Yazarlar Vakfı Leducq (Mitral) ve Agence Nationale bu araştırmalara fon la Recherche (ANR Specistem hibe) dökün kabul.

1.. Hazırlık Hayvan Prosedürleri Bir hayvan etik kurul onay almak ve virüs ile çalışmak için kurumsal yönergeleri izleyin, HuESC ve / veya iPSC (varsa) yanı sıra, fare kullanımı, fare embriyo elde edilmesi, ve fare ameliyat. Zamanlı eşleştirmesi için, tıpanın gün embriyonik gün (E) 0.5 / 0.5 gün post-coitum olarak kabul edilir. <ol><li> Mikroenjeksiyon iğneler: Ex utero mikroenjeksiyon için, 1 ya da 10 mikron iç uç çapını ve sırasıyla, DNA veya hücreleri enjekte etmek için keskin ve konik ucu şeklini almak için bir pipet çektirmenin / beveller kullanılarak cam pipetler (1.2 mm dış çaplı borosilikat kılcal tüpler) çekin. Ultrason aracılı enjeksiyonlar için, kullanımı, 50/35 um OD / ID ucu ile mm/0.53 1.14 mm&#39;lik bir iç / dış çapa (OD / İD) sahip steril iğneler, özel. </li><li> Silikon dolu petri: Kılavuzunda açıklandığı gibi silikon hazırlayın. Doldurmak~ 1 sm bir elastomer tabakası ile temiz bir cam 60 mm çapında Petri kabı. Hava kabarcıkları kaçının. </li><li> Araçlar: İşlem sırasında önce ve tüm cerrahi aletler steril tutun. </li><li> DNA hazırlanması: Tek bir tüp içinde 3 ug DNA ve 12 ul Opti-MEM ekleyin. Başka bir tüp içinde 3 ul Lipofektamin 2000 ve 12 ul Opti-MEM ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin ve her iki çözümü karıştırın. Hemen kullanın. </li><li> Hücre hazırlanması: 10 6 hücre süspansiyonunu hazırlamak / ml DMEM (Dulbecco&#39;nun Eagle Medium, yüksek glikoz ve% 50 fare) tedaviden geçirildi. Nihai hücre süspansiyonu, 50 ul 8-10 embriyolar için yeterlidir. </li><li> Boya hazırlama: 25 mg / ml DMSO de yeşil floresan CDCFDA-SE kullanın. -20 ° C&#39;de 20 ul alikotları ve mağaza hazırlayın Steril serum fizyolojik veya PBS kullanımdan önce 1:100 / 1:200 sulandırmak. </li><li> Virüs hazırlanması: ~ 10 9 10 -10 tra bir titreye sahip olan ticari bir 3. kuşak PGK-GFP-ifade lentivirüs kullanınbirim / ml DMEM nsducing. Lentivirüsünün hazırlanması için, Tiscornia vd. 14. kişisel koruyucu ekipman giyin ve güvenli bir şekilde kullanımı ve virüs imha bakın. </li></ol> Ex vivo Enjeksiyon için E9.5 ve E10.5 Embriyolar 2. Koleksiyonu <ol><li> Embriyonik gün 9.5 veya 10.5 hamile bir fareyi Euthanize. </li><li> % 70 etanol ile fare göğüs ve karın sterilize edin. </li><li> Karın açmak ve PBS içinde oda sıcaklığında uterin boynuz almak ve M16 ortamı ile bir silikon dolu bir Petri kabı iki PBS yıkar sonra aktarmak için bir ventral orta hat kesi olun. </li><li> Rahim vaskülarize yan alt böylece silikon tabakaya böcek pimleri ile uterin boynuzu Pin. </li><li> Yüzeyinin 1 mm ince forseps ile rahim yüzey ve desidua bir kapak kesin. </li><li> Yavaşça desidua duvarlar dışarı yayarak yumurta kesesinde embriyo almak. </li><li> 37 ° embriyolar Mağaza, Hücre enjekte edilmeden önce C M16 ortam. Enjeksiyon için her bir embriyo önceden ısıtılmış 37 ° C de M16 ortamı ile doldurulmuş silikon kabına aktarılır </li></ol> Stereomicroscope altında 3. DNA veya Hücre Enjeksiyon <ol><li> Bir Hamilton şırınga ile arka cam pipet doldurun ve ucunda kabarcıklarını çıkarmak için pipet sallayın. </li><li> Mikroenjeksiyon tutucuya pipet ayarlayın; 50, tutma basıncı (DNA) ya da 30 (hücreler) hPa ve 300 (hücre) için 150 enjeksiyon basıncı (DNA) hPa ayarlayın. 