We thank Dr. John Ohlfest and Dr. Stacey Decker13 for the generous gift of plasmids and for the training provided to master this method. We thank Marta Dzaman for help with standardizing the Hematoxylin-Eosin staining procedure of paraffin-embedded sections. We also thank Molly Dahlgren for perusing this manuscript and providing helpful suggestions. This work is supported by NIH/NINDS grants to MGC and PRL, Leah&#8217;s Happy Hearts Foundation grant to MCG and PRL. Alex&#8217;s Lemonade Foundation young Investigator Award and the St. Baldrick&#8217;s Foundation Fellowship to CK.

<ol>
	<li>Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standards+of+care+for+treatment+of+recurrent+glioblastoma--are+we+there+yet.">Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma--are we there yet.</a> Neuro Oncol. 15 (1), 4-27 (2013).</li><li>Dai, C., Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+models.">Glioma models.</a> Biochim Biophys Acta. 1551 (1), M19-M27 (2001).</li><li>Houchens, D. P., Ovejera, A. A., Riblet, S. M., Slagel, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+brain+tumor+xenografts+in+nude+mice+as+a+chemotherapy+model.">Human brain tumor xenografts in nude mice as a chemotherapy model.</a> Eur J Cancer Clin Oncol. 19 (6), 799-805 (1983).</li><li>Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+multiforme:+the+terminator.">Glioblastoma multiforme: the terminator.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6242-6244 (2000).</li><li>Candolfi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+glioblastoma+models+in+preclinical+neuro-oncology:+neuropathological+characterization+and+tumor+progression.">Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression.</a> J Neurooncol. 85 (2), 133-148 (2007).</li><li>Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+modeling+of+gliomas+in+mice:+new+tools+to+tackle+old+problems.">Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems.</a> Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).</li><li>Rojiani, A. M., Dorovini-Zis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomeruloid+vascular+structures+in+glioblastoma+multiforme:+an+immunohistochemical+and+ultrastructural+study.">Glomeruloid vascular structures in glioblastoma multiforme: an immunohistochemical and ultrastructural study.</a> J Neurosurg. 85 (6), 1078-1084 (1996).</li><li>Hambardzumyan, D., Amankulor, N. M., Helmy, K. Y., Becher, O. J., Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Adult+Gliomas+Using+RCAS/t-va+Technology.">Modeling Adult Gliomas Using RCAS/t-va Technology.</a> Translational Oncology. 2 (2), 89-95 (2009).</li><li>Friedmann-Morvinski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiation+of+neurons+and+astrocytes+by+oncogenes+can+induce+gliomas+in+mice.">Dedifferentiation of neurons and astrocytes by oncogenes can induce gliomas in mice.</a> Science. 338 (6110), 1080-1084 (2012).</li><li>Lynes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral-Induced+High-Grade+Gliomas+in+Rats:+The+Effects+of+PDGFB,+HRAS-G12V,+AKT,+and+IDH1-R132H.">Lentiviral-Induced High-Grade Gliomas in Rats: The Effects of PDGFB, HRAS-G12V, AKT, and IDH1-R132H.</a> Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutic. , (2014).</li><li>Uhrbom, L., Hesselager, G., Nister, M., Westermark, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+brain+tumors+in+mice+using+a+recombinant+platelet-derived+growth+factor+B-chain+retrovirus.">Induction of brain tumors in mice using a recombinant platelet-derived growth factor B-chain retrovirus.</a> Cancer Res. 58 (23), 5275-5279 (1998).</li><li>Marumoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+mouse+glioma+model+using+lentiviral+vectors.">Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors.</a> Nat Med. 15 (1), 110-116 (2009).</li><li>Wiesner, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+induction+of+genetically+engineered+brain+tumors+in+mice+using+plasmid+DNA.">De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA.</a> Cancer Res. 69 (2), 431-439 (2009).</li><li>Bailey, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+of+the+Percival+Bailey-Cushing+classification+of+gliomas.">Genesis of the Percival Bailey-Cushing classification of gliomas.</a> Pediatr Neurosci. 12 (4-5), 261-265 (1985).</li><li>Patel, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+highlights+intratumoral+heterogeneity+in+primary+glioblastoma.">Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma.</a> Science. 344 (6190), 1396-1401 (2014).</li><li>Agnihotri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma,+a+brief+review+of+history,+molecular+genetics,+animal+models+and+novel+therapeutic+strategies.">Glioblastoma, a brief review of history, molecular genetics, animal models and novel therapeutic strategies.</a> Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 61 (1), 25-41 (2013).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genomic+characterization+defines+human+glioblastoma+genes+and+core+pathways.">Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways.</a> Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).</li><li>Ivics, Z., Izsvak, Z., Minter, A., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+functional+domains+and+evolution+of+Tc1-like+transposable+elements.">Identification of functional domains and evolution of Tc1-like transposable elements.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (10), 5008-5013 (1996).</li><li>Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+reconstruction+of+Sleeping+Beauty,+a+Tc1-like+transposon+from+fish,+and+its+transposition+in+human+cells.">Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells.</a> Cell. 91 (4), 501-510 (1997).</li><li>Hackett, P. B., Ekker, S. C., Largaespada, D. A., McIvor, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+beauty+transposon-mediated+gene+therapy+for+prolonged+expression.">Sleeping beauty transposon-mediated gene therapy for prolonged expression.</a> Adv Genet. 54, 189-232 (2005).</li><li>Ammar, I., Izsvak, Z., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sleeping+Beauty+transposon+toolbox.">The Sleeping Beauty transposon toolbox.</a> Methods Mol Biol. 859, 229-240 (2012).</li><li>Mates, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evolution+of+a+novel+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposase+enables+robust+stable+gene+transfer+in+vertebrates.">Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates.</a> Nat Genet. 41 (6), 753-761 (2009).</li><li>Koso, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+mutagenesis+identifies+genes+that+transform+neural+stem+cells+into+glioma-initiating+cells.">Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (44), E2998-E3007 (2012).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COX-2+blockade+suppresses+gliomagenesis+by+inhibiting+myeloid-derived+suppressor+cells.">COX-2 blockade suppresses gliomagenesis by inhibiting myeloid-derived suppressor cells.</a> Cancer Research. 