Yazarlar EIT projeye adanmış yaptığı bilimsel destek ve zaman Dr John Harbell teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar ayrıca, Beiersdorf AG şirketi (Almanya), IIVS (ABD), Mary Kay Inc (ABD), Avon Products Inc (ABD), Procter &amp; Gamble / COSMITAL (İsviçre), Laboratoire Pierre Fabre (Fransa) teşekkür etmek istiyorum Harlan Laboratuvarları (United Kingdom), ve Göz tahrişi Testi 15 Multi-merkezi International Pre-Doğrulama ve doğrulama Çalışmaları katılım için LVMH Parfüm (Fransa).

<ol>
	<li>National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Request+for+Ocular+Irritancy+Test+Data+From+Human,+Rabbit,+and+In+Vitro+Studies+Using+Standardized+Testing+Methods.">Request for Ocular Irritancy Test Data From Human, Rabbit, and In Vitro Studies Using Standardized Testing Methods.</a> Federal Register. 72 (109), 31582-31583 (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+(EC)+No+1907/2006+of+the+European+Parliament+and+of+the+Council+of+18+December+2006+concerning+the+Registration,+Evaluation,+Authorisation+and+Restriction+of+Chemicals+(REACH),+establishing+a+European+Chemicals+Agency,+amending+Directive+1999/45/EC+and+repealing+Council+Regulation+(EEC)+No+793/93+and+Commission+Regulation+(EC)+No+1488/94+as+well+as+Council+Directive+76/769/EEC+and+Commission+Directives+91/155/EEC,+93/67/EEC,+93/105/EC+and+2000/21/EC.">Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council of 18 December 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH), establishing a European Chemicals Agency, amending Directive 1999/45/EC and repealing Council Regulation (EEC) No 793/93 and Commission Regulation (EC) No 1488/94 as well as Council Directive 76/769/EEC and Commission Directives 91/155/EEC, 93/67/EEC, 93/105/EC and 2000/21/EC.</a> OJ. L396 (49), 1-849 (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). , (2013).</li><li>Draize, J. H., Woodard, G., Calvery, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+Study+of+Irritation+and+Toxicity+of+Substances+Applied+Topically+to+the+Skin+and+Mucous+Membranes.">Methods for the Study of Irritation and Toxicity of Substances Applied Topically to the Skin and Mucous Membranes.</a> J Pharmacol Exp Ther November. 82, 377-390 (1944).</li><li>Adriaens, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+analysis+of+the+Draize+test+for+serious+eye+damage/eye+irritation:+importance+of+understanding+the+in+vivo+endpoints+under+UN+GHS/EU+CLP+for+the+development+and+evaluation+of+in+vitro+test+methods.">Retrospective analysis of the Draize test for serious eye damage/eye irritation: importance of understanding the in vivo endpoints under UN GHS/EU CLP for the development and evaluation of in vitro test methods.</a> Arch tox. 88, 701-723 (2014).</li><li>Balls, M., Botham, P. A., Bruner, L. H., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EC/HO+international+validation+study+on+alternatives+to+the+Draize+eye+irritation+test.">The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test.</a> Toxicol in Vitro. 9, 871-929 (1995).</li><li>Curren, R. D., Harbell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+safety:+a+silent+(in+vitro)+success+story.">Ocular safety: a silent (in vitro) success story.</a> Altern Lab Anim. 30, 69-74 (2002).</li><li>Wilhelmus, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Draize+Eye+Test.">The Draize Eye Test.</a> Survey of Ophthalmology. 45, 493-515 (2001).</li><li>Curren, R. D., Harbell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+alternatives+for+ocular+irritation.">In vitro alternatives for ocular irritation.</a> Environ health persp. 106, 485-492 (1998).</li><li>McCain, N. E., Binetti, R. R., Gettings, S. D., Jones, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+ocular+irritation+ranges+of+market-leading+cosmetic+and+personal-care+products+using+an+in+vitro+tissue+equivalent.">Assessment of ocular irritation ranges of market-leading cosmetic and personal-care products using an in vitro tissue equivalent.</a> Toxicologist. 66, 243 (2002).</li><li>Niranjan, P., Dang, A. H., January, B. G., Gomez, C., Harbell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+EpiOcular+assay+for+preclinical+qualification+of+formulas+for+human+clinical+studies.">Use of the EpiOcular assay for preclinical qualification of formulas for human clinical studies.</a> Toxicologist. 96, 249 (2007).</li><li>Yin, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+ocular+irritation+potential+of+surfactants-based+formulations+at+different+concentrations+using+the+EpiOcular+model.">Prediction of ocular irritation potential of surfactants-based formulations at different concentrations using the EpiOcular model.</a> Toxicologist. 108, 378 (2009).</li><li>Harbell, J., Curren, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+methods+for+the+prediction+of+ocular+and+dermal+toxicity.">In vitro methods for the prediction of ocular and dermal toxicity.</a> Handbook of Toxicology. , (2001).</li><li>Kaluzhny, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+EpiOcular(TM)+eye+irritation+test+for+hazard+identification+and+labelling+of+eye+irritating+chemicals+in+response+to+the+requirements+of+the+EU+cosmetics+directive+and+REACH+legislation.">Development of the EpiOcular(TM) eye irritation test for hazard identification and labelling of eye irritating chemicals in response to the requirements of the EU cosmetics directive and REACH legislation.</a> Altern Lab Anim. 39, 339-364 (2011).</li><li>Pfannenbecker, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cosmetics+Europe+Multi-Laboratory+Pre-Validation+of+the+EpiOcular+Reconstituted+Human+Tissue+Test+Method+for+the+Prediction+of+Eye+Irritation.">Cosmetics Europe Multi-Laboratory Pre-Validation of the EpiOcular Reconstituted Human Tissue Test Method for the Prediction of Eye Irritation.</a> Toxicol in vitro. , (2013).</li><li>MatTek Corporation. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EpiOcular™ Eye Irritation Test (OCL-200-EIT) for the prediction of acute ocular irritation of chemicals for use with Reconstructed Human EpiOcular Model (OCL-200-EIT). Protocol#MK-24-007-0055. , (2014).</li><li>Kaluzhny, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpiOcular+Eye+Irritation+Test+(EIT)+for+Hazard+Identification+and+Labeling+of+Eye+Irritating+Chemicals:+Protocol+Optimization+for+Solid+Materials+and+Extended+Shipment+Times.">EpiOcular Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification and Labeling of Eye Irritating Chemicals: Protocol Optimization for Solid Materials and Extended Shipment Times.</a> Altern Lab Anim. 43 (2), 101-127 (2015).</li><li>Kolle, S. N., Kandarova, H., Wareing, B., van Ravenzwaay, B., Landsiedel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-house+validation+of+the+EpiOcular(TM)+eye+irritation+test+and+its+combination+with+the+bovine+corneal+opacity+and+permeability+test+for+the+assessment+of+ocular+irritation.">In-house validation of the EpiOcular(TM) eye irritation test and its combination with the bovine corneal opacity and permeability test for the assessment of ocular irritation.</a> Altern Lab Anim. 39, 365-387 (2011).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstructed+Human+Cornea-like+Epithelium+(RhCE)+Test+Method+for+Identifying+Chemicals+Not+Requiring+Classification+and+Labelling+for+Eye+Irritation+or+Serious+Eye+Damage.+Draft+proposal+for+a+new+test+guideline..">Reconstructed Human Cornea-like Epithelium (RhCE) Test Method for Identifying Chemicals Not Requiring Classification and Labelling for Eye Irritation or Serious Eye Damage. Draft proposal for a new test guideline..</a> OECD Guideline for the Testing of Chemicals. , (2014).</li><li>Blazka, M. E., Harbell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+ocular+irritation+potential+of+54+test+articles+using+the+EpiOcular+Human+tissue+Construct+Model.">Evaluating the ocular irritation potential of 54 test articles using the EpiOcular Human tissue Construct Model.</a> Toxicol. In Vitro. , (2003).</li><li>Kandarova, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EpiDerm+Test+Protocol+for+the+Upcoming+ECVAM+Validation+Study+on+In+Vitro+Skin+Irritation+Tests+&#8212;+An+Assessment+of+the+Performance+of+the+Optimised+Test.">The EpiDerm Test Protocol for the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests &#8212; An Assessment of the Performance of the Optimised Test.</a> Altern Lab Anim. 33, 351-367 (2005).</li></ol>