0.2 sn (DNA) veya 0.5 saniye (hücre) için enjeksiyon zamanı ayarlayın. Bu ayarlar, hafif mikroenjektör ve pipet türüne göre değişiklik gösterebilir. </li><li> Uygun embriyo dokunmadan sarısı ile silikon alt embriyo Pin. Kalbin bölge izlemek ve sadece bu bölgede yukarıda kese açık. </li><li> Hücre enjeksiyonu sırasında herhangi bir hareketi önlemek için embriyo yaklaşık 4 işaretçilerine ekleyin. </li><li> (Manuel ayarlı) mikromanipülatör kullanarak, slowlSadece (Şekil 1), enjekte edilecek olan kalbin bölgenin üstüne perikard en az 45 ° &#39;lik bir açı y konumu pipet ucu. </li><li> Ilgi bölgesi içine pipet hareket ve enjeksiyon tetikler. Mümkün olduğunca çabuk pipet dışarı atın. Emin kalp düzgün DNA / hücre enjeksiyonu sonra dayak olun. </li></ol> 4.. Embriyo, İzole Kalp ve Eksplantasyon Kültür <ol><li> Penisilin / streptomisin, 37 ° C&#39;de önceden ısıtılmış ve% 40 O2 ile oksijen ile takviye edilmiş% 25 M2 ortamı ve% 75 sıçan serum içinde kültür E9.5 embriyolar. </li><li> , 25 ml&#39;lik bir cam tüp içinde 2 ml kültür ortamı nazikçe embriyo ekleyin ve boru üzerine kapak vidalanarak önce% 40 O2 ile oksijenat. Döner ya da (30 devir / dakika) çalkalanarak 37 ° C&#39;de 36 saate kadar inkübe edin. </li><li> Istediğiniz zaman noktasına (örneğin 24 saat) At, ilk DE, kalpleri dokunmadan, ince forseps ile dikkatlice kalpleri teşrihEmbriyoların capitating; kalp uzak çıkış yolunu kullanarak dışarı çekerek ÖTV kolaydır. </li><li> Kültür, 12 oyuklu bir plaka içerisinde geçen bir Matrigel ile kaplanmış bir ek üzerine% 50 FCS ile DMEM içinde 36-48 saat boyunca bir kalp izole edilmiştir. Kalp kültürünün 15 geliştirilmiş bir protokol için Dyer ve Patterson (2013) bakınız. </li><li> Ilgili bölgenin herhangi bir eksplant yapın. Bir örnek olarak, kollajen tip 1 jel 16 üzerinde 48 saat için atriyo-ventriküler kanal (AVC) ve kültür teşrih. </li></ol> Kalp I n utero 5. Ultrason eşliğinde Enjeksiyon <ol><li> Ultrason makinesi ve mikropüskürtücünün Kurulum: <ol><li> Bir ray üzerinde 40 MHz transdüser ve mikroenjeksiyon kurulum ile yüksek çözünürlüklü ultrason sistemi kullanın. </li><li> Enjeksiyon başına 69 nl de mikroenjektör üzerinde enjeksiyon ses seviyesini ayarlayın. Mikropüskürtücüden programlama için üreticinin mikroenjeksiyon kılavuzuna bakın. </li></ol></li><li> Microi hazırlanmasınjection kurulum ve enjeksiyon: <ol><li> Mikroenjektör bir cam mikropipet yerleştirin. Maksimum hacme kadar aspire verimli enjeksiyon, ilk kapladıkları mineral yağ ile pipet iç tarafını sağlamak. Daha sonra, iğne içindeki yağın 1-2 mm&#39;lik bir uzaklık bırakarak yeniden yağ çıkarın. </li><li> Maksimum ses ulaşılana kadar enjektat aspire. Bu ucu künt ve enjeksiyon daha zor hale getirecek gibi iğne ucu ile herhangi yüzeylerine dokunmayın için dikkatli olun. </li><li> Enjeksiyon sırasında embriyoları içeren uterin boynuzu stabilize etmek için, merkezi kesilmiş küçük bir yarık ile donatılır, ince silikon membran ile kaplı ortasında bir delik olan bir tadil edilmiş Petri kabı (2.5 cm çaplı), kullanımı ve insizyon üzerinde konumlandırmak . Yemeğin kenarlarının altında kil 3-4 yığınları konumlandırarak fare taşıma masaya Petri stabilize. </li></ol></li><li> Enjeksiyon prosedürü: <ol><li> Önce anestezi için (istenen embriyonik aşamada) hamile bir fare karın Tıraşsia saç kaldırmak için. Kalıntı tüylerden ve% 70 etanol ile sterilize etmek için, bir kimyasal saç temizleme maddesi ile karın tedavi. </li><li> Bir maske ile oksijen / izofluran ile hamile bir fare anestezisi. Prosedürün geri kalan kısmı boyunca 1-1.5%, ardından ilk anestezi için,% 100 oksijen içinde% 3-5 izofluran kullanın. Fare yeterince hafifçe pençeleri ve / veya kuyruk kısma anestezi emin olun. </li><li> (37 ° C ısı ayarlı) fare taşıma masaya fare sırtüstü yerleştirin ve korneanın su kaybını önlemek için yağlayıcı ile gözlerinizi kapayın. </li><li> Elektrotlar üzerinde elektrot jeli uygulayın ve kalp hızı, solunum hızı ve EKG izlemek için elektrotlara pençeleri bantlayın. Vücut sıcaklığını izlemek için bir