71 (7), 2664-2674 (2011).</li><li>Geurts, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+genomes+of+human+cells+by+the+sleeping+beauty+transposon+system.">Gene transfer into genomes of human cells by the sleeping beauty transposon system.</a> Molecular Therapy: The Journal Of The American Society Of Gene Therapy. 8 (1), 108-117 (2003).</li><li>Dickins, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+tumor+phenotypes+using+stable+and+regulated+synthetic+microRNA+precursors.">Probing tumor phenotypes using stable and regulated synthetic microRNA precursors.</a> Nat Genet. 37 (11), 1289-1295 (2005).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+double+markers+reveals+tumor+cell+of+origin+in+glioma.">Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma.</a> Cell. 146 (2), 209-221 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu makalede, biz detay yenidoğan farelerin subventriküler bölgesini çevreleyen hücrelerin içine onkojenik plazmid DNA SB transposase- aracılı entegrasyon kullanarak GBM yeni modeller üretmek için çok yönlü ve tekrarlanabilir bir yöntem. Biz yeni ilgi genleri ile Transposon plasmidlerini oluşturmak için bir protokol mevcut, canlı hayvanlarda tümörlerin ilerlemesini izlemek için nasıl, bu tümörlerin histopatolojik ve immunohistokimyasal özellikleri karakterize nasıl göstermektedir. Laboratuarımızda olarak (Şekil 3) ve diğerleri 13 göstermiştir, bu model güvenilir (1) yalancı palizad nekrozu, (2), damar proliferasyonu, (3), nükleer atipi, (4), anormal mitoz ve da dahil olmak üzere, insan GBM belirgin özellikleri olan tümörler (oluşturur 5) perivasküler ve yaygın işgali. Yenidoğan farelerin kullanılması az ekipman ve se nispeten kolay bir teknik prosedür sağlayan, lojistik açıdan bakıldığında, optimalspesifik genetik değişiklikler ile tümörlerin büyük çaplı hızlı nesil için izin / kurtarma zamanı dırılması. Bu tümörler hayvanlar bağlı genetik değişikliklerin bağlı öngörülebilir medyan sağkalım tümör yükü yenik neden. Son olarak, SB modeli tedavi yanıtı 24 için bir terapötik müdahale ekranı olarak kullanılmıştır. Yenidoğan enjeksiyonlar için kullanılan çözümler hazırlarken dikkate alınması gereken birkaç önemli faktör vardır. DNA çözeltileri, endotoksin serbest ve konsantre edilerek (2-7 ug / ul) enjeksiyonu minimum hacmine imkan vermek için, steril olması gerekmektedir. DNA (N / P oranı) fosfat kalıntısı elde etmek, polietilenimin (PEI), azot kalıntılarının en iyi oranı Bu hücre yüzeyleri üzerindeki anyonik kısımları bağlayan ve endositoz olacak pozitif yüklü parçacık komplekslerinin oluşumunu sağlayan 7&#39;dir. Sitoplazmada kez, ozmotik akını parçacıklar patlama ve encapsulat yaymasına neden olurEd plazma DNA. in vivo jet PEI solüsyonu mM azot kalıntıları olarak ifade edilen 150 arasında bir konsantrasyona sahiptir. Bir mg DNA anyonik fosfat 3 nmol, formülü ile hesaplanabilir gerekli transfeksiyon reaktif miktarda göz önüne alındığında: in vivo jet-PEI = ul / 150 [(mikrogram DNA x 3) N / P oranı x]. Örneğin, DNA 20 ug ihtiyaç vardır, 7 N / P oranı ile 0.5 ug / ul DNA çözeltisi 40 ul hazırlanır. PEI gerekli hacmi 20 * 3 * 7/150 = 2.8 ul olacak. Kadar beş farklı plazmidler aynı anda enjekte edilebilir. Burada sunulan deneyler de lusiferazı kodlayan bir plazmid (SBLuc) üzerine trans Sleeping Beauty transposase teslim. Giriş kısmında zikredildiği gibi, transpozonlar için transposaz moleküllerin oranı uygun olarak aktarılmasını sağlamak için önemlidir. Şeffaf için SB100x plazmidin uygun oranı (empirik olarak tayin edilebilir)Oson DNA plazmid 1: 4 arasındadır. T1: bir ya da iki farklı transpozon plazmidler, örneğin, T1 ve T2 SBLuc oranı kullanıyorsa Bu nedenle, 2: T2 1 olacak 2; ya da 40 ul çözelti içinde 20 ug DNA, toplam SBLuc 4 ug T2 8 T1 ug ve 8 ug ile karıştırılacaktır. T1 ve T2: T3 = 1: 1.33: üç farklı transposon için oran SBLuc olacaktır plazmidler 1.33: 1.33 ve dört transpozonlar için: 1: 1: 1: 1: 1 arasındadır. Bu enjeksiyondan sonra bio-ışıldama, 24-72 saat plasmid DNA alımını kontrol etmek için yararlıdır. Hayvanlar büyüdükçe tümör bir eşik boyutu, koyu pigmentli C57BL6 fareler için yaklaşık 1-2 mm 3 ulaşana kadar, kürk, deri, kafatası ve beyin artan optik yoğunluk, tümör ilerlemesi izlenmesini engeller. Beyaz veya kürk fareler kullanırken onların kürk traş, ya da eğer ışık daha iyi iletim bu farelerde mümkündür. Birkaç sınırlamalar, bu modeli kullanırken dikkat edilmesi gerekir. İlk olarak, genenjekte plazmidlerle kişiye tlc malzeme farklı yerlerde ve kopya sayısı konakçı genomuna rasgele entegre edilebilir. Bu tümör hücreleri ile tümör arasındaki değişkenlik yol açabilir. İkinci olarak, katılan DNA, DNA 25 öncelikle intronik ta tekrar diziler içine yerleştirilir, ancak, ev sahibi genomik DNA kodlama girişim riski mevcuttur. Üçüncü olarak, intraventriküler enjeksiyonlar hayatın 3.-4. haftada klinik görünür ve semptomatik hale genç farelerde hidrosefali küçük ama kalıcı oranı neden olabilir. Farelerin bazı suşları diğerlerinden daha hidrosefali daha yatkındır (yani, C57 / BL6 FVB fazla). Hidrosefali indükleme riskini en aza indirmek için, iğneler, keskin olduğundan emin olmak için, mümkün olan (C57 / BL6 farelerinde az 1 ul) kadar küçük bir hacme enjekte önerilir, çözeltiler ve büyüyen yavrular temin etmek üzere düşük tuzluluğa sahip kafatası bon zamanında kemikleşme için izin vermek amacıyla, gıda zenginleştirilmişes. Son olarak, geç evre tümörleri genellikle biyolüminesans tarafından fareler izlerken dikkat edilmesi gereken nekroz, geliştirmek. Daha düşük bir okuma büyük nekroz alanları ve zorunlu tedavisinin bir sonucu olarak tümör çözünürlüğe sahip gelişmiş bir tümör gösterebilir. Sonuçta, histolojik analiz tümör ilerlemesini değerlendirmek için altın standart olmaya devam etmektedir. Son yıllarda tümör tüm genom dizileme gelişi GBM içinde tekrarlı mutasyona uğramış genlerin rolü keşif kapısını açtı. Sleeping Beauty modeli potansiyel onkojenlerinin veya tümör bastırıcılara doğrulamak için en uygunudur. Kurulu bir SB plazmid omurgasına aday onkogen, fare cDNA dizisini klonlama PDGFβ ligandı ile bu yazıda verilen örnekte olduğu gibi, transfekte edilmiş hücreler içinde ekspresyon teşkil etmesine yol açacaktır. Tümör bastırıcı rolünün değerlendirilmesi etkili bir aday sekansları, SB plazmid omurgası içine klonlanmasıyla gerçekleştirilebilir (birgurupları RNAi kodeks veritabanında 26) örneğin, ikinci nesil mıR kısa saç tokaları sağlam ifadesi oluşturmak için. GBM araştırma alanında güncel tartışma hücre-of kökenli kimliğine ilgilidir. Yakın zamanda, farelerde, nöral kök hücrelerin aşağı-regüle p53 ve NF1 ile indüklenen tümörler oligodendrosit öncü hücreler 27 kaynaklı gösterilmiştir. Sleeping Beauty transpozon modeli kullanarak, benzer çalışmalar diğer genetik değişiklikler tercihli GBMS oluşturmak için kök hücre / öncü hücrelerinin diğer popülasyonları hedef olmadığını test etmek için tasarlanmış olabilir. Bu tür çalışmalardan Bilgi ölçüde GBM etiyolojisinde anlayışımızı geliştirmek ve yeni tedavi yaklaşımları için yollar sağlayacaktır.