Bu yazı için Yayın ücretleri Mattek Corporation tarafından ödendi.

Biz EpiOcular doku modeli için geliştirilen Göz tahrişi Testi (Şekil 1) sunduk. GHS Kategori ayırt etmez, burada sunulan EIT duyarlılığı ve özgüllüğü 17. EIT yüksek derecesi ile etiketleme (GHS yok Kategori) gerekmez malzemelerden göz tahriş edici ve korozif (GHS Kategori 1 ve 2 kombine) ayırmak mümkün 1 Kategori 2 kimyasallar. EIT sınıflandırma ve kozmetik ve farmasötik maddeler dahil olmak üzere kimyasal, geniş bir oküler tahriş potansiyelinin etiketlenmesi için doğrulanmıştır. In vitro testlerde diğer ile birlikte, EIT in vivo tavşan göz tahrişi testi için bir yedek olarak hizmet verecek. EIT maruz kalma ve maruz kalma sonrası kuluçka süresi (Şekil 1) uzunluğu değişir sıvı ve katı maddelerin, iki benzer ama farklı protokoller kullanmaktadır. EIT kullanılan son noktadaha önceden belirlenmiş bir insan epitel doku modellerinde 20,21 kullanılmıştır MTT testi ile tespit doku canlılığı vardır. Bu testte gerçekleştirmek için, standart hücre kültürü ekipmanları dışında hiçbir özel ekipman gerektirmez. Nedeniyle yüksek doku-doku tekrarlanabilirliği seviyesinde, n = 2 dokuların yerine, genellikle tavsiye n = 3 kullanılır. Yetenek n kullanmak = nedeniyle bireysel dokuların 14 farklı kullanım için, böylece ortaya çıkabilecek tahlil değişkenliği en aza deneyimli bir operatör aynı anda iki dokuları işlemek için izin verir çünkü 2 dokular, protokolün önemli bir yönüdür. Ayrıca, pozitif ve negatif kontroller ile birlikte, test maddesi başına n = 2 dokuları, aynı fiziksel durumuna (sıvı ya da katı madde), 10 test maddelerinin tahriş kullanarak, bir kit (24 dokular) kullanılarak değerlendirilebilir. Malzemelerin güvenilir sınıflandırılmasını sağlamak Diğer önemli noktalar pozitif kontrol su için özellikleri vardırbstance (doku canlılığı ≤50.0%), yinelenen dokularda (fark &lt;% 20.0) ve negatif kontrol OD okumaları (&gt; 0,8 ile &lt;2,5) arasındaki tekrarlanabilirlik. EIT testi yaparken kuluçka dönemlerinde protokol veya değişikliklerden sapma değişmiş sonuca neden olabilir, çünkü o, valide protokol ve önerilen doz ve durulama programları (Tablo 3 ve 4) kalınması önemlidir. Aynı şekilde, MTT inkübasyon için 3 saat süre sapmalar farklı MTT okumalarına neden olur ve tahlil sonucunu etkileyebilir. Bazen, bir test kimyasal MTT dokusu canlılığı deneyi veya MTT nedeni azaltılmasına engel olabilir, optik veya diğer özelliklere sahip olabilir. Örneğin, bir test bir kimyasal ile doğrudan mavi-mor reaksiyon ürünü olarak MTT azaltabilir veya MTT formazana (~ 570 nm) ile aynı aralıkta ışığı emen renkli bir madde olabilir. Ancak bu test kimyasalları pr olacakMTT tahlili esnasında, malzemenin yeterli miktarda de ince üzerinde mevcut olan (ya da tarafından emilen) ise, sadece bir sorun ESENT. Bu girişimi önlemek için, geniş durulama prosedürleri EIT protokole dahil edilmiştir. TA kaldırmaz durulama ve TA MTT azaltma karışıyorsa, ek kontroller tespit etmek için kullanılan ve bunun için doğru olmalıdır. Test kimyasal doğrudan MTT indirgemesi şüphesi varsa Kısaca, söz konusu kimyasal madde 50 ul (ya da katı maddeler için 50 mg), SCC (NC steril deiyonize su, 50 ul çalışma MTT çözeltisi ile 3 saat süre ile inkübe edilir, olmalıdır ) aynı anda çalışacak. MTT çözeltisi mavi-mor dönerse, test maddesi MTT azalttı tahmin edilmektedir. Bu durumda dondurularak öldürülmüş doku kontrolleri kullanarak işlevsel bir onay test malzemesi dokuya bağlanmasının ve bir sahte MTT indirgemesi bir sinyal verilmesine yol olup olmadığını değerlendirmek için gerçekleştirilmelidir. TA-maruz kalan, öldürülen doku kontrolünde kayda değer MTT azalma varsa(Tedavi edilmeyen canlı dokuda miktarına göre), test maddesi ortalama dokusu canlılığı öldürülmüş kontrolün ortalama canlılığını çıkarılarak düzeltilmelidir. Yalancı negatif sınıflandırmalar 14,15,18 azlığı gösterdiği gibi EIT, güvenlik tarafında errs. Önemlisi, göze aşındırıcı ve GHS Kategori 1 kimyasallar, hiçbiri, en ciddi oküler tehlike temsil Bu deneyde 14,15,18,19 olarak tahriş edici olmayan olarak sınıflandırılmıştır. Son olarak, nitro test yönteminde RHCE önemli avantajlarından biri düzgün sıvı ve (iki boyutlu, su altı hücre kültürleri ile mümkün değildir) katı maddeleri test olasılığıdır. EIT UN GHS sınıflandırma ve etiketleme sistemine göre geniş bir malzeme yelpazesi göz irritasyon potansiyelinin belirlenmesinde önemli ölçüde katkıda bulunacaktır. Hayvanların yerine o belirlenmesiküler toksisite yıllardır toksikolojik araştırma hedefi olmuştur. EIT test yöntemi 2014 yılında EURL ECVAM tarafından desteklenen bir resmi doğrulama çalışması yapmıştır ve EpiOcular EIT 2015 yılında OECD TG 492 olarak OECD test Rehberi içine uygulanmıştır.