rektal termometre yerleştirin. </li><li> İlk fare görselleştirme ve ultrason ile embriyolar sayarak hamile olduğunu doğrulayın. Karın ultrason jeli uygulayın ve mesane üzerinde tarama kafasına yerleştirin. Tutarlılık için, ilk olarak mesane görselleştirmekve mesane konumdan başlayarak, sol ve sağ embriyolar rahim boynuzları sayılır. Embriyonik kalpleri normal yenerek emin olun. </li><li> Fare hamile ise, kil ile gelecek kesi yukarıda Petri kabı yerleştirin. Çanak direkt temas halinde olduğunu böylece biraz karın üzerine çanak basın. </li><li> Çanak çıkarın ve tekrar karın sterilize. Karın ve periton açmak için, yaklaşık 0.75-1 cm vajina üzerinde, bir 1.5-2 cm ventral orta hat kesi olun. Iç organlara zarar görmesini önlemek. </li><li> Forseps ile sol veya sağ uterin boynuz Exteriorize, yavaşça yemeğin silikon zarından çekin ve tekrar kil üzerine çanağı stabilize. Önlemek kapsamlı bu uterus damarları ve kadın ve / veya embriyoların erken ölüm kanamaya neden olabilir bu yana, çekme ya da manipülasyon. </li><li> Embriyolar enjekte edildiği, yeterli kayıt tutulmasını sağlamak için tekrar embriyolar saymak. </li><li> U üzerinde ultrason jeli uygulayıngörüntü Terine boynuzları kalp ve dehidratasyonu önlemek için. </li><li> Görüntü ilk embriyo enjekte edilecek. Embriyonik kalbin normal dayak kontrol edin ve embriyonun kaudal-kafatası ve sağ-sol yönelim kayıtlarını tutmak. Gerekirse, uygun yönlenmesinin sağlanması için hafifçe uterin boynuzu yerleştirin. Bu zor ise, bir sonraki embriyo geçmek. </li><li> Biraz (Şekil 3) perikard dışında, embriyo üzerinde 45 ° açı iğne konumlandırmak için mikroenjeksiyon iğne ile dikkatlice rahim delinme. Bu atriyoventriküler oluk (Şekil 3) doğru çekiyor, böylece epikardiyal hücrelerin etiketlenmesi için, görüntü dört odacık görüntüsü kalp ve iğne pozisyon. Açısı ayarlanabilir gerekiyorsa, iğneyi çekin ve yeniden konumlandırmak. Bu iğneyi bozabilecek yana, rahim içinde iğne ile açısını ayarlamak etmeyin. Böyle bacaklarda veya plasenta gibi diğer dokuları, delinmesiyle kaçının. </li><li> Iğne taşımakperikard duvara ve yumuşak, ama hızlı hareket ile delinme. Genel olarak, orada bazı direnç olacak, fakat çok hızlı iğne hareket iğne ucu kalbi kendisi delinmeye neden olabilir. Ucu atriyoventriküler oluk perikard uzayda bitmelidir. Perikardiyal kanama durumunda, kan hücreleri, beyaz bir kar-benzeri bir model olarak görünür olacaktır. Bu durumda, embriyo enjekte durdurmak ve başka bir embriyo geçmek. </li><li> Enjekte edilecek enjekte edilir. Kalpler gelişimi üzerine olumsuz etkiyi önlemek için perikard uzaya maksimum 700 nl enjekte edilir. Perikardiyal kese hafif, geçici şişlik uygun enjeksiyon izleyin. </li><li> Enjeksiyonu takiben, dışarı iğneyi çekin ve enjektat hala iğne doku parçaları tarafından tıkanmış değildi sağlamak için çıkarılır olabilir onaylamak. </li><li> Görüntü işleme tablo konumlandırmak ve sonraki embriyo enjekte. Önlemek için (bir uterin boynuz) 3-4 maksimal enjekte edilen embriyoların sayısını tutunzıt uterin boynuzu kontrol embriyoları için izin vermek için ve prosedür, embriyo gelişimini rahatsız değil sağlamak için, anestezi genişletilmiş. </li><li> Embriyo istenilen sayıda enjekte ettikten sonra, fazla ultrason jeli kaldırın ve yavaşça onun uygun pozisyonda karın içine geri uterin boynuz yerleştirin. </li><li> Bir periton ve karın kasları için ameliyat dikiş ipliğinin bir tabaka ve cilt için dikişin ikinci bir katman kullanarak maternal karın kapatın. </li><li> Ağrı kesici ilk dozu ile fare enjekte edilir. Önceki 12 saat aralıklarla anestezi ve üç ek enjeksiyonları biten 0.05-0.1 mg / kg Buprenorphine 15 dakika bir enjeksiyonunu kullanın. </li><li> Anestezi durdurun ve prosedür yeterli kurtarma için fareyi izlemek. Ev izlem süresi için arzu edilen tek bir kafes içinde gebe fare. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Mummery, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes:+a+methods+overview.">Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview.</a> Circ. Res. 111, 344-358 (2012).</li><li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-organ+tissue+engineering:+decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds.">Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).</li><li>Dickinson, L. E., Kusuma, S., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstructing+the+differentiation+niche+of+embryonic+stem+cells+using+biomaterials.">Reconstructing the differentiation niche of embryonic stem cells using biomaterials.</a> Macromol. Biosci. 11, 36-49 (2011).</li><li>Van Vliet, P., Zaffran, S., Wu, S., Puceat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cardiac+development:+a+view+from+stem+cells+to+embryos.">Early cardiac development: a view from stem cells to embryos.</a> Cardiovasc. Res. In press, (2012).</li><li>Cai, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myocardial+lineage+derives+from+Tbx18+epicardial+cells.">A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells.</a> Nature. 454, 104-108 (2008).</li><li>Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenotransplantation+of+human+stem+cells+into+the+chicken.">Xenotransplantation of human stem cells into the chicken.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Liu, A., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+limb+and+brain+patterning+in+early+mouse+embryos+by+ultrasound-guided+injection+of+Shh-expressing+cells.">Alteration of limb and brain patterning in early mouse embryos by ultrasound-guided injection of Shh-expressing cells.</a> Mech. Dev. 75, 107-115 (1998).</li><li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-guided+microinjection+into+the+mouse+forebrain+in+utero+at+E9.5.">Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+recombinase:+the+universal+reagent+for+genome+tailoring.">Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring.</a> Genesis. 26, 99-109 (2000).</li><li>Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+cells+for+tracking+cell+lineage+and+clonal.">Tracing cells for tracking cell lineage and clonal.</a> Dev. Cell. 21, 394-409 (2011).</li><li>Phoon, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tools+for+the+developmental+biologist:+ultrasound+biomicroscopy+of+mouse+embryonic+development.">Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development.</a> Pediatr. Res. 60, 14-21 (2006).</li><li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+lentiviral+vectors.">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).</li><li>Dyer, L. A., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Ex+vivo+Culture+Method+for+the+Embryonic+Mouse.">A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse.</a> J. Vix. Exp. , (2013).</li><li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels:+a+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue.">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Yukarıda tarif edilen intra kardiyak ex vivo enjeksiyon protokolleri orta aşama (E9.5-E11.5) fare embriyo en az 48 saat boyunca miyokard fonksiyonu korumak için tasarlanmıştır. Bu enjeksiyon yaklaşımlar DNA ya da hücre konumsal hedeflenen enjeksiyon için izin verir. Şekiller 1-3 de gösterilen birkaç örnek ex vivo ve bu endokardiyal veya epikardiyal hücre EMT olarak kısıtlı kalp bölgelerinde yer alan gelişimsel süreçlerinin vivo moleküler mekanizmalar...