Cerrahi, radyasyon tedavisi, kemoterapi ve 1 ile tedavi edildiklerinde glioblastoma multiforme (GBM) 15-21 aylık bir medyan sağkalım, erişkinlerde en sık (% 60) primer beyin tümörü olduğunu. GBM için yeni tedaviler zorunludur. Deneysel tedaviler yeterince insan hastalığının belirgin özelliklerini yeniden hayvan modellerinde test gerektirir. Kemirgenler glioma hücre hatları 2 kullanılarak kimyasal alkilleyici ajanlarla mutagenezini, mikrop hattı veya somatik genetik değişiklikler, ya nakli dahil Stratejiler GBM ikna etmek. En yaygın olarak kullanılan model, beyin içine veya deri altına aynı genotipe sahip hayvanlarda singeneik hücreleri kullanılarak, ya da ortotopikal, glioma hücre hatlarının implantasyonu kullanır; veya ksenojenik hücreler, bağışıklık implante en yaygın insan GBM hücre çizgileri, fare 3 ele geçirildi. Ksenogratflardır intrakranial tümörlerin çalışma için birçok avantaj sunuyoruz: tekrarlanabilirlik kolaylık, Standardized büyüme oranları, ölüm ve tümör lokalizasyonu zamanı. Sözde pallisading nekroz, nükleer atypias, yaygın işgali, mikro-vasküler proliferasyon: implantasyonu ve doğru histolojik yeniden sınırlı yeteneği için kullanılan yapay, invaziv cerrahi yaklaşım insan GBM (WHO Evre IV) karakteristik özellikleri nedeniyle Ancak, bu modeller sınırlamaları var ve glomerüloid vasküler oluşumu 4-7 anormallikler. Onkojenik DNA ile, ya viral vektörlerin 8-12 veya transpozon-aracılı entegrasyon 13 ile somatik hücre genomu değiştirerek GBM İndüksiyon, daha yakından insan hastalığı etyolojisi üretir ve insan GBM histopatolojik özellikleri tartışıldı. Tarihsel, MSS tümörleri sınıflandırılmış gözlendi kökenli algılanan hücreye dayalı olan, hayatta kalma 14 açısından belirleyici bir faktör olacaktır. GBMs birincil ve ikincil olarak sınıflandırılır. Gelişen kanıtlar today birincil glioblastoma 15 derece heterojen doğasına işaret. İkincil GBM (% 15), düşük dereceli astrositom (WHO grade I) ve anaplasic astrositomların malign transformasyon sonucu (WHO grade II), hastalığın erken başlaması, daha iyi prognoz ve gen ifadesinin bir &quot;proneural&quot; modeli ile ilişkili olan primer GBM (% 85) ise geç başlangıçlı, kötü prognoz ve glial (klasik), sinirsel ya da mezenkimal ifade kalıplarını göstermektedir. Gen ifadesinin bu kalıplar tümörün köken gerçek hücre ile ilişkili olsun hala aktif araştırılmaktadır. Veri Biriken GBM&#39;lerde ile ilişkili genetik mutasyonlar kombinasyonu yaşam için öngörü olduğunu göstermektedir. Örneğin, kromozom 1p / 19q, IDH1 mutasyonları, PDGFRα amplifikasyonlar, bir heterozygocity kaybı (LOH) EGFR ekspresyonu, Notch ve Sonic kirpi yolu aktivasyonu, Nf ise, ikincil GBM&#39;lerde, proneural ifade desen ve daha iyi prognoz ile ilişkili1 ve PTEN kaybı ve p53 mutasyonları nöral, klasik, ya da mezenkimal birincil GBM ve kötü prognoz 16,17 ile ilişkilidir. Büyük ölçekli projelerin sıralama gelişi ve test için kullanılabilir sayısız hasta örneklerinin birikimi GBM patogenezinde ve ilerlemesinde ve tedaviler özellikle uygun olabilir bireyselleştirilmiş tıp, olasılığı karıştığı genetik mutasyonlar ve yollar ile ilgili yeni bilgi hazinesi getiriyor Hastanın genetik anormallikler. Sonuçta, sistematik bir şekilde bu mutasyonların ve yolların öngörü değerini değerlendirmek için, ve her durumda olası tedaviler test etmek için, önceden belirlenmiş genetik değişikliklerle GBM hayvan modelleri gerektirmektedir. Genomik DNA transpozon aracılı entegrasyon uygun bir yaklaşım sunmaktadır. Sleeping Beauty transpozon sistemi, transposonların Tc1 / denizci sınıfının üyesi, bir çok adım prosedürü içinde (inşa) &quot;uyanmış&quot; olduatıl fazla 10 milyon yıl önce 18,19 oldu bir salmonoid transposaz geni, site özel mutajenez ss. Özünde, belirli dizileri (ters tekrarlar / doğrudan tekrarlar: IR / DR) tarafından çevrili DNA transposonlar Sleeping Beauty transpozazın faaliyet vasıtasıyla &quot;kes ve yapıştır&quot; şekilde genomuna entegre edilebilir. transposaz, IR siteleri uçlarını tanır transpozonun excises ve bazlar, T ve A, transpozisyon (Şekil 1a) sırasında transpozonun her sonunda çoğaltılır bazlar arasında başka bir DNA siteye rastgele bütünleştirir. Uyku Güzellik transposaz üç alanda, bir transpozon bağlama alanı, bir nükleer lokalizasyon dizisi ve katalitik bir etki oluşturmaktadır. Dört transposaz moleküllerin bir araya transpozonun iki ucunu getirmek ve aktarılması için izin transpozazın çok molekülleri mevcut olan, ancak, bunlar dimerize ve önlenmesi için tetramerize gerekmektedirtranspozisyon reaksiyonu 20. Verimli bir transpozisyon reaksiyon transposonların için transpozazın optimal oranı gerektirir. Transposaz kodlayan DNA (cis olarak) transposon aynı plazmid veya (trans) farklı bir plazmid üzerinde temin edilebilir. Transpozaz ve transpozonlar arasında optimal oranı sağlamak için, yeterli bir etkinliğe sahip bir promotörü ((&quot;cis&quot; modeli için) transpozazın ifadesi ya da optimize edilebilir, enjeksiyon çözeltisi içinde plasmidlerin oranı seçilebilir &quot;Trans&quot; modeli). Sleeping Beauty Transpozon sistemi fonksiyonel genomik ekleme mütajenezi, transgenesis ve somatik gen terapisi 21 başarıyla kullanılabilir. Sentetik yapı, bir atıl salmonoid varyantı fonksiyonel molekül için yeniden tasarlanmış olan uyku güzellik transposaz, insanlarda ve diğer memelilerde 20 diğer transpozonlar bağlanmaz. Keşfedilmesinden bu yana, moleküler mühendislik donanımlrn vardıred IR dizileri ve TATA dinükleotidleri, transpozonun yan pT2 transposonların sonuçlanan eklenmesiyle değişiklikler yoluyla SB transpozonu sisteminin aktarılması etkinliği. Bu transposonlar IR sitesine SB bağlama optimize edilmiş ve eksizyon etkinliğini artırmıştır. SB transposaz da önemli bir gelişme göstermiştir; Burada sunulan Deneylerde kullanılan transposaz SB100X, memeli hücrelerinde 22 büyük çaplı bir genetik ekranından sonra bir DNA karıştırma stratejisi tarafından üretilen bir hiperaktif transposaz olup. Bu yazıda yenidoğan farelerin 23 alt-ventriküler bölgenin hücrelerine plazmid DNA viral olmayan, transpozon-aracılı entegrasyonu ile farelerde iç GBM ikna etmek için hızlı, çok yönlü ve tekrarlanabilir bir yöntem sunuyoruz. Biz Sleeping Beauty transposase kullanarak genomik entegrasyon için mükellef yeni genlerle transpozonlar oluşturmak ve plazmid alımını izlemek için nasıl göstermek için basit bir yol sunmak veışıldaması kullanarak hastalığın ilerlemesi. Biz de bu model ile yeniden GBM histolojik ve immunohistokimyasal özellikleri karakterize. Buna ek olarak, bu tümörler birincil GBM hücre hatları oluşturmak için hızlı bir yöntem sunulmaktadır. Tümörler hayvan orijinal hücrelerden kaynaklı olduğu Sleeping Beauty modeli, indüksiyon ve tümörlerin gelişiminde aday GBM genlerin rolü fonksiyonel değerlendirilmesini sağlar. Bu sistem, aynı zamanda, yerel mikro-değiştirebilir invaziv enflamatuar cerrahi prosedürlerin gerek olmaksızın, bağışıklık-kompetan farelerde bağışıklık terapisi de dahil olmak üzere, yeni GBM tedaviler, test edilmesi için uygundur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="952">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:199px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:267px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:367px;">Stoelting&#39;s Lab Standard with Rat and Mouse Adaptors</td>
			<td style="width:199px;">Stoelting</td>
			<td style="width:119px;">51670</td>
			<td style="width:267px;">Other companies produce similar frames, any of them with small mouse adaptors are suitable&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:367px;">Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)</td>
			<td style="width:199px;">Stoelting</td>
			<td style="width:119px;">53311</td>
			<td style="width:267px;">Injections can be made without it, ,but&#160;&#160;&#160; the automatic injector allows for increased reproducibility and convenience</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:367px;">10 &#956;L 700 series hand fitted MICROLITER syringe</td>
			<td style="width:199px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">Model 701</td>
			<td style="width:267px;">This syringe model will deliver from 0.5 to 500 ul of solution reliably. Other syrnges (fro example 5 ul, Model 75) may also be used</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:367px;">30 gauge gauge hypodermic needle 
			(1.25&#34;, 15o bevel)&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">S/O# 197462</td>
			<td style="width:267px;">This needle is ideal to pierce the skin and the skull of a neonatal mouse without the need of other invasive procedures. If it gets dull (doesn&#39;t easily enter the skin), it needs to be replaced.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">in vivo-jetPEI</td>
			<td style="width:199px;">Polyplus Transfection</td>
			<td style="width:119px;">201-10G</td>
			<td style="width:267px;">Aliquot in small volumes and keep at -20oC&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">D-Luciferin, Potassium Salt</td>
			<td style="width:199px;">Goldbio.com</td>
			<td style="width:119px;">LuckK-1g</td>
			<td style="width:267px;">Other sources of firefly lucifierase are just as adequate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Hematoxylin Solution, Harris Modified</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">HHS128-4L</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:367px;">Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td style="width:199px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">62550-01</td>
			<td style="width:267px;">for embedding brains for cryosectioning and immunohistovhemistry</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Advanced DMEM/F-12, no glutamine</td>
			<td style="width:199px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12634-010</td>
			<td style="width:267px;">for the culture of neurospheres</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">B-27&#168; Supplement (50X), serum free&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17504-044</td>
			<td style="width:267px;">serum free supplement for the culture of neurospheres</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">N2 Supplement (100x)</td>
			<td style="width:199px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17502-048</td>
			<td style="width:267px;">serum free supplement for the culture of neurospheres</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Normocyn</td>
			<td style="width:199px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:119px;">ant-nr-1</td>
			<td style="width:267px;">anti-mycoplasma agent for the culture of neurospheres</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Recombinant Human EGF</td>
			<td style="width:199px;">PEPROTECH</td>
			<td style="width:119px;">AF-100-15</td>
			<td style="width:267px;">growth factor supplement for the culture of&#160; neurospheres</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td style="width:199px;">PEPROTECH</td>
			<td>100-18B</td>
			<td style="width:267px;">growth factor supplement for the culture of&#160; neurospheres</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">HyClone HyQTase&#160; Cell Detachment Reagent&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SV3003001</td>
			<td style="width:267px;">for the dissociation of neurospheres</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td>K749510-0590</td>
			<td style="width:267px;">for the dissociation of freshly dissected tumors</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Falcon Cell Strainers mesh size 70um</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td style="width:267px;">for generating single cell suspensions of dissociated neurospheres</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Xylenes Histological grade</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C8H10</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Protocol Harris Hematoxylin Mercury free ( acidified)</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">245-678</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:367px;">Protocol Eosyn Y Solution ( intensified)</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">314-631</td>
			<td style="width:267px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transposon mediated integration of plasmid dna into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma

An urgent need exists to test the contribution of new genes to the pathogenesis and progression of human glioblastomas (GBM), the most common primary brain tumor in adults with dismal prognosis. New potential therapies are rapidly emerging from the bench and require systematic testing in experimental models which closely reproduce the salient features of the human disease. Herein we describe in detail a method to induce new models of GBM with transposon-mediated integration of plasmid DNA into cells of the subventricular zone of neonatal mice. We present a simple way to clone new transposons amenable for genomic integration using the Sleeping Beauty transposon system and illustrate how to monitor plasmid uptake and disease progression using bioluminescence, histology and immuno-histochemistry. We also describe a method to create new primary GBM cell lines. Ideally, this report will allow further dissemination of the Sleeping Beauty transposon system among brain tumor researchers, leading to an in depth understanding of GBM pathogenesis and progression and to the timely design and testing of effective therapies for patients.

SB-kaynaklı glioblastomlar histo-patolojik özellikleri karakterize etmek için, C57 / BL6 fareleri, neonatal plazmidler onkojenik DNA, örneğin, NRAS (Pt / CAGGS ile transpozonlar kodlayan ile kombinasyon halinde bir plazmid kodlayan lusiferaz (pT2 / SB100x-Luc) ile P1 enjekte edilmiştir -NRASV12) SV40 LGT (PT / CMVSV40-LGT) (Şekil 3c) veya PDGFβ ile kısa saç tokası p53 ve NRAS (Şekil 3d ile kombinasyon halinde bir GFP raportör (pT2shp53 / GFP4 / mPDGFβ) kodlayan bir plazmid). Hayvanlar enjeksiyon (Şekil 2a) gün sonra biyolüminesans için izlenir ve periyodik olarak ötenazi zaman can çekişen sahne ulaşana kadar vardı. Can çekişen sahne hayvan semptomatik gösteren engelli hareketlilik, kambur duruş, pasaklı kürk ve kilo kaybı olur klinik evre olarak tanımlanır. Bazen, hayvanlar çevreler ve ani atlama yürüme gibi, nöbet veya hareketin anormal kalıplarını geliştirmek. Deney hayvanı sonundas anestezi uygulandı. beyinler perfüze edilmiş, parafin içine gömülmüş ve hematoksilin ve eozin boyama için işlemden geçirilirler. Beyin parankimi içine kanamalar (Şekil 3c), sözde pallisading nekroz (Şekil 3e) ve perivasküler ve yaygın işgali ile insan GBM (WHO Evre IV) işaretlerinden görüntülendiği Veri gösterisi tümörleri (Şekil 3g, f). pseudopallisades oluşumu, tek çekirdekli hücreler yoğun infiltrasyonu (Şekil 3H) olan kanama bölgelerde neden sızan endotelinin (Şekil 3i) büyük glomerüloid damarlarının yırtılarak önce gelmelidir. Atipik mitoz (Şekil 3j) ve devasa çok çekirdekli tümör hücreleri (Şekil 3b) aynı zamanda insan GBM patognomoniktir vardır. Plazmidler enjekte edilirse, glioblastomlar, biyolüminesans ile tümör büyümesinin ilerlemesinin boyunca izlenebilir uyku güzellik transposaz sistemi kullanılarak oluşturulankodlamak lusiferaz. Bir örnek deney Şekil 4a&#39;da gösterilmektedir. Parlaklık / s / cm2 / sr 10 7 -10 9 fotonların bir yoğunluk ulaştığında hayvanlar genellikle tümör yükünün dayanamaz. Şekil 4b sunulan yaşam eğrileri gösterildiği gibi hayvanların medyan sağkalım, yenidoğan beynine enjekte onkojenik transposonların kombinasyonları tahmin edilebileceği bağlıdır. Shp53 NRA&#39;lar ve PDGF ile indüklenen GBM hayvanların ortalama hayatta kalma 62.5 gün shp53 ve NRA&#39;lar 83 gün enjekte edilen hayvanların ise, en agresif tümörleri NRA&#39;lar SV40 LGT antijen (30 günlük ortalama hayatta kalma) ile uyarılmaktadır unutmayın. De novo oluşan tümörler glial tümör karakteristik moleküllerinin kendi ifadesi ile immüno-histokimyasal olarak karakterize edilebilir. 5 olgunlaşmamış bir tümör (22 dpi, biyolüminesans 2x10 5 foton / s / cm2 / sr) göstermektedir, shp53 ile indüklenenve NRAS. enjekte shp53 plazmid transfekte edilmiş hücrelerin belirlenmesi ve bunların soyu (pT2 / shp53 / GFP) izin vermek için, yeşil floresan proteini (GFP) kodlayan. GFP + tümör hücreleri, nöral kök hücre belirteci Nestin ve glial fibriler asidik protein ifade bir GFP + hücreleri (GFAP) ifade etmektedir. 6. 56 dpi da shp53 / GFP ve NRA&#39;lar ile indüklenmiştir tümör, bir can çekişme bir hayvandan alınan bir tümör göstermektedir Şekil. Sayısız GFAP + astrositler tümörü çevreleyen. GFP + tümör hücreleri GFAP Nestin ifade değil. GBMS uyarılması için bu tekniği kullanarak bir büyük avantajı, enjekte transposon vasıtasıyla tek bir genetik değişiklikler ile yeni GBM hücre hatları oluşturmak için yeteneğidir. Buna ek olarak, özel hücre çizgileri, belirli genetik yapısı ile transjenik hayvanlar kullanılarak oluşturulabilir. Bu hücre hatları biyokimyasal testler kullanılarak birçok mekanik sorular sorarak etkili oluyor. Onlar ideal roman ch ile sitotoksisite çalışmaları için uygunduremotherapeutic ajanlar. Şekil 7 enjekte plazmidler birinde kodlanan GFP, ifadesini gösteren shp53, PDGF ve NRA&#39;lar ile uyarılan bir Sleeping Beauty tümörden bir neurosphere göstermektedir. Bu primer GBM hücrelerinin heterojen doğasını gösteren bu ifade tüm hücrelerde eşit yoğun değildir unutmayın. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52443/52443fig1highres.jpg" /> Şekil 1: (a) konak kromozomal DNA&#39;ya transpozonlar entegre Sleeping Beauty transpozazın tarafından kullanılan bir donör transpozonu plazmid ters tekrarlar / doğrudan tekrarlar tarafından çevrili ilgi gen ile tasvir edilmiştir &quot;kes ve yapıştır&quot; mekanizmasını gösteren şematik gösterimi. (IR / DR; kırmızı ok kutuları) dizileri. SB transposaz (yeşil) transpozon excises IR / DR bağlanan ve konak kromozomal DNA&#39;nın rasgele ta dinükleotid baz çifti arasına içinde reintegrates. Klonlama (b) ÖrnekSB vektörü (PKT-IRES-Katushka) omurgası, söz konusu bir gen (mPDGFβ). SB vektör, iki IR / DR tekrar dizileri (kırmızı) ve yükseltici ve zenginleştirici sekanslar, çoklu bir klonlama sitesi (MCS, mavi) içeren bir gen ifade kasetini içeren, iç ribozom giriş sitesi (IRES), bir flüoresan raportör işaretçisini (Katushka: sarı), ve bir polyadenilation sitesi (poli). Çevrede onkojen (mPDGFβ portakal), bir klonlama vektörü pGEMT yer almaktadır. belirli bir kısıtlama sitelerinin (Ncol / SacI) tarafından kapatılması ile onkogen, köreltme enzim ile enzimatik sindirme ile serbest bırakıldı ve duraklamaktadır. Vektör doğrusallaştırılmıştır ve de körelmiş edilir. Son olarak, mPDGFβ onkogen yeni plazmid transpozonu vektörü oluşturmak için bir künt uç ligasyonu reaksiyonu vasıtasıyla verici vektörü içine sokulur:. PKT-mPDGFβ-IRES-Katushka <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52443/52443fig1large.jpg" target="_blank">daha büyük bir versiyonu o görmek için buraya tıklayınız</a>Bu rakam f. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52443/52443fig2highres.jpg" /> Şekil 2: Yenidoğan farelerde içi ventriküler enjeksiyonlar için deneysel Kurulum ve kılavuzları (a) mikrometre aramalar ile stereotaksik çerçeve (2) otomatik enjektör 10 ul şırınga (4) tutan ile donatılmıştır. U çerçevesi içinde, bir yenidoğan adaptör çerçevesi sabitlendi¤inden (3). otomatik enjektör (1) kontrol paneli şırınga, hacim ve akış hızı tam olarak seçilmesine izin verir, (b) yan ventrikül içine enjeksiyonlar için gerekli koordinatlara sokulan bir iğne ile neonatal fare (P1) bir fotoğrafı:. 1.5 mm ve ventral lambda 0,8 mm yanal. göreceli boyutları ve karıncıklar konumunu vurgulayarak yenidoğan fare (P1) beyin ile koronal bölümünün (c) İllüstrasyon. Şekil 3: uyku güzellik transpozon sistemi ile indüklenen tümörler NRA&#39;ların SV40 LGT kodlayan plazmidlerle intraventriküler enjeksiyon sonrası yeni doğan yavru 24 st insan GBM: (a) Biyolojik olarak görüntü histolojik ayırt edici gösteren bir yetişkin hayvana (b) Bio-ışıldama görüntü (. 50 shp53 NRA&#39;lar ve PDGF ile uyarılan büyük tümörü olan dpi). (c) Hematoksilen ve NRA&#39;lar ve LGT (28 dpi) ile uyarılan bir tümör ile can çekişen fare beyninden bir koronal bölümünün eozin leke. (d) Koronal bölüm Bir tümör, bir can çekişme fare beyninden shp53 NRA&#39;lar ve PDGF. (e) Pseudopalisading nekroz de novo oluşturulan tümörlerde gözlenen insan GBM histolojik ayırt edici niteliği ile neden olur. (Nekroz (N) orta alandan uzak göç palisades düzenlenmiş hücrelere puan Ok (f) vede novo g) oluşturulan tümörler normal beyin parankimi içine kan damarları (g) ve diffüz (f) boyunca işgali gösteren, son derece invaziv. (H) mononükleer hücrelerin (ok), pseudopalisading nekroz alan ilk aşamasının büyük işgali ile kanama Region., (I) sızan endotel (ok) ile büyük glomerüloid damar NRA&#39;lar ile indüklenen bir tümör içinde difüzyon kanama kökeni SV40 -LgT. (j) tümör hücreleri Atipik mitoz (ok başı). (k) birden çok büyük çekirdek (ok başı) ile dev tümör hücresi. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52443/52443fig4highres.jpg" /> Şekil 4: Tümör taşıyan hayvanlara hastalık ilerlemesi süresince biyolüminesans ile izlenebilir. Hayvanların medyan sağkalım kombinasyonu ile tahmin edilmektedirOnkojenik DNA enjekte. 7 C57 / BL6 farelerinin bir kohorttan bioluminescent izlerinin (a) Örnek. Biyolüminesans 10 8 fotonları ulaştıktan sonra fareler bir hafta yenik unutmayın / s / cm2 / sr. (B) farklı plazmid kombinasyonları ile oluşturulan Güzellik tümörleri Sleeping hayvanların ortalama sağkalım karşılaştıran örnek sağkalım eğrileri. NRA&#39;lar ve SV40 LGT ile uyarılan tümörlerin ortalama sağkalım ise shp53 NRA&#39;lar ve PDGF ya shp53 ve NRA&#39;lar ile uyarılan tümörlerde hayvanların 30 dpi sırasıyla 62.5 dpi veya 83 dpi. dpi: gün enjeksiyon sonrası. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52443/52443fig5highres.jpg" /> Şekil 5: Doğan makroskopik GBM (22 dpi) shp53 ve NRA&#39;lar ile uyandırdığı GFP + tümör hücreleri (odaklı mikrograflar) &#39;de Nestin ve GFAP ifadesini göstermektedir Panel (a), GFP ifade olgunlaşmamış bir tümör gösterir.. Panel (b) Nestin ifade gösteren aynı alanını temsil eder. Panel <strOng&gt; (c) bir bindirme (a) ve Nestin ve GFP ko-lokalizasyonunu gösteren, (b). (D) tümör hücrelerinde GFP tanımı. Bazı tümör hücrelerinde ve gelişmekte olan tümör çevresindeki hücreler (e) GFAP ifadesi. (F) (d) Kaplama çıkıntı ve (e) bir tümör hücreleri (beyaz) birlikte ifade GFAP gösteren ve GFP. (A) ve (d) &#39;de Ölçek çubukları 75 um temsil eder. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52443/52443fig6highres.jpg" /> Şekil 6: GBM GFP ve tümör çevresindeki olgun glial işaretleyici GFAP tümör hücrelerinde Nestin ifade ve çok sayıda leke görüldüğü can çekişme hayvan (56 dpi) shp53, NRA&#39;lar ve PDGF ile uyarılan panel (a) &#39;acoronal bölümün Nissl leke temsil eder. Bir tümör ile can çekişen hayvanın beynine yoluyla (yoğun mavi boyama fshp53, PDGFΒ ve NRA&#39;ların kullanarak Sleeping Beauty transpozon sistemi ile uyarılan rom artan hücreselliği). Panel (b) &#39;de gösterilen panelin bir Koronal bitişik bölüm (a), tümör hücrelerinde GFP ekspresyonu gösteren, bir nükleer boya DAPI ile boyanmıştır. Paneli (c) DAPI yüksek nükleer yoğunluk tarafından belirlenen tümör GFP ifade gösteren tümör sınırın bir konfokal mikroskobu, temsil eder. Panel (d) tümör bitişik hücrelerde yoğun bir GFAP ifadesini gösteren, (a) &#39;daki gibi aynı görüş alanını gösterir. Panel (e) panel kalıbı (c) ve (d) temsil eder. Panel (f) tümör hücrelerinde GFP ifade göstererek, tümör sınırın bir konfokal mikrografıdır. Panel (g) Tümör hücrelerinde Nestin ekspresyonunu gösteren, (f) &#39;de olduğu gibi aynı görüş alanını temsil eder. Panel (h) katlamalı panellerin çıkıntı (f) ve (g) &#39;dir <strOng&gt;. (c) &#39;deki ölçek çizgisi 150 um temsil eder ve (f)&#39; de 75 um temsil eder. <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/52443/52443fig7highres.jpg" /> Şekil 7:. Neurospheres kültür içinde 5 gün sonra shp53, PDGF ve NRA&#39;lar ile indüklenen bir uyku güzellik tümörden, geçit 2 hücreleri shp53 PDGF plazmid (pT2shp53 / GFP4 / mPDGF β) kodlanmış GFP eksprese eden panel (a) Bir neurosphere bir aydınlık mikrografıdır. Panel (b) (a) &#39;neurosphere hücrelerinde GFP ekspresyonu gösteren aynı bakış epi-floresan mikroskobu temsil eder. Panel (c) panel tabakasını temsil eder, (a) ve (b).

