Bu yöntemi kullanarak doğrudan farz embriyodaha deneysel manipülasyonlar olmadan kalp tüpü oluşumu, döngü ve tam oda oluşumu nu muayene edebilirsiniz. Her ne kadar, biz bir örnek olarak MLC-2v-tdTomato fareler kullanmak, bu basit yöntem yaygın diğer floresan muhabir fare hatları ile kullanılabilir. Bu protokolün en büyük avantajı çok basit olması ve herhangi bir karmaşık teknik veya ekipman gerektirmemesidir.
Normal laboratuar ortamında yapılabilir. Erkek fareler ile kadın çifte sonra, hem MLC-2v-tdTomato 8 ila 10 hafta eski, vajinal fişler için barajlar kontrol edin her sabah. Gebe barajlar lay, farklı günlerde post coitum ötanazi, supine pozisyonda ve sprey karın% 70 etanol ile.
Hem deri hem de karın duvarı nın kesisi ile karın boşluğunu açmak için keskin cerrahi makas ve forseps kullanın. Karın boşluğunun dorsal kısmında ikili rahim boynuzları yerini aldıktan sonra, dikkatle her iki tarafta oviducts üzerinde kesmek için keskin cerrahi makas ve forseps kullanarak tüm rahim ayırın. Buz soğuk PBS ile 10 santimetre petri çanak tüm parçalanmış rahim yerleştirin.
Keskin cerrahi makas ve forceps kullanarak, dikkatle rahim boynuzu boyunca her amniyotik kese ayırın. Her embriyobuz soğuk PBS ile dolu bir 35 milimetrelik kültür plakası içine aktarmak için cımbız kullanın. Keskin cerrahi makas ve forceps kullanarak, amniyotik bir kese açın ve göbek kordonu keserek her embriyo ortaya çıkarmak ve daha sonra embriyolara zarar vermeden mümkün olduğunca ekstra embriyonik dokuları kesmek.
Fiber optik mikroskop aydınlatıcı ile bir diseksiyon mikroskobu altında, embriyonun başını kesip 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın 100 mikrolitre tampon A daha sonra epifloresan görüntüleme sonuçları ile ilişkili genotipleme için. İnce profeler kullanarak embriyonun göğsünü açın. Keskin cerrahi makas ve forceps ile, uzak akciğerler ve vaskülatür kalp kaldırın.
Parçalanmış embriyonik kalbi PBS ile 35 milimetrelik bir kültür plakasına aktarmak için cımbız kullanın. Bir epifloresan diseksiyon mikroskop altında fare embriyonik kalpleri ile plaka yerleştirin. Gelişmekte olan ventriküller sınav karşı karşıya olduğu gibi embriyonik kalpleri konumlandırmak için ince forseps kullanın.
Parlak alan modunda 0,63x hedefi kullanarak odak noktasını ayarlayın. Parlak alan pozlamaları alın ve birden çok görüntü yakalayın. tdTomato ifadesini görselleştirmek için fiber optik mikroskop aydınlatıcısını kapatın ve filtreyi kırmızı floresan için ayarlayın.
Gerekirse görüntünün yeniden netleşmesini ayarlayın, parlaklığı ve kontrastı ayarlayın, kırmızı floresan pozlamalar yapın ve birden çok görüntü yakalayın. Embriyo genotipleme için, tampon A'da daha önce izole edilmiş kafa örneklerini 100 santigrat derecede 30 dakika kaynatın. Santrifüj 11 iki dakika, 360 kez G.Transfer 20 mikrolitre supernatant yeni bir 1.5 mililitretüp içine tampon B ve mix 20 mikrolitre ile.
Bir DNA şablonu olarak karışık supernatant 4,5 mikrolitre kullanın ve 10 mikromolar özgü ileri ve ters astarlar, 2x-premix polimeraz ve reaksiyon tampon 10 mikrolitre her 0,5 mikrolitre ile birleştirmek ve daha sonra 20 mikrolitre toplam hacmine su ekleyin. El yazmasında açıklandığı gibi bir PCR çalıştırın. 100 baz çifti DNA merdiveninde tamamlanan reaksiyonu %1 agarose jelüzerine yükleyin ve 1x TAE tamponunda 140 voltta 25 dakika çalıştırın.
Tamamlanmış jeli uv transilluminator'a yerleştirin ve DNA bantlarını tanımlamak için UV ışığını açın. MLC-2v kalp gelişimi sırasında ventriküler oda belirtimi için erken belirteç olarak kabul edilir. MLC-2v-tdTomato muhabiri knock-in farelerde, E8.0 de lineer kalp tüpü tdTomato nispeten zayıf ifade e8.5 de embriyoların tam monte epiflourescent görüntüleme kullanılarak gösterildiği gibi daha güçlü hale gelir.
Diseksiyonlu kalbin tam montaj epiflourescent görüntüleme seksiyonu kullanılarak fare kalp gelişimi sırasında ventriküler oda oluşumu kolayca belirlenebilir. E10.5'teki fare embriyosu olan bütün bir fare embriyonun kesiştiği kalpte MLC-2v-tdTomato muhabiri nin ifadesi, giriş yolu, çıkış yolu veya gelecekteki atria'da değil, kalbin ventriküler kısmında gösterilmiştir. E12.5'ten E13.5'e kadar, tdTomato muhabiri sadece dört odalı kalbin karıncıklarında ifade edilir.
Benzer ventriküler spesifik ekspresyon deseni E16.5'teki kesitli fare embriyosuna gösterilmiştir. Tüm görüntülemeden sonra, embriyoların genotipliği PCR genotipleme için iki set astar kullanılarak belirlendi ve tdTomato knock-in alel, heterozigot ve yabani tip embriyoları taşıyan homozigot embriyolar doğrulandı. Bu yöntem oldukça basit ve gerçekleştirmek kolaydır.
Kritik adım embriyonik kalpleri incelemektir. Kalp gelişimi sırasında kardiyak anatomi anlamak başarıyla tüm embriyo kalp izole etmek için gereklidir.