Daha on yıl önce, insan embriyonik kök hücreleri (HuESCs) insan blastosistlerin 1 elde edilmiştir. O zamandan beri, bu hücreler, insan gelişim biyolojisi karşılanmamış sorular adresleri önemli bir araştırma alanının konusu haline gelmiştir. HuESCs ayrıca rejeneratif tıpta umut sağladı. Son yıllarda, insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) 2 genetik hastalık modelleri sağlayan, hastaya özgü somatik hücrelerinden elde edilmiştir. Kalp soy 3 de dahil olmak üzere çeşitli hücre soyları, doğru ya da embriyonik uyarılmış pluripotent kök hücrelerin farklılaşması için in vitro protokol birçok rapor edilmiştir. Farklılaşmış hücreleri genellikle RNA ve protein ifadesi, immun boyama, ve / veya in vitro fonksiyonel testler analizi ile fenotiplenir. Bununla birlikte, pluripotent kök hücresi türevleri tam cel elde olup olmadığını test etmek için uygun bir oluşum safhasındaki bir ortamda yerleştirilmesi gerekirl kendi embriyonik meslektaşı kaderi ve bölgesel uyaranlara yanıt olarak gerçek in vivo fonksiyonu özetlemek ister. Doku mühendisliği umut verici olmasına rağmen, henüz gelişmekte olan embriyonik doku 4,5 in vivo olarak uygun tüm bilinen ve bilinmeyen ipuçları sağlamaz. Fare embriyoları içeren embriyolar, boyalar veya retroviral vektörlerle hücre etiketleme, kalp gelişimi 6 sırasında hücre soylarının embriyonik kökeni gibi önemli bilgileri getirdi. Örneğin, izole edilmiş kalpler in vitro kültürü ile, ardından ex vivo fare embriyoları, en perikardiyal boşluğu içine enjeksiyon boya, epikardiyal hücreleri ve bunların soyundan 7 etiketlemek için kullanıldı. Ancak, boya ve retroviral hücre etiketleme çoğunlukla 8 daha kolay erişilebilir hala az gelişmiş organ veya tavuk embriyolar, erken fare embriyoları tatbik edilmiştir. Bir istisna e hedef kolaydır, beyin tarafındanmbryos 9,10. Böyle bir yaklaşım, henüz dayak embriyonik fare kalp tatbik edilmemiştir. Boyalar ya da virüs doğrudan etiketleme tamamlayıcı olarak ve daha ileri evre fare embriyo ve yetişkin farelerde izleme soy gerçekleştirmek için, hücre etiketleme yaklaşımı Cre / Lox teknolojisi kullanılarak transgenik farelerin analizi ile kombine edilmiştir. Cre / Lox yaklaşımı 11 ancak rekombinazın ekspresyonunu tahrik etmek için kullanılabilir genomik düzenleyici bölgelerin uzaysal özgüllük ve Cre / Lox rekombinasyon 12 verim nedeniyle bazı sınırlamalar vardır. Sadece Cre ekspresyonunu tahrik etmek için kullanılan düzenleyici bölgesi aktivasyonunun ardından bir ön etiket gibi Bundan başka, bu yaklaşım, tam hücre kaderin hücre göçü odaklı edinim özel soruları gidermez. Ayrıca bariz etik sorunları için insan embriyosu için geçerli olamaz. Bu sınırlamalar göz önüne alındığında, biz yeni p bir dizi tasarlanmışhedeflenmiş bölgelerinde bu gibi floresan boyalar, virüs, ve bu shRNAs DNA-bazlı hücre etiketleme vektörleri gibi gen ekspresyonu modülatörlerinin veya E9.5 ve gelişiminin sonraki evrelerinde de fare embriyo hücreleri gibi hücre etiketleme çeşitli ajanlar enjekte rotocols kalp. DNA / hücre enjeksiyonları Stereomikroskopta ve 48 saat veya 48-72 saat boyunca izole kalp ya da embriyonik eksplant kültürü kadar ex vivo embriyo kültürü ile birlikte basit bir mikroenjeksiyon cihazı kullanın. Biz de rahimde fare embriyonik gönlünde bir ultrason aracılı mikroenjeksiyon protokol rapor. Bu teknik embriyoların 13 gelişimini izleme sağlar ve injectates ve / veya etiketli hücrelerin uzun süreli takip için izin verir. Biz, bu yaklaşımlar organın işlevini korumak ve kök hücre potansiyeli in vitro test daha temsili bir ortam temin ettiği bulunmuştur. Ayrıca göç takip fırsat sağlarkendi kaderini izlemek hücreleri etiketli ve / veya enjekte. Sonuç olarak, bu bölge, doku desenleme ve önemli biyolojik süreçlerin daha iyi bir anlayış elde edilmelidir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="986">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Setups / Hardware</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:411px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">40 MHz Transducer</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td>MS550S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microinjector</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjector&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td>5242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td>5171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Nitrogen</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>required to pressurize the injector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Rail system</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">rotator</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>to rotate glass tube with embryos inside the incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Standard incubator</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>5% CO2, 37 C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:175px;">Zeiss</td>
			<td style="width:104px;">Discovery. V8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Vevo 2100</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microinjection</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">borosilicate capillary tubes</td>
			<td style="width:175px;">World Precision Instrument</td>
			<td style="width:104px;">KTW-120-6</td>
			<td>1.2 mm external diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pipette puller&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sutter</td>
			<td style="width:104px;">Model P87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">microinjection needles</td>
			<td>Origio-Humagen&#160;</td>
			<td>C060609</td>
			<td>OD/ID 1.14mm/53mm, with 50/35 um OD/ID tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hamilton syringes&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Petridishes</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral oil&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td>M8410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Silicon membrane</td>
			<td style="width:175px;">Visualsonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>4.3x4.3 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Play-Doh</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:175px;">Vet One</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hair removal agent&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Nair</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:297px;">eye lubricant</td>
			<td style="width:175px;">Optixcare</td>
			<td>31779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Electrode gel (Signa)</td>
			<td style="width:175px;">Parker</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Suture</td>
			<td style="width:175px;">Sofsilk 5-0</td>
			<td style="width:104px;">S1173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ultrasound gel</td>
			<td style="width:175px;">Aquasonic</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride)</td>
			<td style="width:175px;">Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.</td>
			<td style="width:104px;">NDC 12496-0757-1</td>
			<td>0.05-0.1 mg/kg in saline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone Elastomer</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Glass petridishes</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>60mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">insect pins&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Media and culture reagents</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optimem medium</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">51985026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M2 medium&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Eagle Medium</td>
			<td style="width:175px;">Lonza</td>
			<td style="width:104px;">BE12-640F</td>
			<td>high glucose and 50% rat serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M16 medium&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">M7292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">rat serum</td>
			<td style="width:175px;">Janvier</td>
			<td style="width:104px;">ODI 7158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pennicilin/streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">15140-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">oxygen 40%</td>
			<td style="width:175px;">Air liquid</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>required to oxygenate the embryo culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">fetal calf serum</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:104px;">RVJ35882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">matrigel</td>
			<td style="width:175px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">collagen type I</td>
			<td style="width:175px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">354236</td>
			<td>to coat culture dishes for explant culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">culture dishes</td>
			<td style="width:175px;">Dutcher /Orange</td>
			<td style="width:104px;">131020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Injectates</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CDCFDA-SE&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Molecular Probes&#160;</td>
			<td>C1165</td>
			<td>25mg/ml DMSO. Store at -20 C. Dilute 1:100-200 in saline before use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PGK-GFP-expressing lentivirus&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>~8E9 transducing units/ml DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell labeling and injection in developing embryonic mouse hearts