Bu tür kozmetik, deterjan ve ev temizlik gibi tüketici ürünleri onlar gözlerle temas halinde ciddi hasar neden olabilir kimyasalların çeşitli içerir. Bu nedenle, göz tahrişi için bu ajanların test tüketici güvenliğini 1 sağlamak için ABD ve AB düzenleyici kurumlar tarafından talep edilir. Karışımlar ve formülasyonlar göz tahrişi potansiyelinin değerlendirilmesi, aynı zamanda kimyasalların taşınması için AB Kozmetik Direktifi altında kozmetik maddelerin etiketlenmesi için REACH (Kayıt, Değerlendirme, Yetkilendirme ve Kimyasalların Kısıtlanması) ile mevzuat uyum için bir gereklilik olduğunu ve için pestisit ve ev ürünleri 2 etiketlenmesi. Şu anda, düzenleyici kurumlar Kimyasalların Sınıflandırılması ve Etiketlenmesi (GHS) 3 Küresel Uyumlaştırılmış Sistemi kullanılarak göz tehlike değerlendirmesini gerektirir. GHS ağırlıklı Draize göz tahrişi testinde dayalı, en yaygın olarak kullanılan göz tahrişi deneyi hangi yabancı maddeler ve mildemirbaşlar Tavşan gözünde 4 katılgan zar kesesi içine, doğrudan eklenir. GHS sınıflamasına göre, GHS Kategori 1 (göz aşındırıcılar) göz dokularında veya maruz kalma 3,5 izleyen 21 gün içinde tam olarak geri dönüşlü olmayan göz ve görme ciddi hasar şiddetli başlangıç ​​yaralanmasına neden kimyasallar test eder. GHS Kategori 2 maruziyet 21 gün içinde tam olarak geri dönüşlü olan gözün önemli değişiklikler meydana kimyasallar test eder. Koroziflerin veya tahriş edici olmayan test kimyasalları GHS yok Kategori olarak adlandırılır. 40 yılı aşkın için, Draize tavşan gözü testi kendi tekrarlanabilirlik eksikliği, insani tepkilerin abartılması ve canlı hayvanların 5-8 kullanımı için eleştiriliyor. Bu kaygılar arıtma, indirgeme ve in vivo testte 9 değiştirilmesi için birçok önerilerde teşvik etmiştir. Valide hayvansal olmayan alternatifleri ihtiyacı daha da güçlendirildi(2009) Kozmetik (2005) kozmetik ürünlerinin güvenlik değerlendirmesinde hayvanların kullanılmasını yasakladı Direktifi ve malzemeyi Yedinci Değişiklik kabulü 2. 1996 yılından bu yana, yeniden kornea gibi doku modeli yaygın hammadde, yüzey aktif madde bazlı formülasyonların tahrişi potansiyelini değerlendirmek için, kozmetik endüstrisinde kullanılan ve kullanım için tasarlanmış karışımları birleşik veya gözün yakın olan 10-13. RHCE doku modelinin kullanılması doğal, sulandırılmamış formda doku yüzeyine test malzemesinin doğrudan topikal uygulama sağlar. Bu şekilde, suda çözünür olmayan formülasyonlar çözücüler ile inceltilmeden test edilebilir. Yaygın, uygulanabilir basit ve ekonomik yöntem için istek (Alternatif Yöntemler Doğrulama Avrupa Birliği Referans Laboratuarı Avrupa Merkezi) EURL ECVAM en cevaben Göz tahrişi Testi (EIT) bir singl kullanan hangie maruz kalma süresi ve etiketleme gerekmez malzemelerden göz tahriş edici ve korozif ayırmak mümkün (Şekil 1) 14 geliştirilmiştir. 83 kimyasalların (44 sıvılar ve 39 katı) için sonuçlara dayanarak, EIT 95.5 / 68.2 / ve% 81.8 duyarlılık / özgüllük ve doğruluk (SS &amp; A) sıvılar için, katılar için 100.0 / 68.4 / ve% 84.6 SS &amp; A ve 97,6 / elde 68.3 / ve genel SS &amp; A için% 83.1. 2007 yılında, EURL ECVAM himayesinde Kozmetik Avrupa&#39;da (eski Colipa) tarafından desteklenen bir multi-laboratuar öncesi doğrulama çalışması resmi doğrulama 15 o getirme hedefi ile EIT alaka ve güvenilirliğini değerlendirdi. Bu çalışmada, 298 bağımsız denemeler, yedi bağımsız laboratuvarda yapılmıştır. Çalışma sonuçları katılan tüm laboratuvarlar 15 arasında varyasyon düşük katsayılı tahmininde% 99.7 anlaşmasını gösterdi. Sonuç olarak, 2010 yılında EIT protokol resmi EURL ECVAM girdidoğrulama programı. Doğrulama çalışma, in vivo referans verileri (Draize tahrişi verileri) kullanılabilir hangi bireysel madde ve kimyasal karışımların da dahil olmak üzere 104 kodlu deney kimyasallar, kullandı. Bu çalışmanın başarısına dayanarak, OECD Taslak testi kılavuz It EIT UN GHS sınıflandırma ve etiketleme sistemine göre geniş bir malzeme yelpazesi göz irritasyon potansiyelinin sınıflandırılmasına önemli katkıda olacağı tahmin edilmektedir 2014 yılında sunuldu.

eye irritation test (eit) for hazard identification of eye irritating chemicals using reconstructed human cornea-like epithelial (rhce) tissue model

AB Kozmetik Direktifi ve AB REACH mevzuatına Yedinci Değişiklik uymak için, insanda göz toksisite güvenilir ve doğru değerlendirilmesi için geçerli olmayan hayvan alternatif yöntemlere ihtiyaç vardır. Bu ihtiyacı karşılamak için, biz bir göz tahrişi testi normal insan hücrelerine dayanan üç boyutlu yeniden insan kornea gibi epitel (RHCE) doku modelini kullanır (EIT) geliştirdik. EIT göz tahriş edici ve korozif (GHS Kategori 1 ve 2 kombine) ve etiketleme (GHS yok Kategori) gerekmez o ayrı yapabiliyor. Test, iki ayrı protokolleri, sıvı kimyasal ve katı deney ürünleri için, bir ikinci benzer protokol için tasarlanmış bir kullanır. EIT tahmin modeli, tek bir maruziyet süresi (sıvılar için 30 dakika, katı maddeler için 6 saat) ve tek bir doku canlılığı kesme (MTT testi ile tespit edildiği üzere% 60.0) kullanır. EIT 95.5 / 68.2 / ve% 81.8 sens elde (44 sıvılar ve 39 katı) 83 kimyasallar için sonuçlara dayanarakiTivity / özgüllük ve doğruluk (SS &amp; A) sıvılar için, katılar için / 68.4 100.0 / ve% 84.6, SS &amp; A, ve 97.6 / 68.3 / ve genel SS &amp; A için% 83.1. EIT düzenleyici test gereksinimlerini karşılamak için hayvanların kullanmadan sıvı ve katı kimyasalların geniş bir yelpazede göz irritasyon potansiyelini sınıflandırmak önemli katkıda bulunacaktır. EpiOcular EIT yöntemi TG 492 olarak OECD Test Rehberi içine 2015 yılında hayata geçirildi.

10 Test makaleleri (TA) ve negatif ve pozitif kontroller ile yapılan Temsilcisi EIT sonuçları Tablo 6 ve Şekil 3&#39;te sunulmuştur. NC% 100 doku canlılığı karşılık OD = 1.31 için, bu nedenle bilgisayar (OD ortalama = 0.41) ortalama vardı % 31,2 göreli doku canlılığı. EIT protokol katı pozlama protokolünü kullanarak, 4 laboratuvarda sıvı poz protokolü ve 8 bağımsız geçerli deneylerde kullanılarak 7 laboratuvarda 15 geçerli bağımsız deneylerde yapıldığında, sıvı protokolünü kullanarak PC için ortalama doku canlılığı 36.4 ± 4.0 idi ve% katı protokol için 32.3 ± 6.4%. Her durumda, pozitif kontrol sonuçları 60,0% 15 arasında kesme değerinin altında idi. Şekil 3&#39;te, TA1, TA2, TA4, TA7 gösterilen ve TA8 doku canlılıkları&gt; 60.0% vardı ve bu nedenle &quot;NI&quot; olarak sınıflandırıldı kadar. TA3, TA5, TA6, TA9 ve TA10 dokusu Yaşama kabiliyetleri X vardı04;% 60.0 ve bu nedenle &quot;ben&quot; olarak sınıflandırıldı. Yinelenen dokular arasındaki doku canlılığının fark TA2 bir istisna ile tüm TA için &lt;% 20.0 idi. Hepsi EIT kabul kriterlerini (Bölüm 10.2) tanıştığımızdan beri nedenle, TA2 bir istisna ile tüm test makaleleri, sonuçları, &quot;nitelikli&quot; olarak kabul edildi. Çünkü İlk deneyde, TA2 yinelenen dokular arasındaki yüksek değişkenlikten dolayı, ikinci bir deney kalifiye EIT sonuçları elde etmek için gerekli idi. Burada RHCE doku modeli kullanılarak açıklandığı gibi EIT test yöntemi EURL ECVAM / Kozmetik Europe 15,17-19 tarafından resmi doğrulama dahil olmak üzere birçok Multilaboratory geçerlilik çalışmalarında, oküler irritasyon değerlendirilmesi için kullanıldı. Çalışmaların tümünde, EIT tekrarlanabilir olduğu gösterilmiştir ve doğru kimyasallar (madde ve karışımlar her ikisi) göz tahrişi veya ciddi göz hasarı ac ​​için sınıflandırma ve etiketleme gerektirmeyen tespit başardıBM GHS 15,17-19 kadar Cording. EIT test yöntemi duyarlılık, özgüllük ve genel doğruluk için göz tahrişi için Doğrulama Yönetim Grubu (VMG) kabul kriterlerini yerine getirmiş ve şu anda in vivo tavşan Draize testi 19 için kısmi yerine resmi uygulanmasını bekliyor. <img alt="Figür 1" src="/files/ftp_upload/52979/52979fig1.jpg" /> Şekil 1: Sıvı ve katı deney ürünler için EIT protokol Anahat Kullanılan kısaltmalar: AM, tahlil ortamı;. SCC, standart kültür koşulları; PBS, Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin, RT, oda sıcaklığı. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52979/52979fig2.jpg" /> Şekil 2:. MTT dokusu canlılık testinde, standart 96 oyuklu plaka konfigürasyonu iki 200 ul tam bölünen miktarları, trabir ön-etiketli 96-kuyucuklu bir plakanın uygun oyuklarına nsferred. Kullanılan kısaltmalar: NC, negatif kontrol; PC, pozitif kontrol; TA1-TA20 test makaleleri 1-20; Blank, ekstraksiyon maddesi. 96- MTT plaka konfigürasyonu RHCE doku canlılığını ve EIT sonuçları hesaplamak için tasarlanmış Excel ile kullanılır. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52979/52979fig3.jpg" /> Şekil 3: EIT sonuçlar 10 deney makale, NC ve RHCE doku modeli kullanılarak PC kontrolleri için elde edilen grafik EIT sonuçlarını sunmak için tasarlanmış bir Excel elektronik oluşturulur.. NC 60.0 oranla% ≤ doku canlılığını azaltılmış test kimyasalları &quot;tahriş edici (&quot; I &quot;, TA3, TA5, TA6, TA9 ve TA10) ve doku canlılığı&gt; 60.0% non-Tahriş olarak sınıflandırılır vardı test kimyasalları (olarak sınıflandırılır NI &quot;, TA1, TA2, TA4, TA7 ve TA8). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="7"> EIT protokol iş adımları için zaman (bir operatör için bir günlük iş) başlatın </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Her bir satır dokuların bir çift tekabül </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Adımların sırası: </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Sıvılar: </td><td> PBS </td><td> TA Pozlama </td><td> Sonrası Islatmak </td><td> Sonrası <td> MTT Reaksiyon </td><td> MTT Ekstraksiyon </td><td> Tedbir </td></tr><tr><td></td><td> 30 dakika </td><td> 30 dakika </td><td> 12 dk </td><td> 120 dakika </td><td> 180 dakika </td><td> 120 dakika </td><td> OD </td></tr><tr><td> NC </td><td> 09:00 </td><td> 09:30 </td><td> 10:00 </td><td> 10:12 </td><td> 00:12 </td><td> 15:12 </td><td> sonra </td></tr><tr><td> PC </td><td> 09:01 </td><td> 09:31 </td><td> 10:01 </td><td> 10:13 </td><td> 00:13 </td><td> 15:13 </td><td> 17:30 </td></tr><tr><td> TA-1 </td><td> 09:02 </td><td> 09:32 </td><td> 10:02 </td><td> 10:14 </td><td> 00:14 </td><td> 15:14 </td><td></td></tr><tr><td> TA-2 &lt;/ strong&gt; </td><td> 09:03 </td><td> 09:33 </td><td> 10:03 </td><td> 10:15 </td><td> 00:15 </td><td> 15:15 </td><td></td></tr><tr><td> TA-3 </td><td> 09:04 </td><td> 09:34 </td><td> 10:04 </td><td> 10:16 </td><td> 00:16 </td><td> 15:16 </td><td></td></tr><tr><td> TA-4 </td><td> 09:05 </td><td> 09:35 </td><td> 10:05 </td><td> 10:17 </td><td> 00:17 </td><td> 15:17 </td><td></td></tr><tr><td> TA-5 </td><td> 09:06 </td><td> 09:36 </td><td> 10:06 </td><td> 10:18 </td><td> 00:18 </td><td> 15:18 </td><td></td></tr><tr><td> TA-6 </td><td> 09:07 </td><td> 09:37 </td><td> 10:07 </td><td> 10:19 </td><td> 00:19 </td><td> 15:19 </td><td></td></tr><tr><td> TA-7 </td><td> 09:08 </td><td> 09:38 </td><td> 10:08 </td><td> 10:20 </td><td> 00:20 </td><td> 15:20 </td><td></td></tr><tr><td><stro<html> ng&gt; TA-8 </td><td> 09:09 </td><td> 09:39 </td><td> 10:09 </td><td> 10:21 </td><td> 00:21 </td><td> 15:21 </td><td></td></tr><tr><td> TA-9 </td><td> 09:10 </td><td> 09:40 </td><td> 10:10 </td><td> 10:22 </td><td> 00:22 </td><td> 15:22 </td><td></td></tr><tr><td> TA-10 </td><td> 09:11 </td><td> 09:41 </td><td> 10:11 </td><td> 10:23 </td><td> 00:23 </td><td> 15:23 </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 3:. Sıvı test maddelerinin test için örnek zaman çizelgesi de dahil olmak üzere Protokol adımları ön ıslatma DPBS Test Makaleler Uygulama (TA), durulama ve dokuları ile Post-ıslatın, Post-kuluçka dönemi, MTT deneyi, MTT çıkarması, ve MTT OD ölçümü sütunlarında sunulmuştur. Yinelenen dokular için Vakitleri sıralar halinde düzenlenmiştir. Tüm tahlil test 10 TA ve kontroller bir günde bitmiş olabilir. e_content &quot;&gt; <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" height="439" width="582"><tbody><tr><td colspan="6"> (2 gün, bir operatör için çalışmak) EIT protokol adımlar için başlangıç ​​zamanı </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Her bir satır dokuların bir çift tekabül </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1.gün </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> 2. Gün (ertesi gün) </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Adımların sırası: </td><td> 1 </strong&gt; </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Katılar: </td><td> PBS </td><td> TA Pozlama </td><td> Sonrası Islatmak </td><td> Sonrası Incubaction </td><td> MTT Reaksiyon </td><td> MTT Ekstraksiyon </td><td> Tedbir </td></tr><tr><td></td><td> 30 dakika </td><td> 6 saat </td><td> 26 dk </td><td> 18 saat </td><td> 180 dakika </td><td> 120 dakika </td><td> OD </td></tr><tr><td> NC </td><td> 09:00 </td><td> 09:30 </td><td> 15:30 </td><td> 15:56 </td><td> 09:56 </td><td> 00:56 </td&gt; <td> sonra </td></tr><tr><td> PC </td><td> 09:02 </td><td> 09:32 </td><td> 15:32 </td><td> 15:58 </td><td> 09:58 </td><td> 00:58 </td><td> 15:30 </td></tr><tr><td> TA-1 </td><td> 09:04 </td><td> 09:34 </td><td> 15:34 </td><td> 16:00 </td><td> 10:00 </td><td> 13:00 </td><td></td></tr><tr><td> TA-2 </td><td> 09:06 </td><td> 09:36 </td><td> 15:36 </td><td> 16:02 </td><td> 10:02 </td><td> 13:02 </td><td></td></tr><tr><td> TA-3 </td><td> 09:08 </td><td> 09:38 </td><td> 15:38 </td><td> 16:04 </td><td> 10:04 </td><td> 13:04 </td><td></td></tr><tr><td> TA-4 </td><td> 09:10 </td><td> 09:40 </td><td> 15:40 </td><td> 16:06 </td><td> 10:06 </td><td> 13:06 </td><td></td></tr><tr><td> TA-5 </td><td> 09:12 </td><td> 09:42 </td><td> 15:42 </td><td> 16:08 </td><td> 10:08 &lt;/ td&gt; <td> 13:08 </td><td></td></tr><tr><td> TA-6 </td><td> 09:14 </td><td> 09:44 </td><td> 15:44 </td><td> 16:10 </td><td> 10:10 </td><td> 13:10 </td><td></td></tr><tr><td> TA-7 </td><td> 09:16 </td><td> 09:46 </td><td> 15:46 </td><td> 16:12 </td><td> 10:12 </td><td> 13:12 </td><td></td></tr><tr><td> TA-8 </td><td> 09:18 </td><td> 09:48 </td><td> 15:48 </td><td> 16:14 </td><td> 10:14 </td><td> 13:14 </td><td></td></tr><tr><td> TA-9 </td><td> 09:20 </td><td> 09:50 </td><td> 15:50 </td><td> 16:16 </td><td> 10:16 </td><td> 13:16 </td><td></td></tr><tr><td> TA-10 </td><td> 09:22 </td><td> 09:52 </td><td> 15:52 </td><td> 16:18 </td><td> 10:18 </td><td> 13:18 </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 4: Katı Test maddelerinin test için örnek zaman çizelgesi. Dahil Protokol adımlar ön ıslatma Durulama ve Post-ıslatın Post-kuluçka dönemi, MTT deneyi, MTT Ekstraksiyon ve MTT OD ölçümü sütunlarında sunulmuştur DPBS&#39;de Test Makaleler Uygulaması ile dokuları. Yinelenen dokular için Vakitleri sıralar halinde düzenlenmiştir. 10 TA ve kumanda elemanlarının kontrol edilmesi Bütün tahlil, bir, iki günlük bir süre boyunca gerçekleştirilir. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Miktar </td><td> Ayıraç </td><td> Saklama Koşulları </td><td> Kaynak </td><td> Tanım </td><td> Son kullanma tarihi </td></tr><tr><td> 1 flakon, 2 mi </td><td> MTT Konsantre (MTT-100-CON) </td><td> Işıktan koruyarak (-20ºC) </td><td> Mattek </td><td> Dondurulmuş MTT konsantre </td><td> 2 ay </td></tr><tr><td> 1 flakon, 8 mi </td><td> MTT seyreltici </td><td> 2-8-# 186; C </td><td> Mattek </td><td> MTT konsantrasyonuna seyreltilmesi için, önceden MTT tahlilinde kullanma </td><td> 2 ay </td></tr><tr><td> 1 şişe, 60 mi </td><td> İsopropanol (CAS # 67-63-0) </td><td> RT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Ekstraksiyon maddesi </td><td> NA </td></tr></tbody></table> Tablo 5: MTT-100 Assay Kit Bileşenleri. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Kod N ° </td><td> Doku </td><td colspan="2"> İşlenmemiş veri </td><td colspan="2"> Boş düzeltilmiş veri </td><td rowspan="2"> OD demek </td><td rowspan="2"> Canlılığının% </td></tr><tr><td></td><td> n </td><td> Aliq. 1 </td><td> Aliq. 2 </td><td> Aliq. 1 </td><td> Aliq. 2 </td></tr><tr><td> NC </td><td>1 </td><td> 1,316 </td><td> 1,352 </td><td> 1,316 </td><td> 1,352 </td><td> 1,334 </td><td> 101.6 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1,277 </td><td> 1,309 </td><td> 1,277 </td><td> 1,309 </td><td> 1,293 </td><td> 98.4 </td></tr><tr><td> PC </td><td> 1 </td><td> 0,379 </td><td> 0.397 </td><td> 0,379 </td><td> 0.397 </td><td> 0.388 </td><td> 29.6 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0.419 </td><td> 0,442 </td><td> 0.419 </td><td> 0,442 </td><td> 0,431 </td><td> 32.8 </td></tr><tr><td> TA1 </td><td> 1 </td><td> 1,213 </td><td> 1,244 </td><td> 1,213 </td><td> 1,244 </td><td> 1,229 </td><td> 93.5 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1,355 </td><td> 1,355 </td><td> 1,355 </td><td> 1,355 </td><td> 1,355 </td><td> 103.2 </td></tr><tr><td> TA2 </td><td> 1 </td><td> 1,210 </td><td> 1,122 </td><td> 1,210 </td><td> 1,122 </td><td> 1,166 </td><td> 88.7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,828 </td><td> 0,837 </td><td> 0,828 </td><td> 0,837 </td><td> 0,833 </td><td> 63.4 </td></tr><tr><td> TA3 </td><td> 1 </td><td> 0,167 </td><td> 0.168 </td><td> 0,167 </td><td> 0.168 </td><td> 0,167 </td><td> 12.7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0.138 </td><td> 0.136 </td><td> 0.138 </td><td> 0.136 </td><td> 0.137 </td><td> 10.4 </td></tr><tr><td> TA4 </td><td> 1 </td><td> 1,137 </td><td> 1,160 </td><td> 1,137 </td><td> 1,160 </td><td> 1,149 </td><td> 87.4 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1,262 </td><td> 1,191 </td><td> 1,262 </td><td> 1,191 </td><td> 1,227 </td><td> 93.4 </td></tr><tr><td> TA5 </td><td> 1 </td><td> 0.610 </td><td> 0,621 </td><td> 0.610 </td><td> 0,621 </td><td> 0.616 </td><td> 46.9 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0.480 </td><td> 0.484 </td><td> 0.480 </td><td> 0.484 </td><td> 0.482 </td><td> 36.7 </td></tr><tr><td> TA6 </td><td> 1 </td><td> 0,502 </td><td> 0,513 </td><td> 0,502 </td><td> 0,513 </td><td> 0.508 </td><td> 38.7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0.396 </td><td> 0.407 </td><td> 0.396 </td><td> 0.407 </td><td> 0.402 </td><td> 30.6 </td></tr><tr><td> TA7 </td><td> 1 </td><td> 1,048 </td><td> 1,050 </td><td> 1,048 </td><td> 1,050 </td><td> 1,049 </td><td> 79.9 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1,149 </td><td> 1.150 </td><td> 1,149 </td><td> 1.150 </td><td> 1.150 </td><td> 87.5 </td></tr><tr><td> TA8 </td><td> 1 </td><td> 1,032 </td><td> 1,034 </td><td> 1,032 </td><td> 1,034 </td><td> 1,033 </td><td> 78.7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,941 </td><td> 0.935 </td><td> 0,941 </td><td> 0.935 </td><td> 0,938 </td><td> 71.4 </td></tr><tr><td> TA9 </td&gt; <td> 1 </td><td> 0.022 </td><td> 0.022 </td><td> 0.022 </td><td> 0.022 </td><td> 0.022 </td><td> 1.7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0.144 </td><td> 0.149 </td><td> 0.144 </td><td> 0.149 </td><td> 0,147 </td><td> 11.2 </td></tr><tr><td> TA10 </td><td> 1 </td><td> 0.150 </td><td> 0.150 </td><td> 0.150 </td><td> 0.150 </td><td> 0.150 </td><td> 11.4 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0.254 </td><td> 0.255 </td><td> 0.254 </td><td> 0.255 </td><td> 0.255 </td><td> 19.4 </td></tr></tbody></table><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> ortalama </td><td> Dif. </td><td> ortalama </td><td> Dif. </td><td> Dif. / 2 </td><td colspan="2"> Sınıflama </td></tr><tr><td></td><td> OD </td><td> OD </td><td> Yaşama kabiliyetleri [%] </td><td> canlılığında bir </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NC </td><td> 1,314 </td><td> 0.041 </td><td> 100.0 </td><td> 3.12 </td><td> 1.56 </td><td> NI </td><td> nitelikli </td></tr><tr><td> PC </td><td> 0.410 </td><td> 0.043 </td><td> 31.2 </td><td> 3.23 </td><td> 1.62 </td><td> BEN </td><td> nitelikli </td></tr><tr><td> TA1 </td><td> 1,292 </td><td> 0.127 </td><td> 98.3 </td><td> 9.63 </td><td> 4.81 </td><td> NI </td><td> nitelikli </td></tr><tr><td> TA2 </td><td> 0.999 </td><td> 0.333 </td><td> 76.1 </td><td> 25.36 </td><td> 12.68 </td><td> NI </td><td> D&gt; 20 </td></tr><tr><td> TA3 </td><td> 0.152 </td><td> 0.030 </td><td> 11.6 </td><td> 2.32 </td><td> 1.16 </td><td> BEN </td><td> nitelikli </td></tr><tr><td> TA4 </td><td> 1,188 </td><td> 0.078 </td><td> 90.4 </td><td> 5.94 </td><td> 2.97 </td><td> NI </td><td> nitelikli </td></tr><tr><td> TA5 </td><td> 0,549 </td><td> 0.134 </td><td> 41.8 </td><td> 10.16 </td><td> 5.08 </td><td> BEN </td><td> nitelikli </td></tr><tr><td> TA6 </td><td> 0,455 </td><td> 0.106 </td><td> 34.6 </td><td> 8.07 </td><td> 4.03 </td><td> BEN </td><td> nitelikli </td></tr><tr><td> TA7 </td><td> 1.100 </td><td> 0.101 </td><td> 83.7 </td><td> 7.65 </td><td> 3.82 </td><td> NI </td><td> nitelikli </td></tr><tr><td> TA8 </td><td> 0,986 </td><td> 0.095 </td><td> 75.0 </td><td> 7.23 </td><td> 3.62 </td><td> NI </td><td> nitelikli </td></tr><tr><td> TA9 </td><td> 0.085 </td><td> 0.125 </td><td> 6.4 </td><td> 9.48 </td><td> 4.74 </td><td> BEN </td><td> nitelikli </td></tr><tr><td> TA10 </td><td> 0.203 </td><td> 0.105 </td><td> 15.4 </td><td> 7.95 </td><td> 3.98 </td><td> BEN </td><td> nitelikli </td></tr></tbody></table> Tablo 6:. 10 deneme makale için elde edilen sonuçlar EIT, NC ve PC kontrolleri tabloları eşya vardırDoku canlılığı ve EIT sonuçları hesaplamak için tasarlanmış bir Excel elektronik tarafından uced. NC 60.0 oranla% ≤ doku canlılığını azaltılmış test kimyasalları &quot;tahriş edici (&quot; I &quot;, TA3, TA5, TA6, TA9 ve TA10) ve doku canlılığı&gt; 60.0% non-Tahriş olarak sınıflandırılır vardı test kimyasalları (olarak sınıflandırılır NI &quot;, TA1, TA2, TA4, TA7 ve TA8).

