</a> . </li><li> Jel katılaşmış sonra, elektroforez tankı set jel yerleştirin. Kuyular batık kadar jel karşılamak için yeterli TAE tamponu ekleyin. TAE tampon seviyesi yaklaşık 1 mm jel seviyesinden olup olmadığını kontrol edin. Jel tarağı çıkarın. NOT: kuyular batık sonra tarak Çıkarma kuyularda hapsolmak hava cepleri önler. </li><li> RNA örnekleri hazırlayın. 1 ul Jel Yükleme Tamponu ile arıtılan her bir örnek, tüm bölenin 1 ul birleştirme (ya da 1 ul 10x yükleme tamponu ve olduğu zaman dilüe olabilme ileed nükleaz içermeyen su ile 10 ul) ve bir mikropipet ile pipetleme ve aşağı iyice karıştırın. Not: 10x yükleme tamponu 20% Ficoll 400 0.1 M Na2EDTA, pH 8.0,% 1.0 SDS,% 0.25 bromofenol mavisi ihtiva eder. Mavi bromofenol kadar hızlı ~ 50 ila% ve çok uzun çalışır izlenmesi için yararlı olabilir,% 0.25 iksilen siyanol, aynı zamanda, yükleme tamponu ilave edilebilir. 42 </li><li> Dikkatle her bir dibine çözüm pipetleme her numune ile jel yükleyin. Herhangi bir hava kabarcıkları bırakın veya kuyuların arasındaki örnekleri karıştırmak için değil dikkat edin. NOT: RNA merdiveni de kopyasının büyüklüğünü tespit etmek için kullanılabilir. </li><li> DNA pozitif kurşun doğru jel içine göç böylece potansiyel takın. Istenilen seviyeye genellikle 1 ila 10 V / jel cm gerilimini ayarlayın. Ancak uzun süre jel ayrılık ilerlemesini izlemek için boyaların göç kullanarak RNA fragmanları arasındaki önemli ayrılık, için yeterlidir çalıştırın. NOT: 150 V yaklaşık 20 dakika sürer 8 cm x 8 cm jel ise, 250 V A 23 cm x 25 cm jel, yaklaşık 1 saat sürecektir. Yüksek gerilimlerde çalıştırdığınızda küçük RNA parçaları daha iyi çözünürlüğe sahip. </li><li> Yükleme tampon boya RNA fragmanları arasındaki ayırımı için yeterli karar mesafe göç zaman güç kaynağını kapatın. </li><li> Etidyum bromür UV ışık altında floresan RNA olacaktır Görüntü. </li><li> Görüntünün bir resim çekin ve her durumda saflaştırılmış RNA floresan yoğunluklarının karşılaştırılması. </li></ol> UV-Vis Spektroskopisi aracılığıyla 4. RNA Niceleme <ol><li> Bir NanoDrop 2000 veya benzeri makinede 2 ul H 2 O yerleştirin ve Boş ölçün. </li><li> Daha sonra, bir spektrometre ile reaksiyonu, saflaştırmanın ardından, her bir RNA örnek 2 ul, koyun ve 800 nm ila 200 nm arasında bir dalga uzunluğu aralığında UV-Vis ölçer. Not: 1.0 arasında bir bir 260 okuma RNA, yaklaşık 40 ug / ml &#39;ye eşit olan,ve saf RNA bir A 260 / 2.1 A 280 oranına sahiptir. 45 </li><li> Durumda, bu emme 1&#39;den OD az elde etmek için nükleaz içermeyen su numuneleri, seyreltik 1 OD üzerindedir. </li><li> Çeşitli örnekleri arsa ve 260 nm&#39;de OD karşılaştırmak için grafik yazılımı kullanın. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu deney, Ga (tpfc) eklenmesi bilinen DNA bağlayıcı antikanser kompleksleri Aktinomisin D ve Triptolide karşı kıyaslanabilir bir RNA transkripsiyonu inhibe ettiğini ortaya koymaktadır. Ga (tpfc) (GI 50 = 58,1-154,7 iM) sitotoksik davranışı onun engelleyici özellikleri nedeniyle olabilir. Herhangi bir transkripsiyon inhibisyonu tpfc görüldüğü için, tpfc sitotoksisitesi RNA transkripsiyon inhibisyonuna bağlı değildir, ancak henüz incelenmemiş başka bir şekilde kaynaklanır. <p class...

Kemoterapi genellikle istenmeyen yan etkiler ve sınırlı hedefleme ile geniş spektrumlu sitotoksik ajanlar içerir, ancak kanser biyolojisi daha iyi anlaşılması ile, yüksek kanser hedefleme etkinlik ve daha az yan etki ile antikanser ajanlar için giderek artan bir talep var. 1 İnsan kanser hücreleri sıklıkla haline Hayatta kalmak için tek aktif olduğu veya aşın onkogen bağlıdır. Bu nedenle 2, birçok anti-kanser ilaçları, RNA transkripsiyonu inhibe edebilme özelliği ile değerlendirildi. Bu dönüştürme genlerin ekspresyonunu bloke tedaviler kanser hücrelerini giderilmesinde etkilidir ve hücre ölümüne yol açar., Normal hücrelere tekabül eden 3&#39;ten Dönüştürülmüş hücreler, RNA transkripsiyonu ile bozulmalara karşı daha duyarlıdır. Selektif olarak inhibe eden beklenen transkripsiyonunu inhibe 4 Kansere karşı preparatlar kanser hücresi hayatta kalması için gerekli olan onkogenlerin tanım. 5 Sonuç olarak, RNA transkripsiyonunhibition potansiyel antikanser ilaç adayları belirlemek ve etki mekanizması hakkında daha fazla bilgi edinmek için kullanışlı bir yoldur. Bu protokol Ga (tpfc) kemoterapi ilaçları Aktinomisin D ve Triptolide aynı sipariş RNA transkripsiyonunu inhibe ettiğini göstermektedir; Benzer karşılaştırmalar için diğer anti-kanser ilaç adaylarının bu protokol kullanılarak yapılabilir. Aktinomisin D yaygın gestasyonel trofoblastik kanseri, testis kanseri, Wilm tümörü, rhabdomyosacoma tedavisinde kullanılan bir RNA transkripsiyon inhibitörüdür ve Ewing sarkomu 6. Ilk 1964.Triptolide FDA tarafından in vitro ve 30 yıldan beri çeşitli tümör taşıyan hayvan modellerinde incelenmiştir seçici transkripsiyon inhibitörü olan onaylanalı Aktinomisin D, yaklaşık elli yıl kanser terapisinde kullanılmaktadır. 7 corroles amfifilik makrosiklik doğası gibi küçük moleküller veya biyolojik olarak diğer ilaç sınıfları üzerinde önemli avantajlar kazandırırs. 8-14 makrosiklik karakter, büyük moleküller için beklenenden daha büyük olan hücre geçirgenliği sağlar ve bu tür proteinlerin, bu gibi makro-moleküler yüzeyler ile etkileşim için yeterince büyüktür. 8 Corroles biyomoleküller ile sıkı bir kovalent olmayan kompleksler oluşturdukları bilinmektedir ve uyuşturucu. corrole çerçevenin doğal sitotoksisiteye ilaveten, 10, gösterdiğimiz kemoterapötik maddeler için bir taşıyıcı moleküle, özellikle DNA-ara antrasiklin ilaç doksorubisin gibi sülfonatlı corrole vazifesi görür. Sülfonatlı corrole doksorubisin ile birlikte verilmesi, doksorubisin IC 50 olarak 3 misli bir artışı, DU-145 hücreleri için gözlenmiştir. 9 corrole çerçeve kararlıdır ve fonksiyonalize zaman, benzersiz bir absorbans değişimleri maruz doğal emme ve flüoresans özelliklerine sahip Bu tanımlama için kullanılabilir. skafoldun 10 işlevselleştirilmesi doğal affec değilseçici olarak esas itibarıyla biyolojik özelliklerini değiştirebilir corrole çerçevesini değiştirmeden, sülfonatlı corrole ile görüldüğü gibi, corrole, 9-15 fotofiziksel özelliklere t, ancak. 16: Daha önce yedi insan kanser hücresi türlerine karşı altı metallocorroles değerlendirildi. Sonuçlar, insan kanser hücrelerine karşı toksisitesi, belirli metal iyonu, hem de işlevsel grup ikamesine bağlı olduğunu göstermektedir. Örneğin, sülfonatlanmış galyum corroles yüksek hücre alımı deneyimli ve beyin, metastatik prostat kanseri hücrelerinin (DU-145), çekirdeği içine seçici bir şekilde nüfuz; için olandan başka hücre hatları çekirdek içine nüfuz etmez ama aynı corrole, meme için daha büyük bir sitotoksisite göstermektedir (MDA-MB-231), melanom (SK-MEL-28) ve yumurtalık (OVCAR-3) kanser hücreleri prostat kanseri. 9 Başlangıç ​​hücre bazlı deneyler, bu bileşiklerin bir anti-kanser terapötik maddeleri, hazırda esas olarak ümit göstermiştir göstermektediretki mekanizması içine er soruşturma. Deşifre inhibisyonu bazı organometalik kompleksler 17-27 ile gözlenen ve biz corrole ailenin sitotoksik davranışı için olası bir mekanizma olarak bu süreci incelemek için aranmaktadır. Bu transkripsiyon deneyi canlı hücrelerde bu moleküllerin etkileri hakkında daha detaylı bilgiye götürecek transkripsiyon engellenmesi, değerlendirmek için bir, basit, ucuz ve kolay bir yöntem sağlar. Burada, galyum transkripsiyon inhibisyonu (III) &#39;5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) ve serbest baz analog 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (Şekil 1) test edilmiştir. Bazı geçiş metali komplekslerinin farklı olarak, galyum (III) &#39;ün bir redoks aktif olduğunu ve bu nedenle, redoks göre metabolik yolların redoks işlemi de söz konusu değildir. 28 Ne olursa olsun, galyum (III)&#39; sitotoksik özellikler göstermektedir ve tedavi edici amaçlar için araştırılmıştır. Galyum platin sonra antikanser tedavi için ikinci en umut verici metal ve birçok çalışmalar ve araştırmalar uğramıştır; nitrat ve klor galyum tuzları hepatoma, lenfoma, mesane kanserleri, ve diğer hastalıklara karşı klinik çalışmalarda değerlendirilmiştir. 29-34 galyum (III) &#39;ün anti-kanser corrole çalışmalar için idealdir. İlk veriler (bakınız Şekil 2) Ga (tpfc) ve tpfc sahip olan çeşitli kanser hücresi çizgileri ile düşük Gl 50, maksimum hücre çoğalmasının% 50 inhibe etmek için gerekli ilaç konsantrasyonu olarak göstermektedir; Bu onların engelleyici özelliklerini belirlemek için bu iki bileşikler hakkında daha fazla deneyler geçerliliğini teyit eder. Biz ortak antikanser ilaçların Aktinomisin D ve Triptolide bu bileşikleri karşılaştırın. Aktinomisin D intercalates DNA, RNA uzamasını önler ve pikomolar konsantrasyonlarda belli hücre çizgisinde apoptoza neden 6,35-37 Triptolide tümör büyümesini inhibe ettiği gösterilmiştir.; insan XPB / ERCC3, bir alt-birim O bağlananf transkripsiyon faktörü TFIIH RNA polimeraz II aktivitesinin inhibisyonuna yol açar. 6-7,38-40 Yaygın corroles sitotoksik özellikler gösterdiği bilinir, işlevsellik kaynaklanan farklı mekanizmalar ile ilgili çok az bilgi mevcuttur. RNA transkripsiyonu Corrole engelleme biomacromolecules ile etkileşimlerine daha fazla fikir sunacak. Örneğin dirhodium DNA&#39;ya bağlandığı bilinen diğer kompleksler (II, III) kompleksleri, krom (III) kompleksleri, rutenyum (II) &#39;polypyridyl kompleksleri, rodyum (III) kompleksleri ve çeşitli diğerleri, 18 RNA transkripsiyon tahlile tâbi tutuldu 27 biomacromolecules ile olan etkileşimleri daha iyi anlaşılması ile sonuçlanır. Bu basit ve yaygın olarak kullanılan deney aynı zamanda, belirli bir molekülün sitotoksisite özelliklerini değerlendirmek ve olmadığını bu yararları daha da biyolojik testler belirlemek için iyi bir başlangıç ​​testidir. RNA transkripsiyon deneyi, aynı zamanda, varyin gibi birçok modifikasyon, sağlargr kullanılan bileşiğin veya bir enzim miktarıdır; inkübasyon süresi, tepkime süresi ve numune zaman noktaları olarak değişiklik göstermesi; ve bu nedenle potansiyel olarak büyük bir veri miktarını sağlayarak, ilgi konusu diğer değişkenler arasında, DNA şablon uzunluğu ve sekansı değişmektedir. Parçalar alınıp ayrı ayrı hazırlanabilir, ancak bu transkripsiyon deneyi, aynı zamanda tüm gerekli reaksiyon bileşenleri ile, uygun kitleri kolayca kullanılabilir. Bu deneylerde, yüksek verim için bilinen, ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanılır. 41 Agaroz jel elektroforezi ve UV-Vis spektroskopisi: transkripsiyon önlenmesini değerlendirmek için, biz iki yöntem kullanabilirsiniz. Agaroz jel elektroforezi, ayırma tanımlama ve arıtma 0.5- 25 kb&#39;lik bir DNA ve RNA parçaları için basit ve etkili bir yöntemdir. 42. UV-Vis spektroskopisi konsantrasyonuna ve RNA&#39;nın saflığı belirlemek için kullanılabilir. 43