In vitro protokol embriyonik veya pluripotent kök hücre-türevlerinin kaderini test edilmesi zorunlu olarak in vivo potansiyel yansıtmaz tartışmalı sonuçlara yol açmıştır. Tercihen, bu hücreler, belirli bir fenotip elde etmek için uygun bir oluşum safhasındaki bir ortamda yerleştirilmelidir. Ayrıca, boya veya retroviral vektörler ile hücrelerin etiketlenmesi sonra fare çalışmaları izleme hücre soyu hala az gelişmiş organları ile erken evre fare embriyoları çoğunlukla sınırlı kalmıştır. Bu sınırlamaları aşmak için, E9.5 ve gelişiminin sonraki aşamalarında fare embriyosunda kalp hedeflenen bölgelerde çeşitli maddeler enjekte etmek, standart ve ultrason aracılı mikroenjeksiyon protokolleri tasarlanmıştır. Embriyonik eksplant ya da embriyolar ya da daha fazla kültürlendi utero geliştirmeye bırakılır. Bu maddeler, fluoresan boyalar, virüs, shRNAs veya hücre-türevi projenitör hücrelerini içerir. Bizim yaklaşımlar fu korunması için izinorganın nction göçünü ve işaretlenmiş ve / veya enjekte edilen hücrelerin kaderini gözlenerek. Bu teknolojiler diğer organlara uzatılabilir ve gelişim biyolojisinde önemli biyolojik soruları için çok yararlı olacaktır.