Watch this Scientific Journal Video about Transposon Mediated Integration of Plasmid DNA into the Subventricular Zone of Neonatal Mice to Generate Novel Models of Glioblastoma at JoVE.com

Transposon Mediated Integration of Plasmid DNA into the Subventricular Zone of Neonatal Mice to Generate Novel Models of Glioblastoma

Here we describe an efficient and versatile protocol to induce, monitor and analyze novel glioblastomas (GBM) using transposon DNA injected into the ventricles of neonatal mice. Cells of the subventricular zone, which take up the plasmid, transform, proliferate and generate tumors with histo-pathological characteristics of human GBM.

Yenidoğan Fareler subventricular Bölgesi içine Plazmid DNA Transpozon Aracılı Entegrasyon Glioblastoma&#39;nın Roman modelleri oluşturmak için

An urgent need exists to test the contribution of new genes to the pathogenesis and progression of human glioblastomas (GBM), the most common primary ...

transposon-mediated-integration-plasmid-dna-into-subventricular-zone

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

12.8K Görüntüleme.  University of Michigan School of Medicine. Here we describe an efficient and versatile protocol to induce, monitor and analyze novel glioblastomas (GBM) using transposon DNA injected into the ventricles of neonatal mice. Cells of the subventricular zone, which take up the plasmid, transform, proliferate and generate tumors with histo-pathological characteristics of human GBM.

Video: Transposon Mediated Integration of Plasmid DNA into the Subventricular Zone of Neonatal Mice to Generate Novel Models of Glioblastoma

Biochemical Measurement of Neonatal Hypoxia

Neonatal hypoxia ischemia is characterized by inadequate blood perfusion of a tissue or a systemic lack of oxygen. This condition is thought to cause/exacerbate well documented neonatal disorders including neurological impairment 1-3. Decreased adenosine triphosphate production occurs due to a lack of oxidative phosphorylation. To compensate for this energy deprived state molecules containing high energy phosphate bonds are degraded 2. This leads to increased levels of adenosine which is subsequently degraded to inosine, hypoxanthine, xanthine, and finally to uric acid. The final two steps in this degradation process are performed by xanthine oxidoreductase. This enzyme exists in the form of xanthine dehydrogenase under normoxic conditions but is converted to xanthine oxidase (XO) under hypoxia-reperfusion circumstances 4, 5. Unlike xanthine dehydrogenase, XO generates hydrogen peroxide as a byproduct of purine degradation 4, 6. This hydrogen peroxide in combination with other reactive oxygen species (ROS) produced during hypoxia, oxidizes uric acid to form allantoin and reacts with lipid membranes to generate malondialdehyde (MDA) 7-9. Most mammals, humans exempted, possess the enzyme uricase, which converts uric acid to allantoin. In humans, however, allantoin can only be formed by ROS-mediated oxidation of uric acid. Because of this, allantoin is considered to be a marker of oxidative stress in humans, but not in the mammals that have uricase.
We describe methods employing high pressure liquid chromatography (HPLC) and gas chromatography mass spectrometry (GCMS) to measure biochemical markers of neonatal hypoxia ischemia. Human blood is used for most tests. Animal blood may also be used while recognizing the potential for uricase-generated allantoin. Purine metabolites were linked to hypoxia as early as 1963 and the reliability of hypoxanthine, xanthine, and uric acid as biochemical indicators of neonatal hypoxia was validated by several investigators 10-13. The HPLC method used for the quantification of purine compounds is fast, reliable, and reproducible. The GC/MS method used for the quantification of allantoin, a relatively new marker of oxidative stress, was adapted from Gruber et al 7. This method avoids certain artifacts and requires low volumes of sample. Methods used for synthesis of MMDA were described elsewhere 14, 15. GC/MS based quantification of MDA was adapted from Paroni et al. and Cighetti et al. 16, 17. Xanthine oxidase activity was measured by HPLC by quantifying the conversion of pterin to isoxanthopterin 18. This approach proved to be sufficiently sensitive and reproducible.

A method is described to measure biochemical markers of neonatal hypoxia-ischemia. The approach utilizes high pressure liquid chromatography (HPLC) and Gas Chromatography Mass Spectrometry (GC/MS).

Yenidoğan Hipoksi Biyokimyasal Ölçüm

Neonatal hypoxia ischemia is characterized by inadequate blood perfusion of a tissue or a systemic lack of oxygen. This condition is thought to ...

Tıp

Use of Animal Model of Sepsis to Evaluate Novel Herbal Therapies

Sepsis refers to a systemic inflammatory response syndrome resulting from a microbial infection. It has been routinely simulated in animals by several techniques, including infusion of exogenous bacterial toxin (endotoxemia) or bacteria (bacteremia), as well as surgical perforation of the cecum by cecal ligation and puncture (CLP)1-3. CLP allows bacteria spillage and fecal contamination of the peritoneal cavity, mimicking the human clinical disease of perforated appendicitis or diverticulitis. The severity of sepsis, as reflected by the eventual mortality rates, can be controlled surgically by varying the size of the needle used for cecal puncture2. In animals, CLP induces similar, biphasic hemodynamic cardiovascular, metabolic, and immunological responses as observed during the clinical course of human sepsis3. Thus, the CLP model is considered as one of the most clinically relevant models for experimental sepsis1-3.
Various animal models have been used to elucidate the intricate mechanisms underlying the pathogenesis of experimental sepsis. The lethal consequence of sepsis is attributable partly to an excessive accumulation of early cytokines (such as TNF, IL-1 and IFN-&gamma;)4-6 and late proinflammatory mediators (e.g., HMGB1)7. Compared with early proinflammatory cytokines, late-acting mediators have a wider therapeutic window for clinical applications. For instance, delayed administration of HMGB1-neutralizing antibodies beginning 24 hours after CLP, still rescued mice from lethality8,9, establishing HMGB1 as a late mediator of lethal sepsis. The discovery of HMGB1 as a late-acting mediator has initiated a new field of investigation for the development of sepsis therapies using Traditional Chinese Herbal Medicine. In this paper, we describe a procedure of CLP-induced sepsis, and its usage in screening herbal medicine for HMGB1-targeting therapies.

Sepsis refers to a systemic inflammatory response syndrome resulting from a microbial infection, and can be simulated by a surgical technique termed cecal ligation and puncture (CLP). Here we describe a method to use CLP-induced animal model to screen medicinal herbs for therapeutic agents.

Roman Bitkisel Tedaviler Değerlendirmek için Sepsis Hayvan Modeli kullanımı

Sepsis refers to a systemic inflammatory response syndrome resulting from a microbial infection. It has been routinely simulated in animals by several ...

The Measurement and Treatment of Suppression in Amblyopia

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current estimates put the prevalence of amblyopia at approximately 1-3%1-3, the majority of cases being monocular2. Amblyopia is most frequently caused by ocular misalignment (strabismus), blur induced by unequal refractive error (anisometropia), and in some cases by form deprivation.
Although amblyopia is initially caused by abnormal visual input in infancy, once established, the visual deficit often remains when normal visual input has been restored using surgery and/or refractive correction. This is because amblyopia is the result of abnormal visual cortex development rather than a problem with the amblyopic eye itself4,5 . Amblyopia is characterized by both monocular and binocular deficits6,7 which include impaired visual acuity and poor or absent stereopsis respectively. The visual dysfunction in amblyopia is often associated with a strong suppression of the inputs from the amblyopic eye under binocular viewing conditions8. Recent work has indicated that suppression may play a central role in both the monocular and binocular deficits associated with amblyopia9,10 .
Current clinical tests for suppression tend to verify the presence or absence of suppression rather than giving a quantitative measurement of the degree of suppression. Here we describe a technique for measuring amblyopic suppression with a compact, portable device11,12 . The device consists of a laptop computer connected to a pair of virtual reality goggles. The novelty of the technique lies in the way we present visual stimuli to measure suppression. Stimuli are shown to the amblyopic eye at high contrast while the contrast of the stimuli shown to the non-amblyopic eye are varied. Patients perform a simple signal/noise task that allows for a precise measurement of the strength of excitatory binocular interactions. The contrast offset at which neither eye has a performance advantage is a measure of the "balance point" and is a direct measure of suppression. This technique has been validated psychophysically both in control13,14 and patient6,9,11 populations.
In addition to measuring suppression this technique also forms the basis of a novel form of treatment to decrease suppression over time and improve binocular and often monocular function in adult patients with amblyopia12,15,16 . This new treatment approach can be deployed either on the goggle system described above or on a specially modified iPod touch device15.

Amblyopia is a developmental disorder of the visual cortex that is often accompanied by strong suppression of one eye. We present a new technique for measuring and treating interocular suppression in patients with amblyopia that can be deployed using virtual reality goggles or a portable iPod Touch device.

Ambliyopi içinde Bastırma Ölçme ve Tedavisi

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome compared to matched normal tissue. Based on these analyses it is evident that there are many undiscovered genetic drivers of cancer1. Unfortunately these drivers are hidden within a much larger number of passenger anomalies in the genome that do not directly contribute to tumor formation. Another aspect of the cancer genome is that there is considerable genetic heterogeneity within similar tumor types. Each tumor can harbor different mutations that provide a selective advantage for tumor formation2. Performing an unbiased forward genetic screen in mice provides the tools to generate tumors and analyze their genetic composition, while reducing the background of passenger mutations. The Sleeping Beauty (SB) transposon system is one such method3. The SB system utilizes mobile vectors (transposons) that can be inserted throughout the genome by the transposase enzyme. Mutations are limited to a specific cell type through the use of a conditional transposase allele that is activated by Cre Recombinase. Many mouse lines exist that express Cre Recombinase in specific tissues. By crossing one of these lines to the conditional transposase allele (e.g. Lox-stop-Lox-SB11), the SB system is activated only in cells that express Cre Recombinase. The Cre Recombinase will excise a stop cassette that blocks expression of the transposase allele, thereby activating transposon mutagenesis within the designated cell type. An SB screen is initiated by breeding three strains of transgenic mice so that the experimental mice carry a conditional transposase allele, a concatamer of transposons, and a tissue-specific Cre Recombinase allele. These mice are allowed to age until tumors form and they become moribund. The mice are then necropsied and genomic DNA is isolated from the tumors. Next, the genomic DNA is subjected to linker-mediated-PCR (LM-PCR) that results in amplification of genomic loci containing an SB transposon. LM-PCR performed on a single tumor will result in hundreds of distinct amplicons representing the hundreds of genomic loci containing transposon insertions in a single tumor4. The transposon insertions in all tumors are analyzed and common insertion sites (CISs) are identified using an appropriate statistical method5. Genes within the CIS are highly likely to be oncogenes or tumor suppressor genes, and are considered candidate cancer genes. The advantages of using the SB system to identify candidate cancer genes are: 1) the transposon can easily be located in the genome because its sequence is known, 2) transposition can be directed to almost any cell type and 3) the transposon is capable of introducing both gain- and loss-of-function mutations6. The following protocol describes how to devise and execute a forward genetic screen using the SB transposon system to identify candidate cancer genes (Figure 1).

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

A method of identifying unknown drivers of carcinogenesis using an unbiased approach is described. The method uses the Sleeping Beauty transposon as a random mutagen directed to specific tissues. Genomic mapping of transposon insertions that drive tumor formation identifies novel oncogenes and tumor suppressor genes

Tanımlanması<em&gt; Sleeping Beauty</emLinker-aracılı PCR kullanarak Solid Tümörlerde&gt; Transposon Eklemeler

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Image-guided Convection-enhanced Delivery into Agarose Gel Models of the Brain

Convection-enhanced delivery (CED) has been proposed as a treatment option for a wide range of neurological diseases. Neuroinfusion catheter CED allows for positive pressure bulk flow to deliver greater quantities of therapeutics to an intracranial target than traditional drug delivery methods. The clinical utility of real time MRI guided CED (rCED) lies in the ability to accurately target, monitor therapy, and identify complications. With training, rCED is efficient and complications may be minimized. The agarose gel model of the brain provides an accessible tool for CED testing, research, and training. Simulated brain rCED allows practice of the mock surgery while also providing visual feedback of the infusion. Analysis of infusion allows for calculation of the distribution fraction (Vd/Vi) allowing the trainee to verify the similarity of the model as compared to human brain tissue. This article describes our agarose gel brain phantom and outlines important metrics during a CED infusion and analysis protocols while addressing common pitfalls faced during CED infusion for the treatment of neurological disease.

Convection-enhanced delivery (CED) has been proposed as a treatment option for a wide range of neurological diseases. In order to prepare health care professionals for adoption of CED, accessible training models are needed. We describe the use of agarose gel as such a model of the human brain for testing, research, and training.

Beyin Agaroz Jel Modelleri içine görüntü eşliğinde Konveksiyon geliştirilmiş Teslim

Convection-enhanced delivery (CED) has been proposed as a treatment option for a wide range of neurological diseases. Neuroinfusion catheter CED allows ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Farelerin Meme Fat Pad içine Meme Kanseri Hücreleri Ortotopik Enjeksiyon Tümör Büyüme Eğitim için.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely replicates both the technical and pathological processes that occur in human renal transplantation. Although mouse models of allogeneic rejection in organs other than the kidney exist, and are more technically feasible, there is evidence that different organs elicit disparate rejection modes and dynamics, for instance the time course of rejection in cardiac and renal allograft differs significantly in certain strain combinations. This model is an attractive tool for many reasons despite its technical challenges. As inbred mouse strain haplotypes are well characterized it is possible to choose donor and recipient combinations to model acute allograft rejection by transplanting across MHC class I and II loci. Conversely by transplanting between strains with similar haplotypes a chronic process can be elicited were the allograft kidney develops interstitial fibrosis and tubular atrophy. We have modified the surgical technique to reduce operating time and improve ease of surgery, however a learning curve still needs to be overcome in order to faithfully replicate the model. This study will provide key points in the surgical procedure and aid the process of establishing this technique.

Here, we present a protocol to study the immunology of rejection. The surgical model presented reports a short operating time and a concise technique. Depending on the donor-recipient strain combination, the transplanted kidney may develop acute cellular rejection or chronic allograft damage, defined by interstitial fibrosis and tubular atrophy.

Fare Böbrek Transplantasyonu: Allogreft Reddi Modelleri

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

A Piglet Model of Neonatal Hypoxic-Ischemic Encephalopathy

Birth asphyxia, which causes hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), accounts for 0.66 million deaths worldwide each year, about a quarter of the world&#8217;s 2.9 million neonatal deaths. Animal models of HIE have contributed to the understanding of the pathophysiology in HIE, and have highlighted the dynamic process that occur in brain injury due to perinatal asphyxia. Thus, animal studies have suggested a time-window for post-insult treatment strategies. Hypothermia has been tested as a treatment for HIE in pdiglet models and subsequently proven effective in clinical trials. Variations of the model have been applied in the study of adjunctive neuroprotective methods and piglet studies of xenon and melatonin have led to clinical phase I and II trials1,2. The piglet HIE model is further used for neonatal resuscitation- and hemodynamic studies as well as in investigations of cerebral hypoxia on a cellular level. However, it is a technically challenging model and variations in the protocol may result in either too mild or too severe brain injury. In this article, we demonstrate the technical procedures necessary for establishing a stable piglet model of neonatal HIE. First, the newborn piglet (&#60; 24 hr old, median weight 1500 g) is anesthetized, intubated, and monitored in a setup comparable to that found in a neonatal intensive care unit. Global hypoxia-ischemia is induced by lowering the inspiratory oxygen fraction to achieve global hypoxia, ischemia through hypotension and a flat trace amplitude integrated EEG (aEEG) indicative of cerebral hypoxia. Survival is promoted by adjusting oxygenation according to the aEEG response and blood pressure. Brain injury is quantified by histopathology and magnetic resonance imaging after 72 hr.

Hypoxic-ischemic encephalopathy following perinatal asphyxia can be studied using animal models. We demonstrate the procedures necessary for establishing a piglet model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy.

Yenidoğan Hipoksik-İskemik Ensefalopati A Piglet Modeli

Birth asphyxia, which causes hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), accounts for 0.66 million deaths worldwide each year, about a quarter of the ...

Surgical Models of Gastroesophageal Reflux with Mice

Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to induce reflux of gastric contents, duodenal contents or mixed contents. Surgical procedures and general principles have been described in detail. A researcher with surgical experience should be able to grasp the technique after a short period of practice. After surgery, most mice can survive and develop reflux esophagitis similar to that in humans. However, it should be noted that histological differences between mouse and human esophagus are the inherent limitations of these surgical models. If used for research on Barrett&#8217;s esophagus and adenocarcinoma, these procedures may need to be combined with genetic modifications.

This article demonstrates surgical procedures of gastroesophageal reflux with mice. These models are useful tools for research on mechanisms and treatment of gastroesophageal reflux disease and potentially Barrett&#8217;s esophagus and esophageal adenocarcinoma.

Fare ile Gastroözofageal Reflü Cerrahi Modelleri

Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to ...

Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and regeneration, and to define new targets for therapeutics. For decades, models of complete heart regeneration existed in amphibians and fish, but a mammalian counterpart was not available. The recent discovery of a postnatal window during which mice possess regenerative capabilities has led to the establishment of a mammalian model of cardiac regeneration. A surgical model of mammalian cardiac regeneration in the neonatal mouse is presented herein. Briefly, postnatal day 1 (P1) mice are anesthetized by isoflurane and placed on an ice pad to induce hypothermia. After the chest is opened, and the left anterior descending coronary artery (LAD) is visualized, a suture is placed around the LAD to inflict myocardial ischemia in the left ventricle. The surgical procedure takes 10-15 min. Visualizing the coronary artery is crucial for accurate suture placement and reproducibility. Myocardial infarction and cardiac dysfunction are confirmed by triphenyl-tetrazolium chloride (TTC) staining and echocardiography, respectively. Complete regeneration 21 days post myocardial infarction is verified by histology. This protocol can be used to as a tool to elucidate mechanisms of mammalian cardiac regeneration after myocardial infarction.

This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.

Yenidoğan Farelerde Miyokard Enfarktüsü, Kalp Rejenerasyon Bir Model

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and ...