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="809">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:219px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Actinomycin D</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1410</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C , protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triptolide</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T3652</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C , protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">nuclease-free H2O&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1334</td>
			<td>Store at &#8211;20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Ethidium Bromide</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E7637</td>
			<td>CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Tris Acetate</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">16500-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">mini Quick Spin RNA Columns</td>
			<td style="width:219px;">Roche Life Science</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11814427001</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C , do not freeze</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">1 kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:219px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">N3232S</td>
			<td>Store at &#8211;20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro enzymatic assay to measure transcription inhibition by gallium(iii) and h3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

Kemoterapi genellikle birçok yan etkileri ve sınırlı hedefleme ile geniş spektrumlu sitotoksik ajanlar içerir. Corroles kenetlenmiş metal fonksiyonel gruplar kimlikleri bağlı olarak belirli bir hücre hatlarında farklı sitostatik ve sitotoksik özellikleri sergileyen tetrapyrrolic makrosikllerin sınıfıdır. Belirli hücre hatları yönelik fonksiyonlandırılmış corroles benzersiz davranışı hedeflenen kemoterapi olasılığını tanıttı. Bir çok anti-kanser ilaçları, RNA transkripsiyonu inhibe edebilme özelliği ile değerlendirildi. Burada bilinen ve potansiyel inhibitörlerin varlığında RNA transkripsiyonu için adım adım protokol mevcut. jel elektroforezi ve UV-Vis spektroskopisi yoluyla transkripsiyon reaksiyonu RNA ürünlerin değerlendirilmesi, etki mekanizması ile ilgili daha fazla tahlil değişiklikler ile, potansiyel anti-kanser ilaç adaylarının önleyici özellikler hakkında bilgiler verir ve. Küçükcorrole sitotoksisite etkilerinin moleküler mekanizması tam olarak bilinmemektedir. Galyum (III) &#39;5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) ve serbest baz analog 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc): Bu deneyde, iki corrole bileşikleri göz önünde bulundurun. Bir RNA transkripsiyon tahlil corroles ve önleyici özelliklerini incelemek için kullanılmıştır. Beş transkripsiyon reaksiyonları hazırlanmıştır: sırasıyla 0.01, bir [şablon DNA baz] oranı ve tedavi edilmemiş kontrol: Bir [kompleks] at Aktinomisin D, Triptolide, Ga (tpfc), tpfc ile tedavi DNA. transkripsiyon reaksiyonları, agaroz jel elektroforezi ve UV-Vis spektroskopisi kullanılarak 4 saat sonra analiz edilmiştir. Ga (tpfc), Aktinomisin D, ve Triptolide tarafından açık engelleme vardır. Bu RNA transkripsiyon deneyi veya tamamlanıncaya ile DNA ya da polimeraz inkübe edilerek anti-kanser kompleksi, DNA, ya da polimeraz enziminin konsantrasyonları değiştirilerek daha mekanistik ayrıntı sağlamak için değiştirilebilirönce RNA transkripsiyonu için xes; Bu modifikasyonlar, DNA ya da enzim içeren bir inhibisyon mekanizması arasında ayrım olacaktır. RNA kopyalama komplekslerinin indirgeme olmadığını test ya da RNA&#39;yı hidrolize etmek için kullanılabilir sonra kompleks ekleme. Bu deney aynı zamanda ek anti-kanser adaylar incelemek için kullanılabilir.