Yukarıda tarif edilen enjeksiyon protokolleri kullanılarak, hücreler, &#39;etiketlenmiş ve / veya embriyonik fare kalp içine enjekte edilebilir. Kavramının kanıtı olarak, birkaç örnek enjeksiyon protokolü ve ex vivo AVC eksplant, izole edilmiş kalp veya bir bütün olarak embriyo kültürü (Şekil 1) bir araya getirilmiş olduğu gösterilmiştir. Şekil 1, hücre enjekte edilmeden önce embriyonun hazırlanışını göstermektedir. Y...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts at JoVE.com

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Biz, (E) 9.5 ve daha sonraki aşamalarında embriyonik gün fare embriyoları olan embriyonik veya pluripotent hücrelerinden elde edilen iç ve aşılanmış hücrelerden hücre kaderine ve fenotipi hem izlenmesi amacıyla, boyalar enjekte DNA vektörleri, virüs, ve hücreler, bir dizi yöntem tarif gelişme.

Embriyonik Fare Kalpler Gelişmekte Hücre Etiketleme ve Enjeksiyon

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

cell-labeling-and-injection-in-developing-embryonic-mouse-hearts

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Görüntüleme.  Aix-Marseille University.  Biz, (E) 9.5 ve daha sonraki aşamalarında embriyonik gün fare embriyoları olan embriyonik veya pluripotent hücrelerinden elde edilen iç ve aşılanmış hücrelerden hücre kaderine ve fenotipi hem izlenmesi amacıyla, boyalar enjekte DNA vektörleri, virüs, ve hücreler, bir dizi yöntem tarif gelişme. 

Video: Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

Nöronlar FM Etiketleme kullanarak ölçüm ekzositoz

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Biyoloji

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Manyetik Rezonans Görüntüleme için in vitro Etiketleme

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Elektron Mikroskobu için embriyo Hazırlık Drosophila Embriyonik kalp tüpü

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

Fare Embriyonik Germinal Hücreleri İzolasyon ve türetilmesi

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

Yetişkin Zebra balığı retro-orbital Enjeksiyon

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

Tek hücreli fare Koni fotoreseptörlerin Emiş Kayıtlar

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

Video Biyoinformatik İnsan Embriyonik Kök Hücre Colony Büyüme Analizi

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In vivo Görüntüleme ve Yumurtalık Kanseri Ortotopik Fare Modeli Tedavi Tedaviler

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Için bir sistem<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Pankreas&gt; ekimi

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

Orofacial clefts are the most frequent craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal facial development3. In human and mouse, initial growth and patterning of the face relies on several small buds of tissue, the facial prominences4,5. The face is derived from six main prominences: paired frontal nasal processes (FNP), maxillary prominences (MxP) and mandibular prominences (MdP). These prominences consist of swellings of mesenchyme that are encased in an overlying epithelium. Studies in multiple species have shown that signaling crosstalk between facial ectoderm and mesenchyme is critical for shaping the face6. Yet, mechanistic details concerning the genes involved in these signaling relays are lacking. One way to gain a comprehensive understanding of gene expression, transcription factor binding, and chromatin marks associated with the developing facial ectoderm and mesenchyme is to isolate and characterize the separated tissue compartments.
Here we present a method for separating facial ectoderm and mesenchyme at embryonic day (E) 10.5, a critical developmental stage in mouse facial formation that precedes fusion of the prominences. Our method is adapted from the approach we have previously used for dissecting facial prominences7. In this earlier study we had employed inbred C57BL/6 mice as this strain has become a standard for genetics, genomics and facial morphology8. Here, though, due to the more limited quantities of tissue available, we have utilized the outbred CD-1 strain that is cheaper to purchase, more robust for husbandry, and tending to produce more embryos (12-18) per litter than any inbred mouse strain8. Following embryo isolation, neutral protease Dispase II was used to treat the whole embryo. Then, the facial prominences were dissected out, and the facial ectoderm was separated from the mesenchyme. This method keeps both the facial ectoderm and mesenchyme intact. The samples obtained using this methodology can be used for techniques including protein detection, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, microarray studies, and RNA-seq.

A protocol for separation of embryo facial ectoderm and mesenchyme is described. We use Dispase II to treat whole embryos first, dissect whole facial prominences out, and then separate the facial ectoderm and mesenchyme.

Fare Embriyonik Yüz Ektoderm ve mesenchyme ayrılması

 Orofacial clefts are the most frequent  craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal ...