The authors would like to thank Dr. George Gittes for advice and expertise throughout this study. SSL was supported by an American Heart Association fellowship (11POST7330002). Further to this SSL and this study was supported by an NIDDK Mentored Research Scientist Development Award (DK096996) and by the Children&#8217;s Hospital of Pittsburgh.

NOT: Pittsburgh Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Üniversitesi tüm deneyleri onaylamıştır. Ultrason-mikroenjeksiyon Cihazları ve Embriyolar 1. Hazırlık <ol><li> Sahne, montaj ve prob (Şekil 1) yanı sıra cerrahi aletler (Şekil 2) ayarlayın. 37 ° C&#39;lik bir ısıtma banyosu içinde yer fosfat tamponlu tuz (PBS) çözeltisi (pH 7.4). Tabanı yoluyla bir ikinci esnek 25 G iğne takılı 1 ml şırınga kullanılarak, mineral yağ ile tamamen mikroenjeksiyon iğne doldurun. </li><li> Dönme üzerine iğne Fix kolunu monte ve madeni yağ çözeltisi boş iğne. TL çözeltisi 2,5 ul yeniden doldurun. Hava kabarcığı enjeksiyon iğnesi içinde mevcut olduğundan emin olun. Uzakta aşamasından, duvara doğru iğne kolunu döndürün. </li><li> Izofluran sürekli infüzyon yoluyla anestezi odasına hamile anne anestezisi. Anne bilinçsiz hale olduğunda, c konumlandırılmış burun tüp anestezi transferiburun tüp içinde burnu ile yatar pozisyonda audal aşamada yan ve yer annesi tam anestezi devletin bir devamı sağlamak için. </li><li> 45 ° açıları, ya da elleri ve ayakları ile Bant bacaklarda dinlenmiş ve üstünlük EKG / Sıcaklık monitör sekmelerini konumlandırılmış. Hamile baraj sürekli o anestezi sağlamak için izlenmesi önemlidir yeterlidir ve gözlere uygulanan bu merhem kurutma azaltmak için. </li><li> Yavaşça herhangi bir aşırı bir ürün ve saç kaldırmak için% 70 etanol-doymuş pamuklu sonra tekrar kuru pamuklu silin, ve, anne karnın alt genelinde epilasyon ürünü uygulayın. Kesi yerinde (Şekil 3) tüm saç kapalı karın cildi temizlemek için emin olun. </li><li> Ince cerrahi forseps ve makas kullanılarak gebe anne üzerinde bir laparotomi gerçekleştirin. Herhangi bir büyük damarları ya da visseral organları kesme önlemek için dikkat edin. 1.5-2 cm vajina üzerinde, ilk epidermis düz kesi yapmak ve approximat için kaburga doğru kesilmiş devamely 2-3 cm. Viseral organlar ve rahim saccules iç göstermek, aynı uzunluğu boyunca, deri altı membran Açığa linea alba (&quot;beyaz çizgi&quot;) (Şekil 3) bulmak, ve ilk kesi paralel kesilmiş. </li></ol> Embriyolar 2. Ekstraksiyon <ol><li> Anne ve embriyolar manevra 6-inç pamuk uçlu aplikatör kullanın. Yavaşça kesi açılması dışında ilk embriyo işlemek için aplikatör ile cilt üzerinde (zorlamayın) itin. İlk embriyo Keseciklerin çıkarılmasından sonra, yavaşça ve yavaş yavaş yoluyla ve annenin dış üzerine uterin boynuz kalanını çekin. Bu aşamada kesikten bağırsak ya da diğer organlara çekerek kaçının. </li><li> Embriyoların ölçmek ve yavaşça anne geri sol uterin boynuz yerleştirin. Sonra boynuz vajinadan embriyo saccule sağdaki ile başlayan ve aşağı hareket geri anne içine doğru uterin boynuz yerleştirerek başlar. (Sadece iki embriyo maruz kalması kadar Fi, bu devamGüre gösterir 4). Son olarak, bir yukarıda sütun ve paralel pozisyon embriyolar rahim dolaşımını kesmek için değil haberdar olmak, çizgi insizyon. </li><li> Kollar ve gövde, aynı zamanda bacak ve kuyruk arasında kil blokları ve pozisyon yerleştirin. Kil yüzeyleri laparotomi insizyon ile yaklaşık seviyede olduğundan emin olun. 37 ° C PBS ile fenestre Petri kabı ıslatın. </li><li> Sol el (embriyolar fenestrasyonu paralel) ile sağ el ve fenestre Petri kabı ile uzanan forseps kavrayın ve Petri kabı üst, fenestrasyonu aracılığıyla kapalı forseps ~ 5-cm getirmek. Tamamen fenestrasyonu örgü yırtmadan açın forseps. </li><li> Embriyolar üzerinde ellerini Manevra ve iki embriyo saccules üzerinde görüş odaklanmak. Olmadan (ya da hafifçe) yarıktan kaydırın ve annenin karın üzerine Petri kabı set, fenestrasyonu meshing veya forseps ile saccules dokunmadan. Forseps hala uzatılmış, (her iki tarafta ve her embriyonun üssünde oturması için Şekil 5 Fenestralı örgü manipüle </stRong&gt;) ve yarık açılması dışarı forseps çekin. </li><li> Sonraki, (Şekil 6) kısma veya embriyolar zarar vermeden, Petri kabındaki duvar içeren mavi lastik yerleştirin. Emin kil bloklar sıkıca Petri kabı, embriyo ve kauçuk içeren duvar dengeleme emin olun. Fenestralı geçmelerine sızıntıları kontrol ederken embriyolar tamamen (Şekil 6) batık kadar Son olarak, 37 ° C PBS ile Petri kabı doldurun. </li></ol> 3. Enjeksiyon Yöntemi <ol><li> Sonra alt enjeksiyon anne ve embriyoların aşağı Z-seviye ayar düğmesini (Şekil 1) kullanarak sahne ve prob ucu sola ve altında iğne ½ cm, enjeksiyon iğnesi döndürmek ve kol monte ve ultrason probu ile doğrudan hizaya (Şekil 7) . 