Watch this Scientific Journal Video about Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model at JoVE.com

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Biz üç boyutlu yeniden insan kornea gibi epitel (RHCE) doku modelini kullanan bir göz tahrişi testi geliştirdi. Test göz irritan ve korozif malzemeler (GHS kategorileri 1 ve kombine 2) ve etiketleme (GHS yok Kategori) gerekmez olanlar arasında ayrım yapabiliyor.

Yeniden İnşa İnsan Kornea gibi Epitelyal (RHCE) Doku Modeli kullanılarak Göz tahriş Kimyasalların Tehlike Tanımlaması Göz tahrişi Testi (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

eye-irritation-test-eit-for-hazard-identification-eye-irritating

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

37.2K Görüntüleme.  MatTek Corporation.  Biz üç boyutlu yeniden insan kornea gibi epitel (RHCE) doku modelini kullanan bir göz tahrişi testi geliştirdi. Test göz irritan ve korozif malzemeler (GHS kategorileri 1 ve kombine 2) ve etiketleme (GHS yok Kategori) gerekmez olanlar arasında ayrım yapabiliyor. 

Video: Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Polimerik Gen Taşıyıcı Değerlendirilmesi Nanoparçacık İzleme Analizi ve Yüksek throughput Flow Sitometri tarafından Nanopartiküller

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Biyomühendislik

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

İnsan 3D Doku Mühendisliği<em&gt; In vitro</em&gt; Tümör Test Sistemi

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Combination of Microstereolithography and Electrospinning to Produce Membranes Equipped with Niches for Corneal Regeneration

Corneal problems affect millions of people worldwide reducing their quality of life significantly. Corneal disease can be caused by illnesses such as Aniridia or Steven Johnson Syndrome as well as by external factors such as chemical burns or radiation. Current treatments are (i) the use of corneal grafts and (ii) the use of stem cell expanded in the laboratory and delivered on carriers (e.g., amniotic membrane); these treatments are relatively successful but unfortunately they can fail after 3-5 years. There is a need to design and manufacture new corneal biomaterial devices able to mimic in detail the physiological environment where stem cells reside in the cornea. Limbal stem cells are located in the limbus (circular area between cornea and sclera) in specific niches known as the Palisades of Vogt. In this work we have developed a new platform technology which combines two cutting-edge manufacturing techniques (microstereolithography and electrospinning) for the fabrication of corneal membranes that mimic to a certain extent the limbus. Our membranes contain artificial micropockets which aim to provide cells with protection as the Palisades of Vogt do in the eye.

We report a technique for the fabrication of micropockets within electrospun membranes in which to study cell behavior. Specifically, we describe a combination of microstereolithography and electrospinning for the production of PLGA (Poly(lactide-co-glycolide)) corneal biomaterial devices equipped with microfeatures.

Microstereolithography ve ELEKTROÜRETİM kombinasyonu Kornea Yenilenme Nişli ile donatılmış Membranlarını Üretiliyor

Corneal problems affect millions of people worldwide reducing their quality of life significantly. Corneal disease can be caused by illnesses such as ...

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury leading to permanent pathological damage. Existing conventional assays allow the analysis of leukocyte adhesion molecules only after the extraction of leukocytes from the blood. This requires the blood to undergo several steps before peripheral blood leukocytes (PBLs) can be ready for analysis, which in turn can stimulate PBLs influencing the research findings. The autoperfused micro flow chamber assay, however, allows scientists to study early leukocytes functional dysregulation using the systemic flow of a live mouse while having the freedom of manipulating a coated chamber. Through a disease model, the functional expression of leukocyte adhesion molecules can be assessed and quantified in a micro-glass chamber coated with immobilized endothelial adhesion molecules ex vivo. In this model, the blood flows between the right common carotid artery and left external jugular vein of a live mouse under anesthesia, allowing the interaction of native PBLs in the chamber. Real-time experimental analysis is achieved with the assistance of an intravital microscope as well as a Harvard Apparatus pressure device. The application of a flow regulator at the input point of the glass chamber allows comparable physiological flow conditions amongst the experiments. Leukocyte rolling velocity is the main outcome and is measured using the National Institutes of Health open-access software ImageJ. In summary, the autoperfused micro flow chamber assay provides an optimal physiological environment to study leukocytes endothelial interaction and allows researchers to draw accurate conclusions when studying inflammation.

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Here, we present a protocol that allows the investigator to assess leukocyte recruitment dynamics ex vivo by connecting a chamber coated with endothelial-derived adhesion molecules to the circulatory system of a mouse. This method offers significant advantages since it allows for leukocyte assessment under relative biological conditions.

Bir Flow Koşullarında lökosit-endotel Etkileşimleri değerlendirilmesi<em&gt; Ex vivo</em&gt; Autoperfused Microflow Odası Deneyi

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

Encapsulated Cell Technology for the Delivery of Biologics to the Mouse Eye

Many current therapeutics under development for diseases of the posterior pole of the eye are biologics. These drugs need to be administered frequently, typically via intravitreal injections. Encapsulated cells expressing the biologic of choice are becoming a tool for local protein production and release (e.g., via long-term drug delivery). In addition, encapsulation systems utilize permeable materials that allow diffusion of nutrients, waste, and therapeutic factors into and out of cells. This occurs while masking the cells from the host immune response, avoiding the need for suppression of the host immune system. This protocol describes the use of alginate as a polymer in microencapsulation coupled with the electrospray method as a microencapsulation technique. ARPE-19 cells, a spontaneously arising human RPE cell line, has been used in long-term cell therapy experiments due to its lifetime functionality, and it is used here for encapsulation and delivery of the capsules to mouse eyes. The manuscript summarizes the steps for cell microencapsulation, quality control, and ocular delivery.

Presented here is a protocol for the use of alginate as a polymer in microencapsulation of immortalized cells for long-term delivery of biologics to rodent eyes.

Fare Gözüne Biyolojik Teslim için Kapsüllü Hücre Teknolojisi

Many current therapeutics under development for diseases of the posterior pole of the eye are biologics. These drugs need to be administered frequently, ...

Growth of Human and Sheep Corneal Endothelial Cell Layers on Biomaterial Membranes

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is deleterious for the cells as it reduces their ability to form a mature and functional layer. Here, we present a method for establishing and subculturing human and sheep corneal endothelial cell cultures that minimizes the loss of cell-to-cell contact. Explants of corneal endothelium/Descemet&#39;s membrane are taken from donor corneas and placed into tissue culture under conditions that allow the cells to collectively migrate onto the culture surface. Once a culture has been established, the explants are transferred to fresh plates to initiate new cultures. Dispase II is used to gently lift clumps of cells off tissue culture plates for subculturing. Corneal endothelial cell cultures that have been established using this protocol are suitable for transferring to biomaterial membranes to produce tissue-engineered cell layers for transplantation in animal trials. A custom-made device for supporting biomaterial membranes during tissue culture is described and an example of a tissue-engineered graft composed of a layer of corneal endothelial cells and a layer of corneal stromal cells on either side of a collagen type I membrane is presented.

This protocol describes the critical steps required to establish and grow corneal endothelial cell cultures from explants of human or sheep tissue. A method for subculturing corneal endothelial cells on membranous biomaterials is also presented.

Biyomalzeme Membranlar Üzerinde İnsan ve Koyun Korneal Endotel Hücre Tabakalarının Büyümesi

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

Büyük Ölçekte Üç Boyutlu Yeniden Yapılandırılmış İnsan Epidermisi Yetiştirmek

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression of a wide range of diseases including breast, ovarian, kidney, and pancreatic cancers. Freely available fiber quantification software tools are mainly focused on the calculation of fiber alignment or orientation, and they are subject to limitations such as the requirement of manual steps, inaccuracy in detection of the fiber edge in noisy background, or lack of localized feature characterization. The collagen fiber quantitation tool described in this protocol is characterized by using an optimal multiscale image representation enabled by curvelet transform (CT). This algorithmic approach allows for the removal of noise from fibrillar collagen images and the enhancement of fiber edges to provide location and orientation information directly from a fiber, rather than using the indirect pixel-wise or window-wise information obtained from other tools. This CT-based framework contains two separate, but linked, packages named &#8220;CT-FIRE&#8221; and &#8220;CurveAlign&#8221; that can quantify fiber organization on a global, region of interest (ROI), or individual fiber basis. This quantification framework has been developed for more than ten years and has now evolved into a comprehensive and user-driven collagen quantification platform. Using this platform, one can measure up to about thirty fiber features including individual fiber properties such as length, angle, width, and straightness, as well as bulk measurements such as density and alignment. Additionally, the user can measure fiber angle relative to manually or automatically segmented boundaries. This platform also provides several additional modules including ones for ROI analysis, automatic boundary creation, and post-processing. Using this platform does not require prior experience of programming or image processing, and it can handle large datasets including hundreds or thousands of images, enabling efficient quantification of collagen fiber organization for biological or biomedical applications.

Here, we present a protocol to use a curvelet transform-based, open-source MATLAB software tool for quantifying fibrillar collagen organization in the extracellular matrix of both normal and diseased tissues. This tool can be applied to images with collagen fibers or other types of line-like structures.

Curvelet Transform Tabanlı Araçlarla Fibrillar Kollajen Organizasyonunu Ölçme

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression ...

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such as the cornea and conjunctiva. While therapeutic effects and pharmacokinetics of the drugs upon subconjunctival injection have been described in some studies, very few assess the ocular distribution of drugs or drug delivery systems (DDS). The latter is critical for the optimization of intraocular DDS design and drug bioavailability to achieve the desired ocular localization and duration of action (e.g., acute versus. prolonged). This study establishes the use of fiberoptic confocal laser microendoscopy (CLM) to qualitatively study the ocular distribution of fluorescent liposomes in real-time in live mice after sub-conjunctival injection. Being designed for in vivo visual inspection of tissues at the microscopic level, this is also the first full description of the CLM imaging method to study spatio-temporal distribution of injectables in the eye after subconjunctival injection.

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

We present a protocol for the use of fiberoptic confocal laser microendoscopy (CLM) to non-invasively study the spatio-temporal distribution of liposomes in the eye after subconjunctival injection.

Fiberoptik Konfokal Lazer Mikroendoskopi Kullanılarak Oküler İlaç Dağıtım Sistemlerinin Spatio-Temporal In Vivo Görüntülemesi

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such ...

Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is an important structure of gingival tissue, especially in the repair and regeneration of periodontal tissue. Studying the functions of gingival epithelial cells has crucial scientific value, such as repairing oral defects and detecting the compatibility of biomaterials. As human gingival epithelial cells are highly differentiated keratinized cells, their lifespan is short, and they are difficult to passage. So far, there are only two ways to isolate and culture gingival epithelial cells, a direct explant method and an enzymatic method. However, the time required to obtain epithelial cells using the direct explant method is longer, and the cell survival rate of the enzymatic method is lower. Clinically, the acquisition of gingival tissue is limited, so a stable, efficient, and simple in vitro isolation and culture system is needed. We improved the traditional enzymatic method by adding Y-27632, a Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor, which can selectively promote the growth of epithelial cells. Our modified enzymatic method simplifies the steps of the traditional enzymatic method and increases the efficiency of culturing epithelial cells, which has significant advantages over the direct explant method and the enzymatic method.

Here we present a modified method for the isolation and culture of human gingival epithelial cells by adding the Rock inhibitor, Y-27632, to the traditional method. This method is easier, less time-consuming, enhances stem cell properties, and produces larger numbers of high-potential epithelial cells both for the laboratory and for clinical applications.

Y-27632 Kullanarak Birincil İnsan Dişeti Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is ...

Methods Article

Yeniden İnşa İnsan Kornea gibi Epitelyal (RHCE) Doku Modeli kullanılarak Göz tahriş Kimyasalların Tehlike Tanımlaması Göz tahrişi Testi (EIT)