Agaroz Jel Elektroforez ile Değerlendirilen RNA Transkripsiyon Nitelik Agaroz jel elektroforez görüntüye transkribe RNA kullanılmıştır. Etidyum bromür RNA 46 sağlayan görüntüleme (λ em 605 nm, λ ex = 210 nm, 285 nm =) bağlanması üzerine fluoresces. Jel koyu bantlar RNA&#39;nın yüksek konsantrasyonlarda karşılık gelmektedir. Aktinomisin D Triptolide ya da corrole kompleks RNA transkripsiyonu inhibe ederse, RNA üretimi a...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles at JoVE.com

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Galyum (III) &#39;ün 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole ve serbest baz analog düşük mikromolar hücre sitotoksisite arzetmemiştir. Bu yazıda corroles transkripsiyon inhibisyonunu değerlendirmek için, UV-Vis spektroskopisi ile bir RNA transkripsiyon reaksiyonu, etidyum bromür ile boyanmış jel ile görüntüleme RNA ve RNA miktarının açıklar ve antikanser aday özelliklerin değerlendirilmesi için basit bir yöntem ortaya koymaktadır.

Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Enzimatik Deneyi Galyum (III) ve H Transkripsiyon İnhibisyonunu Tedbir<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentaflüorofenil) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

an-vitro-enzymatic-assay-to-measure-transcription-inhibition

Research

JoVE Journal

Bioengineering

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

11.5K Görüntüleme.  California Institute of Technology.  Galyum (III) 'ün 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole ve serbest baz analog düşük mikromolar hücre sitotoksisite arzetmemiştir. Bu yazıda corroles transkripsiyon inhibisyonunu değerlendirmek için, UV-Vis spektroskopisi ile bir RNA transkripsiyon reaksiyonu, etidyum bromür ile boyanmış jel ile görüntüleme RNA ve RNA miktarının açıklar ve antikanser aday özelliklerin değerlendirilmesi için basit bir yöntem ortaya koymaktadır. 

Video: An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Matrix Modifikasyon Bağlı Hücresel Yapışma ve De-yapışma Real-time Değişiklikleri Tedbir Hücre-substrat Empedans ve Canlı Hücre Görüntüleme kullanma

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Biyomühendislik

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Yeniden İnşa İnsan Kornea gibi Epitelyal (RHCE) Doku Modeli kullanılarak Göz tahriş Kimyasalların Tehlike Tanımlaması Göz tahrişi Testi (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic physiological tear volumes.7 The traditional model also lacks the natural tear flow component and the blinking reflex, both of which are defining factors of the ocular environment. The development of a novel model is described in this study, which consists of a unique 2-piece design, eyeball and eyelid piece, capable of mimicking physiological tear volume. The models are created from 3-D printed molds (Polytetrafluoroethylene or Teflon molds), which can be used to generate eye models from various polymers, such as polydimethylsiloxane (PDMS) and agar. Further modifications to the eye pieces, such as the integration of an explanted human or animal cornea or human corneal construct, will permit for more complex in vitro ocular studies. A commercial microfluidic syringe pump is integrated with the platform to emulate physiological tear secretion. Air exposure and mechanical wear are achieved using two mechanical actuators, of which one moves the eyelid piece laterally, and the other moves the eyeballeyepiece circularly. The model has been used to evaluate CLs for drug delivery and deposition of tear components on CLs.

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Current in vitro models for evaluating contact lenses (CLs) and other eye-related applications are severely limited. The presented ocular platform simulates physiological tear flow, tear volume, air exposure and mechanical wear. This system is highly versatile and can be applied to various in vitro analyses with CLs.

Bir Gelişimi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Göz Platformu Lensler Test

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

bir<em&gt; İn Vitro</emKemirgen İntervertebral Disk&gt; Organ Kültürü Modeli

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.

Sıçan Vivo içinde kısmi karaciğer Dairesi'nde için bir temel olarak yeni bir cerrahi teknik

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

Kimyasal epigenetik değiştiriciler ile hücresel makine yeniden yönlendirerek Gen transkripsiyonu bastırmak

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Nano-formülasyonları endotoksin tespiti Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) deneyleri kullanarak

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

Multispectral görüntüleme akışı sitometrisi kullanarak In vitro micronucleus assay gerçekleştirmek için otomatik bir yöntem

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current in vitro screening models that have sufficient throughput only have limited physiological relevance, which hinders the translation of findings from in vitro to in vivo. On the other hand, microfluidic cell culture platforms have shown unparalleled physiological relevancy in vitro, but often lack the required throughput, scalability and standardization. We demonstrate a robust platform to study angiogenesis of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC-ECs) in a physiological relevant cellular microenvironment, including perfusion and gradients. The iPSC-ECs are cultured as 40 perfused 3D microvessels against a patterned collagen-1 scaffold. Upon the application of a gradient of angiogenic factors, important hallmarks of angiogenesis can be studied, including the differentiation into tip- and stalk cell and the formation of perfusable lumen. Perfusion with fluorescent tracer dyes enables the study of permeability during and after anastomosis of the angiogenic sprouts. In conclusion, this method shows the feasibility of iPSC-derived ECs in a standardized and scalable 3D angiogenic assay that combines physiological relevant culture conditions in a platform that has the required robustness and scalability to be integrated within the drug screening infrastructure.

This method describes the culture of iPSC-derived endothelial cells as 40 perfused 3D microvessels in a standardized microfluidic platform. This platform enables the study of gradient-driven angiogenic sprouting in 3D, including anastomosis and stabilization of the angiogenic sprouts in a scalable and high-throughput manner.

IPSC türetilmiş Endotel Hücrelerinin Perfüzyonlu 3D Anjiyojenik Filizlenmesini İn Vitro Olarak İncelemek Için Standart ve Ölçeklenebilir Tsay

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

Uzun Süreli Nanomalzeme Maruziyetini Takiben İn vitro Genotoksisite Testi için Gelişmiş 3D Karaciğer Modelleri

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...