45 ° uzakta prob iğne-kol (değil iğne) itin. Çanak veya ultrason probu ile iğne ucu vurmak için dikkatli olun. </li><li> Ultrason p, geri orijinal yüksekliği enjeksiyon sahne kaldırındoğrudan embriyolar Probe üzerinde elbise biraz batık ve embriyonik doku 3-4 mm&#39;lik içinde olmalıdır. Kullanım X &amp; Y sahne ayar düğmeleri (Şekil 8) sistematik dayak embriyonik kalp bulmak için embriyo / anne / sahne konumunu değiştirme. </li><li> Doğrudan ultrason ekranının Merkezi çizilmiş siyah bir merkez hedef işaretleyici (*) gözlemlemek. X &amp; Y sahne ayar düğmeleri kullanarak sol ventrikül (tercih) veya atrium (Şekil 8) bulun ve ardından yükseltmek veya ultrason ekranında siyah merkez işaretleyici üzerinde tam enjeksiyon hedef konumlandırmak için sahneye döner düğmesini kullanarak sahne indirin. </li><li> Ultrason ekranında kapalı, sağ embriyo hareket X sahne ayar düğmesini kullanın. ½ uzak cm ve ultrason probu 90 ° (Şekil 7), mikroenjeksiyon iğne yeniden konumlandırmak ve tekrar yerine kol. </li><li> Mikroenjeksiyon açıkça ucu al ayar düğmeleri (Şekil 9C-G), pozisyon iğne monte kullanmamerkez işaretleyici ile igned. İğne ucu doğru düzlemde odaklı sağlamak için, ve X, Y, ve mikro-iğne Z vektörleri (Şekil 9C&#39;de &amp; EG düğmeleri kullanarak) enjeksiyon açısını ayarlayın. Sadece &quot;enjeksiyon&quot; düğmesini (Şekil 9F) kullanarak mikroenjeksiyon iğne geri çekin, dikkatli değil, diğer boyutlarını ayarlamak için. </li><li> Yine, tam ultrason ekranında merkez işareti hedef geri prob altında sadece X ince ayar aşaması topuzu hareket embriyo kullanarak. Sol ventrikül aynı X, Y ve Z düzleminde şimdi olduğundan emin olun. </li><li> Mikroenjeksiyon sadece &quot;enjeksiyon&quot; düğmesi monte ile Sonraki, yavaş yavaş mikroenjeksiyon iğne ile embriyo delinme ve yavaş yavaş sol ventrikül içine ucu getir. Kez (Şekil 2A &amp; B) &quot;boş&quot; tutan ve &quot;dolgu&quot; dokunarak, boş uyarı bip sesleri sol ventrikül içine kadar veya TL çözümünün tam 2.5 ul enjekte edilir. Şu andaenjeksiyon kalp odasına giren TL (Şekil 10) iğne ucu kaynaklanan bir gölge gözlemlemek. Tersinde, hızlı enjeksiyon tamamlandığında mikroenjeksiyon üzerinde &quot;enjeksiyon&quot; düğmesi (Şekil 9F) monte dönen mikroenjeksiyon iğne geri çekin. </li><li> Bir sonraki embriyo Devam ve Bu adımlarda sonra, kalan embriyolar için bu yordamı yineleyin ve nihayet geri baraj karın içine son embriyolar yerleştirin. Odacık kutusuna anestezi geçin ve hafifçe son enjeksiyon zamanı 15 dakika burada anneyi taşıyın. </li></ol> 4. Hasat Embriyolar ve Analiz <ol><li> Servikal dislokasyon yoluyla baraj Kurban. Kolayca anneden rahim boynuzları kaldırmak için laparotomi kesi genişletin. Uterus kesesi içinde embriyolar tutun. Soğutulmuş PBS embriyolar yerleştirin. </li><li> (Eğer genotiplemede için gerekli toplamak doku) uterus kesesinin embriyolar incelemek ve tüm embriyo yerleştirmek in,% 4 paraformaldehit (PFA), gece boyunca, daha sonra içine% 30 sukroz, gece boyunca, orta kesit kriyostat dondurma. Sonra cryosection kesmek ve immünohistokimyasal analiz için slaytlar üzerine yerleştirin. İsteğe bağlı olarak, dokuların kullanımı,% 100 metanol dehidrasyon% 4 PFA içinde tespit izleyerek tüm montaj. </li><li> Immünohistokimyasal analiz için OCT kaldırmak için PBS içine cryosections yerleştirin. Daha sonra, 30 dakika boyunca,% 10 normal eşek serumu ile bölümleri bloke eder. Daha sonra 1 ile PECAM birinci antikor ekleyin: 100 seyreltme, gece boyunca 4 ° C&#39;de ilave edildi. Bir sonraki gün, 10 dakika her biri için PBT 3 kez slaytlar yıkama ve ikinci eşek anti-fare 594 ekleyebilir ve oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. NOT: Bu ultrason ve mikroenjeksiyon optimizasyonu ve koordinasyonu gerektiren son derece zorlu bir tekniktir. Orada bu teknikle ilgili bir çok dik bir öğrenme eğrisi ve bir uzman olmadan önce mentorluk enjeksiyonların 4-6 hafta gerektirir. </li></ol>

<ol>
	<li>Abrahamson, D. R., Robert, B., Hyink, D. P., St John, P. L., Daniel, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+formation+of+microvasculature+in+the+developing+kidney.">Origins and formation of microvasculature in the developing kidney.</a> Kidney international. Supplement. 67, S7-S11 (1998).</li><li>Sims-Lucas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Progenitors+Exist+within+the+Kidney+and+Lung+Mesenchyme.">Endothelial Progenitors Exist within the Kidney and Lung Mesenchyme.</a> PloS one. 8 (6), e65993 (2013).</li><li>Dressler, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+early+kidney+specification,+development+and+patterning.">Advances in early kidney specification, development and patterning.</a> Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).</li><li>Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+controls+and+cellular+behaviors+in+branching+morphogenesis+of+the+renal+collecting+system.">Genetic controls and cellular behaviors in branching morphogenesis of the renal collecting system.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (5), 693-713 (2012).</li><li>Costantini, F., Kopan , R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+a+complex+organ:+branching+morphogenesis+and+nephron+segmentation+in+kidney+development.">Patterning a complex organ: branching morphogenesis and nephron segmentation in kidney development.</a> Dev Cell. 18 (5), 698-712 (2010).</li><li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+crosstalk+regulates+kidney+progenitor+cell+differentiation.">Stromal-epithelial crosstalk regulates kidney progenitor cell differentiation.</a> Nat Cell Biol. 15 (9), 1035-1044 (2013).</li><li>Rymer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+blood+flow+and+oxygenation+drive+nephron+progenitor+differentiation.">Renal blood flow and oxygenation drive nephron progenitor differentiation.</a> Am J Physiol Renal Physiol. , (2014).</li><li>Shah, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+mouse+blood+flow+and+oxygen+correlate+with+early+pancreatic+differentiation.">Embryonic mouse blood flow and oxygen correlate with early pancreatic differentiation.</a> Developmental biology. 349 (2), 342-349 (2011).</li><li>Andres, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphB4+receptor+tyrosine+kinase+transgenic+mice+develop+glomerulopathies+reminiscent+of+aglomerular+vascular+shunts.">EphB4 receptor tyrosine kinase transgenic mice develop glomerulopathies reminiscent of aglomerular vascular shunts.</a> Mech Dev. 120 (4), 511-516 (2003).</li><li>Wagner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+kidney+vascular+corrosion+casts+with+Nano-CT.">High-resolution imaging of kidney vascular corrosion casts with Nano-CT.</a> Microsc Microanal. 17 (2), 215-219 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Mikroenjeksiyon anestezi ve zaman çerçevesi Annenin anesthetization ile ilgili olarak, bu hava akımı sabit (2-3 L / dk) ve düşük PSI&#39;de tutmak esastır. sedatif akışı / dak yaklaşık 1,75-2 L tutulmalıdır. Aynı anda, enjeksiyonlar yer aldığı zaman dilimleri yakından takip ve her çöp için kontrol edilmelidir. Her çöp için enjeksiyon prosedürü 45 dakika altında tutulmalıdır. Her embriyo gövdesi ve ilgi organı boyunca kontrollü ve değişmez perfüzyon kolayl...

Embriyonik gelişimi sırasında iki ayrı, ama aynı anda, vasküler işlemler gerçekleşir: anjiogenezisi, süreci bir gemi konut endotel atalarıdır 1,2 den gemilerin de novo oluşumu büyük bir önceden var olan damar, ve vaskülogenez, yetişen bu sayede. Ikinci büyük ölçüde o olmadan gerçekleşmesi düşünülmektedir ise sırasıyla, eski, kan akımı ile eş anlamlıdır. Kan damarı oluşumu eş zamanlı, böbrek progenitör hücre sentezi, çoğalması ve farklılaşması bir döngüsel ve dinamik bir süreç embriyonik gün 9.5 (E9.5) açılmak başlar. Bu noktada üreter tomurcuğu (UB) metanefrik mezenşimi (MM) çevredeki içine dorsal işgal ve Doğum 3 kadar devam eder. Hızla metanefrik kap mezenşimi yoğuşmalı içine UB dallanma tekrarlanan böbrek fonksiyonel birimleri, nefron oluşumunu başlar. UB ve nef her yeni nesilron, eski kuşaklar daha sonra öncelikle damar-yoğun ortamlarda daha olgunlaşmasını ve farklılaşmasını geçiren iç kortikal ve medüller bölgeler, içine yerinden edilir. Dressler ve ark. 3 ile kanıtlandığı gibi, bu embriyolojik işlemi, UB ve MM, ve hücre dışı faktörler 3-6 sayısız arasında çapraz olarak, endüktif sinyal çökeltilir. İki yakın zamanda incelenen dışı gelişen pankreas içindeki faktörler ve böbrekler oksijen gerilimi ve kan akışını 7,8 bulunur. ikinci böbrek gelişimi ile ilişkili olarak aşağıda daha ayrıntılı olarak tarif edilecektir. Kan akışı, potansiyel nefron progenitör hücre farklılaşması, hem de diğer organogenez süreçleri, embriyonik kan akımı haritalama hassas ve doğru bir yöntem oynadığı endüktif rolü ortaya koymak için de çok önemlidir. Kan akışını ölçme alternatif yöntemler ul reçete dahiltrasound görüntüleme ve reçine 9,10 atmalarını. Sonuç, bu modlar doğal eş kan akımı arasındaki zamansal ve mekansal juxtapositions açıklayacak ve hücre farklılaşmasını kök onların kapasite eksik gösterilmiştir. Reçine kalıplar, örneğin, ancak bu tür oluşum safhasındaki zaman noktalarında olduğu gibi olgun olmayan kaplar, içinde, yetişkin doku içindeki damar desenli geçerli bir model sağlayan, kaplar büyük ölçüde az gelişmiş ve sızan bulunmaktadır. Bu nedenle, reçine, çoğu zaman gözenekli, küçük damarlarda içinde tutmak için başarısız atmalarını. Bu belirgin engeller için, diğerleri arasında, biz ultrason rehberliğinde böbrek gelişimi bizim soruşturma içine in vivo içi kardiyak embriyonik domates lektin (TL) mikroenjeksiyon dahil etmek seçti. Bu prosedürde, biz zaman uyumlu E11.5, 13.5, E15.5 ve E17.5 zaman noktalarında fare embriyoları sol ventrikül içine TP çözeltisi 2.5 ul ile dolu bir monte mikropipet iğne kılavuz için, bir ultrason probu kullanmaktadır. E17Iğneler daha gelişmiş embriyo nüfuz için yeterince güçlü değil gibi .5 son gelişimsel yaş. Bu mikroenjeksiyon yönteminin avantajları bol miktarda bulunmaktadır. Ultrason eşliğinde mikroenjeksiyon kesin embriyonik sol ventrikül içinde bir enjeksiyon iğnesinin konumlandırma, hayvan, kalp minimal hasar ve çevreleyen dokuların atan kalbine çözümün pasif ve kontrollü atılmasına, ve ani kalp yetmezliği kaçınma ve ölüm veriyor embriyo tam vücut perfüzyon önce. FITC-işaretli TL kullanımı ile, herhangi bir perfüze damar da endotel apikal zar boyunca işaretleyici koruyacaktır. Immunohistokimyasal ile birlikte, PECAM (CD31, Trombosit endotel hücre adezyon molekülü) ve diğer çeşitli vasküler belirteçleri kullanarak, açıkça edebiliyoruz perfüze ve un-perfüze gemilerin arasında ayrım yanı sıra çevre dokulara herhangi bir anormal boyama karakterize.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="981">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:292px;">Company</td>
			<td style="width:164px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:225px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>022M4004V</td>
			<td>concentration 1:5000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pecam</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553370</td>
			<td>concentration 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FITC-Tomato Lectin</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>FL-1321</td>
			<td>concentration 2.5&#181;L / embryo</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat )</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>712-585-150</td>
			<td>concentration 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjection Needle</td>
			<td>Origio Mid Atlantic Devices</td>
			<td>C060609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mineral Oil</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">BP26291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mL syringe</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">03-377-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Clay Blocks</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">HR4-326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical Tape</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">18-999-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">NC9763655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hair Removal Product</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">NC0132811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">11064-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Surgical Marking Pen</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">18000-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Right angle forceps (for hysterectomy)</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">11151-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in utero intra-cardiac tomato-lectin injections on mouse embryos to gauge renal blood flow

oluşumu ve (dışında glomerüllerden) böbrek kan damarlarını geliştirme perfüzyon ölçüde understudied edilir. Damar gibi reçine atmalarını, in vivo ultrason görüntüleme ve mikro-diseksiyonu olarak perfüzyon haritalama teknikleri arasındaki yakın ilişkiyi gösteren sınırlı olan, (de novo damar oluşumu) ve vaskülogenez (büyük damarların kapalı dallanma olan) anjiyogenez yoluyla geliştikçe Embriyonun içinde bu iki süreç ve gelişmekte olan böbrek yapıları. Burada, biz böbrek perfüzyonunun ontogenezini ölçmek için fare embriyoları üzerinde utero içi kardiyak ultrason rehberliğinde FITC etiketli domates lektin mikroenjeksiyon içinde prosedürü tarif. Domates lektin (TL) hasat embriyo ve böbrekler boyunca perfüze edildi. Nefron atalarıdır, nefron yapıları, üreter epiteli ve damar: dokular dahil olmak üzere çeşitli böbrek yapılar için ortak boyandı. E13.5 büyük kalibreli damarları başlayan, ancak periferik perfüze edildigemi unperfused kalmıştır. E15.5 E17.5 ve tarafından, küçük periferik damarlar yanı sıra glomerüller perfüze hale başladı. Bu deneysel teknik, embriyonik gelişim sırasında damar kan akışının rolü üzerinde çalışılması için kritik önem taşır.

Vasküler oluşumu böbrek gelişmekte akışı öncesinde (Böbrek de dahil olmak üzere), embriyonik dokunun büyük bir kısmı daha erken dönemde embriyo zaman noktalarında, yoğun damar (unperfused ve perfüze her ikisi) içerir. Gelişmekte olan böbrek içinde iyi göstergesi ve analiz kan akımı biz utero embriyonik intrakardiyak mikroenjeksiyon içinde bir yöntem kullanılmıştır. Bir laparotomi yoluyla çıkarılması ve bir tek uterus Keseciklerin maruz kaldıktan sonra E17....

Watch this Scientific Journal Video about In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow at JoVE.com

In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

Fare Embryolarının üzerinde Utero içi kardiyak Domates-lektin Enjeksiyonlar Renal Kan Akışı Ölçer için

The formation and perfusion of developing renal blood vessels (apart from glomeruli) are greatly understudied. As vasculature develops via angiogenesis ...

in-utero-intra-cardiac-tomato-lectin-injections-on-mouse-embryos-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

9.7K Görüntüleme.  Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC. This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

Video: In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or &#945;v&#946;3) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.

Here, we present a protocol to inject ultrasound microbubble contrast agents into living, isolated late-gestation stage murine embryos. This method enables the study of perfusion parameters and of vascular molecular markers within the embryo using contrast-enhanced high-frequency ultrasound imaging.

Yüksek frekanslı Ultrason Kullanımı Fare Embriyolar Kontrast Görüntüleme

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Gelişim Biyolojisi

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Fare Hipokampal Doku Ex Utero Elektroporasyon ve Organotipik Dilim Kültür

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

Protein İfade Kantitatif Analiz Fare Preimplantasyon Embriyolar Lineage Şartname Eğitim için

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Preimplantasyon Fare Embriyolar Erken Hücre Kader Belirleyicileri Araştırma kaybı: ve Kazanç fonksiyon-Yaklaşımı

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of the cell and often consist of multiple functional domains, which can be influenced by posttranslational modifications. The depletion of the entire protein in conditional or constitutive knock-out (KO) mice does not take into account this functional diversity and regulation. An mESC line and a derived mouse model, in which a docking site for FLPe recombination-mediated cassette exchange (RMCE) was inserted within the ROSA26 (R26) locus, was previously reported. Here, we report on a structure-function approach that allows for molecular dissection of the different functionalities of a multidomain protein. To this end, RMCE-compatible mice must be crossed with KO mice and then RMCE-compatible KO mESCs must be isolated. Next, a panel of putative rescue constructs can be introduced into the R26 locus via RMCE targeting. The candidate rescue cDNAs can be easily inserted between RMCE sites of the targeting vector using recombination cloning. Next, KO mESCs are transfected with the targeting vector in combination with an FLPe recombinase expression plasmid. RMCE reactivates the promoter-less neomycin-resistance gene in the ROSA26 docking sites and allows for the selection of the correct targeting event. In this way, high targeting efficiencies close to 100% are obtained, allowing for insertion of multiple putative rescue constructs in a semi-high throughput manner. Finally, a multitude of R26-driven rescue constructs can be tested for their ability to rescue the phenotype that was observed in parental KO mESCs. We present a proof-of-principle structure-function study in p120 catenin (p120ctn) KO mESCs using endoderm differentiation in embryoid bodies (EBs) as the phenotypic readout. This approach enables the identification of important domains, putative downstream pathways, and disease-relevant point mutations that underlie KO phenotypes for a given protein.

Proteins often contain multiple domains that can exert different cellular functions. Gene knock-outs (KO) do not consider this functional diversity. Here, we report a recombination-mediated cassette exchange (RMCE)-based structure-function approach in KO embryonic stem cells that allows for the molecular dissection of various functional domains or variants of a protein.

Recombinase aracılı Kaset Değişimi Kullanarak Fare Embriyonik Kök Hücre yapı-fonksiyon Çalışmaları

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Düğüm ve Notochordal plaka Gastrulating fare embriyo Tarama elektron mikroskobu ve bütün Dağı ayirt kullanarak görselleştirme

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by Sertoli cell junctions at the blood-testis barrier (BTB), which is the tightest tissue barrier in the mammalian body and segregates the seminiferous epithelium into two compartments, a basal and an adluminal. The BTB creates a unique microenvironment for germ cells in meiosis I/II and for the development of postmeiotic spermatids into spermatozoa via spermiogenesis. Here, we describe a reliable assay to monitor BTB integrity of mouse testis in vivo. An intact BTB blocks the diffusion of FITC-conjugated inulin from the basal to the apical compartment of the seminiferous tubules. This technique is suitable for studying gene candidates, viruses, or environmental toxicants that may affect BTB function or integrity, with an easy procedure and a minimal requirement of surgical skills compared to alternative methods.

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Here, we present a protocol to assess the blood-testis barrier integrity by injecting inulin-FITC into testes. This is an efficient in vivo method to study blood-testis barrier integrity that can be compromised by genetic and environmental elements.

Fare kan-Testis bariyeri bütünlük çalışma için In Vivo yöntemi

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

Ultraviyole-C (UV-C) Hasarına Yanıt Olarak Birincil Fare Oküler Yüzey Hücrelerinde/Kök Hücrelerinde Oksidatif Hasarın Değerlendirilmesi

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

Zebrabalığı Embriyolarında Situ Hibridizasyon ve IPSC-EC'lerde Tüp Oluşumu Nda Endoglin'in Vasküler Gelişimdeki Rolünü İncelemek İçin Tam Montaj

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). This is a critical process that occurs throughout the lifespan of organisms, and disruption of the molecular pathways involved during embryogenesis can have catastrophic long-term consequences. For a multitude of reasons, zebrafish (Danio rerio) has become a model organism to study hematopoiesis. Zebrafish embryos develop externally, and by 7 days postfertilization (dpf) have produced most of the subtypes of definitive blood cells that will persist for their lifetime. Assays to assess the number of hematopoietic cells have been developed, mainly utilizing specific histological stains, in situ hybridization techniques, and microscopy of transgenic animals that utilize blood cell-specific promoters driving the expression of fluorescent proteins. However, most staining assays and in situ hybridization techniques do not accurately quantitate the number of blood cells present; only large differences in cell numbers are easily visualized. Utilizing transgenic animals and analyzing individuals with fluorescent or confocal microscopy can be performed, but the quantitation of these assays relies on either counting manually or utilizing expensive imaging software, both of which can make errors. Development of additional methods to assess blood cell numbers would be economical, faster, and could even be automated to quickly assess the effect of CRISPR-mediated genetic modification, morpholino-mediated transcript reduction, and the effect of drug compounds that affect hematopoiesis on a large scale. This novel assay to quantitate blood cells is performed by dissociating whole zebrafish embryos and analyzing the amount of fluorescently labelled blood cells present. These assays should allow elucidation of molecular pathways responsible for blood cell generation, expansion, and regulation during embryogenesis, which will allow researchers to further discover novel factors altered during blood diseases, as well as pathways essential during the evolution of vertebrate hematopoiesis.

This assay is a simple method to quantitate hematopoietic cells in developing embryonic zebrafish. Blood cells from dissociated zebrafish are subjected to flow cytometry analysis. This allows the detection of blood defects in mutant animals and after genetic modification.

Gelişmekte Olan Zebra Balıklarında Değiştirilmiş Kan Oluşumunu Tespit Etmek ve Nicel hale Getirmek için Akış Sitometrisini Kullanma

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells ...