Bu çalışma hibe R01-CA169354 tarafından desteklenen &#160; ve R01-047822 &#160; Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Gazi İşleri Bakanlığı (ECB) bir Liyakat Ödülü. RKP NIH T32 CA009287-30A1, bir ASCO Genç Araştırmacı Ödülü, Kaliforniya Meme Kanseri Araştırma Projesi Bursu ve bir Amerikan Kanser Derneği Mentored Araştırmacı Grant tarafından desteklenmiştir; BAZ NIH hibe AI079320 tarafından desteklenmiştir. JM NIH T-32 eğitim bursu T32-AI07290- 25, T32-AI07290-24 ve Amerikan Kanser Derneği doktora sonrası burs PF-12-052-01-CSM burs tarafından desteklenmiştir.

NOT: Tüm hayvan deneyleri onaylı Stanford, Palo Alto, VA HCS ve Sağlık Kurumsal AnimalCare ve Kullanım Komitesi kurallar National Institutes göre yapılmıştır. 1. Örnek Toplama ve İşleme Hazırlanma (Zaman Gerekli: ~ 10-15 dk) <ol><li> Daha önce tarif edildiği gibi 6 faregiller B16F0 melanoma hücrelerinin deri altından ya da dişi C57BL / 6 farelerinde karın orta hattı yakınında (0.5-1 x 10 6) inoküle. Seçenek olarak ise, (örneğin, yan, meme yağ pedi, vs) ilave anatomik bölgelerde tümör hücrelerini aşılamak. NOT: tümörlerin Herhangi bir sayıda (implante veya spontan) Bu protokolü kullanarak kullanılan ve değerlendirilebilir. Örneğin, diğer yaygın / 6 kolon hattı MC38, Lewis Akciğer Karsinomu (LLC), ve prostat TRAMP-C2 hattı dahil C57BL singenik tümörleri kullanılır. Bağışıklık yetersizliği olan farelere aşılandı insan ksenogrefleri da bu şekilde değerlendirilebilir iken, s unutulmamalıdırTümör infiltre lökositlerin rofiles mutlaka ev sahibi fare bağışıklık eksikliği durumuna göre değişmiş olacaktır. <ol><li> Tam bir ortam (örneğin, RPMI,% 10 FBS ve katkı maddeleri ihtiva eden) ya da diğer uygun bir protein içeren bir tampon (örneğin, HBSS ve PBS +% 1 FBS ve% 1 BCS) kullanın. Ortam soğuk ya da önceden euthanization 4 ° C&#39;ye kadar tampon. </li></ol></li><li> Rezeksiyon tümörler için toplama tüpleri ve filtreler ayarlayın; Buz üzerinde, bu yerleştirin. <ol><li> Tümör başına bir 50 ml konik tüp kullanın rezeke edilecek. Her birinde bir 40-70 mikron hücre süspansiyonu filtre takın. Alternatif olarak, metal filtre örgü ile 15 ml konik tüpler kullanın. 15 ml tüp en az bir kupa şekilli filtre oluşturmak için 5 ml&#39;lik bir şırınga pistonu veya kalın kalem kullanın. </li></ol></li><li> Rezeksiyon ve tümör işleme aletleri hazırlayın; Cerrahi forseps ve rezeke ince makas ve süreç tümörleri kullanın. Rezeksiyon / tümör örneklerinin arasında aletleri temizlemek için% 70 etanol kullanın. Daha fazla sayıda o içinf örnekleri (örneğin&gt; 10), biz tümör örnekleri arasındaki işlem süresi önemli farklılıklar önlemek için birden araştırmacılar tarafından örneklerin aynı anda işleme öneririz. </li></ol> 2. Tümör Rezeksiyon (Gerekli Zaman: ~ 5 dk / tümör) <ol><li> Ayrı ayrı karbon dioksit ya da başka uygun yöntem kullanılarak, B16 tümör taşıyan fareler öldürülür. </li><li> Bir cerrahi sahnede fareyi sabitleyin. % 70 etanol ile tümör alanı Sprey ve aşırı kapalı silin; Bu herhangi bir saç mevcut yayılmasını önlemeye yardımcı olur. Gerektiği gibi olmayan çıplak fareler için, rezeksiyon öncesi tümör çevresindeki deri alanını tıraş. </li><li> Forseps ve makas kullanarak, üstünde uzanan dahil ve cilt çevreleyen, en blok deri altı tümör rezeksiyonu. alınan &quot;margin&quot; deri miktarı değişiyordu, ama genellikle tümörün çevresindeki derinin 2-3 mm rezeke edilebilir. <ol><li> Bu noktada rezeke tümörleri (+/- çevreleyen deri) tartılır. Pl içinde güvenli filtre rezeke cilt / tümör bölümünü yerleştirinastic konik boru. </li></ol></li></ol> 3. Tek Hücreli Tümör Süspansiyon Hazırlamak (Gerekli Zaman: ~ 5-7 dak / tümör) <ol><li> Kullanım forseps ve makas tümör ve örten / çevreleyen deriyi kıymaya. Doku tüm büyük bölümleri 1-2 mm&#39;lik bölüme işlenir kadar makas kullanarak örnek kıyma. NOT: Genellikle, bütün tümörler işlenir; Seçenek olarak ise, daha büyük tümörler için tümör temsili bölümleri kıyılmış ve işlenebilir. </li><li> Bir tek 5 veya 10 ml şırınga bir dalgıç kullanarak, mekanik güvenli filtre karşı kıyılmış tümör dokusu parçalara ayırma. </li><li> Bir pipet kullanarak, soğuk ortam veya tampon 5-10 ml ile işlenmiş tümör dokusu yıkayın. Bu filtre sayesinde tek hücre floş olacaktır. </li><li> Toplam sayısı ve yıkama hacimleri yaklaşık benzer büyüklükteki tümörlerde aynı olmasını sağlayarak, yukarıdaki iki adımları birkaç kez tekrarlayın. <ol><li> Işlenmiş tümör dokusu yıkadıktan sonra, gözlemlemekderi ve / veya bunlarla ilgili başka dokuların küçük fragmanları filtrede kalan edilmelidir. </li><li> Seçenek olarak ise, kolajenaz ve / veya diğer enzimler ile sadece mekanik parçalanma yeterli olmayabilir tümörler, sindirim için önceden kıyma edilen prosedüre göre gerçekleştirilebilir. Bu, daha ayrıntılı bir tek hücre süspansiyonu için izin verir. Bununla birlikte, bu sindirim protokolleri yüzey antijeni ifade 20 etkiler, böylece dikkatli bu sonuçlara alınması gerektiği not edilmelidir. </li></ol></li><li> Yıkama ve tampon / ortam ilave edildikten ve 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 500 x g&#39;de santrifüj ile pelet hücreleri. </li></ol> Tek Hücre Süspansiyon 4. FACS Boyama (Gerekli Zaman: ~ 30-60 dak) <ol><li> Buz gibi soğuk FACS tampon maddesi içinde yeniden süspanse hücreleri (PBS +% 1 FBS). </li><li> Tripan mavisi ve Hemasitometre, ya da otomatik hücre sayıcı kullanarak canlı hücreleri saymak. </li><li> Hacim başına toplam canlı hücre verimi belirleyin. Bu veriler, tahmin etmek için kullanılabilirFACS verileri ile birlikte tümör süzücü lökositlerin mutlak sayıları. </li><li> Belirlemek hücre sayısı, lekeli ve FACS ile analiz edilmesi. Bu, çeşitli faktörlere (örneğin, histoloji tipi, tümör yaşı ve boyutu, infiltre eden lökositlerin ortalama yüzdesi, vs.) tarafından etkilenir. Not: B 16 melanoma olarak, tümör infiltre eden lökositlerin düşük bir yüzde bulunan (TIL tipik olarak &lt;% 5), tümör hücreleri ile karşılaştırıldığında. Bu nedenle, en az 1 x 10 6, toplam tümör (tümör + infıltre edici lökositler) hücreleri, tipik olarak analiz için FACS ile toplanmıştır. <ol><li> Tripan-lekeli sayım verilerini kullanarak, hücrelerin hesaplanan hacmi FACS için lekeli edilecek. TIL tipik olarak toplam tümör hücrelerinin% 5&#39;i, örneğin, (tümör hücrelerinin çok tripan leke üzerinde ölecek), tümör, tek bir hücre süspansiyonunun sayısı faktörünün bu lekelenmesine. </li><li> Daha az yaygın lökosit alt grupları için) CCR9 + pDC örneğin (toplam tümör hücrelerinin daha çok sayıda kullanınörneğin 2-3, tek bir hücre süspansiyonu bu hücrelerin görece alçak frekans göz önüne alındığında, FACS boyaması için), 10 6 x. </li></ol></li><li> FACS için tümör tek bir hücre süspansiyonu Leke. <ol><li> Canlı / ölü ayrımcılık için, bir düzeltilebilir leke veya non-düzeltilebilir leke (örn propidium iyodür) kullanılabilir kullanın. Hücre canlı / ölü ayrım olmaksızın lekeli ise, dikkatli antikorların spesifik olmayan bağlanma potansiyeli verilen haber verildi gerekmektedir. </li><li> Standart FACS boyama protokolü kullanarak belirli lökosit alt grupları için hücre süspansiyonu Leke. Blok hücreler, PBS /% 1 FBS sıçan serumu ve Fc blok antijene özgü antikorlar ile lekelenmeden önce 10 dakika süre ile (Anti-CD16 / 32) içeren ve spesifik olmayan bir antikor azaltır. Boyama özgü sağlamak için doğru izotip kontrol antikorları içerir. </li><li> FACS boyama işlemi tamamlandıktan sonra, bu noktada,% 4 formaldehit ya da diğer benzer tespit edici bir madde ile örnekleri saptamak. Dekara 4 ° C&#39;de saklayın örneklerirk toplama ve analiz zamanına kadar (fluorophores söndürme önlemek için). Not: uzun süre sabit örnekleri saklanması fluorophores 21 sinyali ve yoğunluğunda bir değişiklik ile sonuçlanabilir. </li><li> Bir akış sitometresindeki örnekleri toplayın. Ayarları sitometrede Optimum akış enstrüman ve lazer / dedektör kurulum tipine bağlı olarak değişir. NOT: Ayrıca, hatta aynı makineyi kullanan eğer deneyler arasında değişkenlik olabilir. Böylece, FACS toplama ve her deney analizi öncesinde uygun tazminat ayarını sağlamak için (örneğin kalibrasyon boncuk kullanarak) uygun makine kurulumu gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Leukoctye alt kümelerinin analizi, <ol><li> FACS veri analiz yazılımı kullanarak veri analiz etmek. Canlı / ölü leke için, ölü hücreleri yolluk başlayın. Canlı hücreler içinde lökosit tanımlamak için bir lökosit özel işaretleyici (örn anti-CD45) karşı antikor kullanın. <ol><li> Bundan sonra, farklı Gati kullanımıng düzenleri boyama protokolüne bağlı olarak, belirli alt kümelerini tanımlamak için. Örneğin, CD4 + T hücreleri tespit CD45 + nüfustan SSC lo bölgeyi seçmek ve CD19-CD3 + hücreleri seçmek için; Bu CD4 + T hücrelerinden 22 tespit edilebilir. </li></ol></li><li> (Yani alt kümelerini ölçmek için toplam sayılar, yüzdeler, oranlar veya kullanmak) verileri analiz ve tutarlılığı sağlamak ve desen veya eğilimleri belirlemek için farklı şekillerde bir dizi sunmak. Not: Örneğin, toplanan toplam tümör hücreleri (Şekil 1) bir yüzdesi olarak, toplam canlı CD45 + hücre görünüyordu. Buna ek olarak, daha sonra tümörün içinde her lökosit alt-grup (örneğin, CD4 + T hücreleri) yüzdesi hesaplanır ve kontrol ve test grupları (Şekil 3) arasındaki oranı olarak bu karşılaştırıldı. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Mantovani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+in+the+recruitment+and+shaping+of+the+leukocyte+infiltrate+of+tumors.">Chemokines in the recruitment and shaping of the leukocyte infiltrate of tumors.</a> Semin Cancer Biol. 14 (3), 155-160 (2004).</li><li>Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+despite+immunosurveillance:+immunoselection+and+immunosubversion.">Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion.</a> Nat Rev Immunol. 6 (10), 715-727 (2006).</li><li>Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+and+adaptive+immune+cells+in+the+tumor+microenvironment.">Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment.</a> Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).</li><li>Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+contexture+in+human+tumours:+impact+on+clinical+outcome.">The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.</a> Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).</li><li>Curiel, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+recruitment+of+regulatory+T+cells+in+ovarian+carcinoma+fosters+immune+privilege+and+predicts+reduced+survival.">Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival.</a> Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).</li><li>Pachynski, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemoattractant+chemerin+suppresses+melanoma+by+recruiting+natural+killer+cell+antitumor+defenses.">The chemoattractant chemerin suppresses melanoma by recruiting natural killer cell antitumor defenses.</a> J Exp Med. 209 (8), 1427-1435 (2012).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+nude+mice+ubiquitously+expressing+fluorescent+proteins+for+color-coded+imaging+of+the+tumor+microenvironment.">Transgenic nude mice ubiquitously expressing fluorescent proteins for color-coded imaging of the tumor microenvironment.</a> Methods Mol Biol. 1194, 353-365 (2014).</li><li>Mansfield, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+cancer+immunology:phenotyping+immune+cell+subsets+in+situ+in+FFPE+tissue+sections.">Imaging in cancer immunology:phenotyping immune cell subsets in situ in FFPE tissue sections.</a> MLO Med Lab Obs. 46 (6), 12-13 (2014).</li><li>Serres, S., O'Brien, E. R., Sibson, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+angiogenesis,+inflammation,+and+metastasis+in+the+tumor+microenvironment+with+magnetic+resonance+imaging.">Imaging angiogenesis, inflammation, and metastasis in the tumor microenvironment with magnetic resonance imaging.</a> Adv Exp Med Biol. 772, 263-283 (2014).</li><li>Schietinger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+confocal+microscopy+imaging+of+solid+tumor+destruction+following+adoptive+T+cell+transfer.">Longitudinal confocal microscopy imaging of solid tumor destruction following adoptive T cell transfer.</a> Oncoimmunology. 2 (11), e26677 (2013).</li><li>Singh, A. S., Radu, C. G., Ribas, A. P. E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=imaging+of+the+immune+system:+immune+monitoring+at+the+whole+body+level.">imaging of the immune system: immune monitoring at the whole body level.</a> Q J Nucl Med Mol Imaging. 54 (3), 281-290 (2010).</li><li>Kilarski, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+immunofluorescence+for+visualizing+the+microcirculatory+and+immune+microenvironments+in+the+mouse+ear+dermis.">Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis.</a> PLoS One. 8 (2), e57135 (2013).</li><li>Habibollahi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+nanoparticle+imaging+allows+noninvasive+evaluation+of+immune+cell+modulation+in+esophageal+dysplasia.">Fluorescent nanoparticle imaging allows noninvasive evaluation of immune cell modulation in esophageal dysplasia.</a> Mol Imaging. 13 (3), 1-11 (2014).</li><li>Balducci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+probe+for+the+non-invasive+detection+of+tumor-associated+inflammation.">A novel probe for the non-invasive detection of tumor-associated inflammation.</a> Oncoimmunology. 2 (2), e23034 (2013).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+dendritic+cells+induce+NK+cell-dependent,+tumor+antigen-specific+T+cell+cross-priming+and+tumor+regression+in+mice.">Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice.</a> J Clin Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).</li><li>Hadeiba, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR9+expression+defines+tolerogenic+plasmacytoid+dendritic+cells+able+to+suppress+acute+graft-versus-host+disease.">CCR9 expression defines tolerogenic plasmacytoid dendritic cells able to suppress acute graft-versus-host disease.</a> Nat Immunol. 9 (11), 1253-1260 (2008).</li><li>McLean, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+BALB/c+murine+lung+alveolar+carcinoma+used+to+establish+a+surgical+spontaneous+metastasis+model.">A BALB/c murine lung alveolar carcinoma used to establish a surgical spontaneous metastasis model.</a> Clin Exp Metastasis. 21 (4), 363-369 (2004).</li><li>Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+immune+cells+from+primary+tumors.">Isolation of immune cells from primary tumors.</a> J Vis Exp. (64), e3952 (2012).</li><li>Shafer-Weaver, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+Edge:+Tumor-specific+CD8++T+cells+infiltrating+prostatic+tumors+are+induced+to+become+suppressor+cells.">Cutting Edge: Tumor-specific CD8+ T cells infiltrating prostatic tumors are induced to become suppressor cells.</a> J Immunol. 183 (8), 4848-4852 (2009).</li><li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+murine+small+intestine+leukocyte+isolation+for+global+immune+phenotype+analysis.">Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis.</a> J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).</li><li>Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+fluorescence+intensity+of+selected+leukocyte+surface+markers+following+fixation.">Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation.</a> Cytometry A. 71 (6), 379-385 (2007).</li><li>Hackstein, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+respiratory+dendritic+cell+subsets+and+lymphocyte+populations+in+inbred+mouse+strains.">Heterogeneity of respiratory dendritic cell subsets and lymphocyte populations in inbred mouse strains.</a> Respir Res. 13, 94 (2012).</li><li>Ostrand-Rosenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid-derived+suppressor+cells:+more+mechanisms+for+inhibiting+antitumor+immunity.">Myeloid-derived suppressor cells: more mechanisms for inhibiting antitumor immunity.</a> Cancer Immunol Immunother. 59 (10), 1593-1600 (2010).</li><li>Curran, M. A., Montalvo, W., Yagita, H., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+and+CTLA-4+combination+blockade+expands+infiltrating+T+cells+and+reduces+regulatory+T+and+myeloid+cells+within+B16+melanoma+tumors.">PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4275-4280 (2010).</li><li>Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunoediting:+integrating+immunity's+roles+in+cancer+suppression+and+promotion.">Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion.</a> Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Tümör mikroçevresinin ayrıntılı analizini gerçekleştirme mekanizmaları ve immünomodülasyon etkilerini belirlemede önemlidir. Tümör infiltre lökositler bu ajanların etkisini anlamak insan klinik alanda Immunotherapeutics artan varlığı ile etki mekanizmalarını tanımlarken koşul haline gelmektedir. İnsanlarda, çoğu zaman bu şekilde çevresel bağışıklık tepkisinin analizi elde edilmesi ve lökosit alt-küme analizi için tümör dokusu analiz ve klinik ve / veya lojistik zorlukları da bulunm...

tümör büyümesi ve teşvik ve regresyon arasındaki denge, kısmen, mikro-1,2 bulunan pro- ve anti-tümör infiltre eden lökositlerin dengesine bağlıdır. (TME) tümör mikro çalışma ve özellikle infiltratif lökosit alt-popülasyonunu tespit etmek amacıyla, bir fare tümör modelinde deri altı tümörleri değerlendirilmesi için bir yöntem geliştirdi. tümör mikro okuyan önemi de bilinen ve literatürde desteklenmemektedir. Çok sayıda çalışma, pro- ve anti-tümör infiltre eden bağışıklık hücrelerinin dengesini farede değil, aynı zamanda (3,4 gözden) insan üzerinde çalışmalar sadece tümör büyüme sonuçlarını etkileyebilir göstermiştir. Örneğin, Curiel ve diğ., Yumurtalık kanseri hastalarında klinik sonuçlar, tümör-süzücü düzenleyici CD4 + T hücreleri (Tregs) 5 oranları artırmak varlığı ile korelasyon kötüleştiğini göstermiştir. Kendi çalışmaları da bir hiçbir yerde etkisini gösterdiAyrıca korelasyon fare melanom modelinde 6, lökosit alt grupları oranına vel lökosit kemoatraktan tümör büyümesini azalmıştır. Böylece, bir tümör içindeki lökosit alt gruplarının detaylı analizler artık daha geniş tanınır ve giderek daha önemli. Lökositler infiltratif tümör mikroçevresinin değerlendirmek için birçok yolu vardır; yeteneği ile bazı - örneğin gruplar görüntünün TME 7, klasik immünohistokimyasal ve MR, PET, konfokal mikroskopi 9-11 gibi çeşitli görüntüleme yöntemleri de dahil olmak üzere korunmuş bölümlerin 8, immünofloresan amacıyla çeşitli floresan proteinleri ifade transgenik fareler tasarladık intravitally 10,12 monitör. Bu tür nano partiküller 13 veya yeni kontrast maddeler, bağışıklık hücreleri etiketlemek 14 gibi çeşitli moleküler görüntüleme maddeleri ile birlikte de kullanılabilir. Önerilen yöntem, bir akış sitometrisi dayalı bir yaklaşım ve birçok avantajı vardır.İlk olarak, tüm tümör mikro örnek olabilir; analiz sırasında, tüm deri altı tümör ve çevresindeki çevre cerrahi işlem için rezeke edilir. Bu, tek bir tümör içinde herhangi bir potansiyel örnekleme yanlılığı ortadan kaldırır ve bir bütün olarak tümörün bir daha &quot;küresel&quot; analizi verir. İkincisi, lökosit alt kümelerini analiz etmek sitometri renkli akışını kullanarak daha özel infiltre lökositlerin fenotip ölçmek için bize izin verir. Renklerin sayısına bağlı olarak, çok özel alt-gruplar belirlenebilir. Hatta genel alt tipi sınıflandırma - - tümör kaderini belirlemede potansiyel olarak önemli olan farklı işlevlere sahip birkaç lökosit belirli bir hücre türü içinde alt kümeleri olarak orada bu önemlidir. Örneğin, plazmasitoid dendritik hücreler (PDC) anti-tümör bağışıklık 15 implike edilmiştir. Ancak, pDC&#39;lerde ve CCR9 + alt kümesi tolerojenik 16 olduğu gösterilmiştir, ve ba değişen olmuşturBöyle bir alt kümesi mızrak tümör büyümesi üzerinde bir etkisi olabilir. Bizim yöntem subkutan veya en blok rezeksiyon edilebilecek diğer tümörler için uygundur. Bizim ellerde, tümörler eşit ötenazi sırasında rezeke edildi. Bazı çalışmalarda yapılmıştır Ancak, bu, deri altı tümör tam böylece hayvan ek olarak değerlendirilmesine imkan veren, bir hayatta kalma cerrahi 17 çevreleyen derinin kapatılması ile çıkarıldı olabilir ki, düşünülebilir. Analize daha sonra kesilen tümörün gerçekleştirilir. Böylece, sonuç tümörün gelişiminde tek bir zaman noktası temsil eder. Bu mikro içine ayrıntılı bir görünüm sağlar, aynı zamanda şüphesiz dinamik bir süreçtir ne statik resim. Bununla birlikte, izole edilmiş bir lökosit (örneğin bir manyetik ayırma veya yoğunluk gradyanı) PREVI olduğu gibi, daha sonra tümör epitel ve stromadan ayrı ayrı analiz, ya da daha da fenotipi belirlemek için diğer işlevsel tahlillerde kullanılabilirously 18 tanımladı. Bu yöntem, daha sonra, doğal hastalık tabii ortamda veya belirli bir terapötik bozulduktan sonra olsun, belirli bir zaman noktasında tümörün mikro olan lökositlerin bileşimin anlamaya yönelik bir araştırmacı için yararlı olacaktır. Tarafımızdan yapılan olmasa da, bu prosedürün varyasyonları da potansiyel olarak izole bir tümör spesifik kısımları analiz etmek için kullanılabilir. Örneğin, tümörün büyüklüğü göz önüne alındığında, periferik zon (ler) araştırmacıya tümör mikro bir daha uzamsal ayrılmış bir görünüm vermek için uzak tümörün merkez, muhtemelen nekrotik çekirdek disseke edilebilir. Tümör immünoloji alanında gelişen, hiç şüphesiz fare tümör modellerinde yeni bağışıklık maddeleri değerlendiren çalışmaların bir katlanarak artan sayıda olacak. Çeşitli raporlar, periferik tr karşı tümörün içinde belirli lökosit fonksiyon farklılıkları sermiştirçevre ve do¤a. Örneğin, Shafer-Weaver ve ark., Tümör mikro-19 kaçırılan sonra antijene spesifik efektör T CD8 + hücreleri, çevre aktif iken, CD8 + T baskılayıcı hücrelerine transforme edildi, bir fare modelinde saptandı. Bu TGFβ nedeniyle kısmen oldu, ama diğer faktörler muhtemelen de katılıyor. Böylece, lökosit alt kümelerini değerlendirilmesi - sayılar ve oranlar, yanı sıra fonksiyonel durumunu - tümörün kendisi içinde tümör kaderi belirli bir immünomodülasyon etkisinin daha doğru bir temsilini verecek. Bizim teknik tümörün detaylı analiz sağlar ve araştırmacıya daha yakından önceki yaklaşımlara göre lökosit popülasyonlarının değişiklikleri tanımlamak için bir fırsat sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="916">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:229px;">Company</td>
			<td style="width:229px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:229px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-040</td>
			<td>http://cellgro.com; keep on ice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td>http://cellgro.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>fischersci.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">40 micron filter</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td>fischersci.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-823-35</td>
			<td>fischersci.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">surgical scissors/forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5910</td>
			<td>roboz.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>MT-21-030-CM</td>
			<td>http://cellgro.com; keep on ice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">trypan blue</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>MT-25-900-CI</td>
			<td>fischersci.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hemacytometer</td>
			<td>Hausser Scientifice&#160;</td>
			<td>02-671-54&#160;</td>
			<td>fischersci.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Live/Dead stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34957</td>
			<td>lieftechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FlowJo software</td>
			<td>TreeStar, Inc</td>
			<td></td>
			<td>flowjo.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of tumor-infiltrating leukocyte subsets in a subcutaneous tumor model

Tümör mikro sızmak İhtisas bağışıklık hücreleri neoplazi büyümesini ve hayatta kalmasını düzenler. Malign hücreler sıyrılmak veya hayatta ve gelişmek için anti-tümör immün yanıtları yıkmak gerekir. Tümörler tolerojenik DC işe, immunsupresif düzenleyici T hücreleri (Tregs), ve sitotoksik anti-tümör yanıtları inhibe miyeloid türetilmiş baskılayıcı hücreler (MDSC) gibi bağışıklık farklı mekanizmaları bir dizi &quot;kaçış&quot; yararlanmak. Tümör baskılamasında katılabilir bütün immünostimülatör dendritik hücreler, doğal bir anti-tümör bağışıklık liman doğal katil hücreler ve sitotoksik T hücreleri: Bunun aksine, anti-tümör efektör bağışıklık hücreleri habis büyüme ve genişleme yavaşlatabilir. pro- ve anti-tümör lökositlerin arasındaki denge sonuçta davranış ve transforme edilmiş hücrelerin kaderini belirler; insan klinik çalışmalarda çok sayıda bu karşılanır var. Lökosit alt kümelerinin Böylece, detaylı analiz içindetümör mikro giderek daha önemli hale gelmiştir. Burada, bir fare tümör modelinde tümör mikro-ortamında mevcut infiltratif lökosit subsetleri analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Fare B 16 melanoma tümör hücreleri, C57BL / 6 farelerine deri altından aşılandı. Belirli bir zamanda, tümörler ve çevredeki cilt blok halinde çıkarıldı ve daha sonra akış sitometrisi çok renkli boyandı tek hücre süspansiyonları içine işlenir. Lökosit alt kümesi belirteçleri çeşitli kullanarak, kontrol ve chemerin-ifade tümörler arasında lökosit alt kümelerini infiltre göreli yüzdelerini karşılaştırmak başardık. Araştırmacılar, bağışıklık tümörün mikro-ortamı varlığı ve tümör büyümesinin geleneksel kalınlığı boyutu ölçümleri ile bir araya getirildiğinde, potansiyel olarak bunları, tümör büyümesi üzerinde immün bileşim içinde değişikliklerin etkisini açıklamak sağlayacak çalışma için böyle bir araç kullanılabilir. Böyle bir teknik, herhangi bir tümör modeli tatbik edilebilir olduğu tümör ve mikro-ortam CBir rezeke ve işlenebilir.

Sonuçlarımız, fazla sentezlenme murin B 16 tümörlerinde chemerin zorunlu tümör infiltre eden lökositlerin (TILS) yüzdesi artar göstermiştir. Ayrıca, chemerin ifadesi ile ilişkili tümör mikroçevresinin içinde temsil lökosit alt gruplarının nispi oranı değiştiği tespit edilmiştir. Pachynski ark. 6 izni ile yeniden yazdırın. Şekil 1, rezeke 17. günde tümör FACS analizi ile tespit edildiği üzere, kontrol grubu ile karşılaştı...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model at JoVE.com

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.

Bir deri altı tümör modelinde tümör-süzücü lökosit subsetleri Değerlendirilmesi

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

evaluation-tumor-infiltrating-leukocyte-subsets-subcutaneous-tumor

Research

JoVE Journal

Medicine

20.0K Görüntüleme.  Washington University School of Medicine. This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses. 

Video: Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Oral Skuamöz Hücre Karsinomu Ortotopik Fare Modeli Tümör Hücre Invasion Multi-foton Görüntüleme

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Tıp

An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder tumor model. The mouse model is established by urethral catheterization under inhaled general anesthetic. Chemical burn is then introduced to the bladder mucosa using intravesical silver nitrate solution to disrupt the bladder glycosaminoglycan layer and allows cells to attach. Following several washes with sterile water, human bladder cancer KU-7-luc2-GFP cells are instilled through the catheter into the bladder to dwell for 2 hours. Subsequent growth of bladder tumors is confirmed and monitored by in vivo bladder ultrasound and bioluminescent imaging. The tumors are then treated intravesically with saRNA formulated in lipid nanoparticles (LNPs). Tumor growth is monitored with ultrasound and bioluminescence. All steps of this procedure are demonstrated in the accompanying video.

Establishing an orthotopic bladder tumor model to evaluate antitumor effects of intravesically delivered saRNA and monitoring tumor growth by ultrasound and bioluminescent imaging.

Bir Ortotopik Mesane Tümörü Model ve intravezikal Sarna Tedavisinin Değerlendirilmesi

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

Bir Zebra balığı Otokton Tümör Modeli kullanılarak Melanom Değiştiricileri için Tarama

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Renal Capsule Xenografting and Subcutaneous Pellet Implantation for the Evaluation of Prostate Carcinogenesis and Benign Prostatic Hyperplasia

New therapies for two common prostate diseases, prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend critically on experiments evaluating their hormonal regulation. Sex steroid hormones (notably androgens and estrogens) are important in PrCa and BPH; we probe their respective roles in inducing prostate growth and carcinogenesis in mice with experiments using compressed hormone pellets. Hormone and/or drug pellets are easily manufactured with a pellet press, and surgically implanted into the subcutaneous tissue of the male mouse host. We also describe a protocol for the evaluation of hormonal carcinogenesis by combining subcutaneous hormone pellet implantation with xenografting of prostate cell recombinants under the renal capsule of immunocompromised mice. Moreover, subcutaneous hormone pellet implantation, in combination with renal capsule xenografting of BPH tissue, is useful to better understand hormonal regulation of benign prostate growth, and to test new therapies targeting sex steroid hormone pathways.

We describe the manufacture of compressed hormone pellets, as well as subcutaneous surgical implantation into mice. This strategy can be combined with the growth of cell and tissue xenografts under the renal capsule of athymic nude mice to evaluate hormonal carcinogenesis and regulation of benign prostate growth.

Prostat Karsinogenezde ve İyi Huylu Prostat Büyümesi ve Değerlendirilmesi için böbrek Kapsül Xenografting ve Derialtı Pelet İmplantasyonu

New therapies for two common prostate diseases,  prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend  critically on experiments ...

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans biofilms have been studied predominantly in vitro but there is a crucial need for better understanding of this dynamic process under in vivo conditions. We developed an in vivo subcutaneous rat model to study C. albicans biofilm formation. In our model, multiple (up to 9) Candida-infected devices are implanted to the back part of the animal. This gives us a major advantage over the central venous catheter model system as it allows us to study several independent biofilms in one animal. Recently, we adapted this model to study C. albicans biofilm development in BALB/c mice. In this model, mature C. albicans biofilms develop within 48 hr and demonstrate the typical three-dimensional biofilm architecture. The quantification of fungal biofilm is traditionally analyzed post mortem and requires host sacrifice. Because this requires the use of many animals to perform kinetic studies, we applied non-invasive bioluminescence imaging (BLI) to longitudinally follow up in vivo mature C. albicans biofilms developing in our subcutaneous model. C. albicans cells were engineered to express the Gaussia princeps luciferase gene (gLuc) attached to the cell wall. The bioluminescence signal is produced by the luciferase that converts the added substrate coelenterazine into light that can be measured. The BLI signal resembled cell counts obtained from explanted catheters. Non-invasive imaging for quantifying in vivo biofilm formation provides immediate applications for the screening and validation of antifungal drugs under in vivo conditions, as well as for studies based on host-pathogen interactions, hereby contributing to a better understanding of the pathogenesis of catheter-associated infections.

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.

Biyoparlaklık Görüntüleme Ardından Fare Subkutan Modeli Tıbben-ilgili yabancı Organları Candida albicans Biyofilm Geliştirme

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans ...

Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice

Osmotic pumps continuously deliver compounds at a constant rate into small animals. This article introduces a standard protocol used to induce aortic aneurysms via subcutaneous infusion of angiotensin II (AngII) from implanted osmotic pumps. This protocol includes calculation of AngII amount and dissolution, osmotic pump filling, implantation of osmotic pumps subcutaneously, observation after pump implantation, and harvest of aortas to visualize aortic aneurysms in mice. Subcutaneous infusion of AngII through osmotic pumps following this protocol is a reliable and reproducible technique to induce both abdominal and thoracic aortic aneurysms in mice. Infusion durations range from a few days to several months based on the purpose of the study. AngII 1,000 ng/kg/min is sufficient to provide maximal effects on abdominal aortic aneurysmal formation in male hypercholesterolemic mouse models such as apolipoprotein E deficient or low-density lipoprotein receptor deficient mice. Incidence of abdominal aortic aneurysms induced by AngII infusion via osmotic pumps is 5 - 10 times lower in female hypercholesterolemic mice and also lower in both genders of normocholesterolemic mice. In contrast, AngII-induced thoracic aortic aneurysms in mice are not hypercholesterolemia or gender-dependent. Importantly, multiple features of this mouse model recapitulate those of human aortic aneurysms.

Subcutaneous implantation of osmotic pumps provides a convenient approach for prolonged and consistent delivery of compounds. This approach has been used extensively to study both abdominal and thoracic aortic aneurysms in mice.

Ozmotik kullanarak Subkutan Anjiotensin II İnfüzyon Farelerde İndükler Aort anevrizmaları Pompalar

Osmotic pumps continuously deliver compounds at a constant rate into small animals.  This article introduces a standard protocol used to induce aortic ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Kantitatif gerçek zamanlı PCR ile fare meme tümör modellerinde akciğer metastazı Değerlendirilmesi

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently labelled structures in large biological specimens, and is down to cellular resolution. Meanwhile, the constant refinement of underlying protocols and the enhanced availability of specialized commercial systems enable us to investigate the microstructure of whole mouse organs and even allow for the characterization of cellular behavior in various live-cell imaging approaches. Here, we describe a protocol for the spatial whole-mount visualization and quantification of the CD45+ leukocyte population in inflamed mouse hearts. The method employs a transgenic mouse strain (CD11c.DTR)that has recently been shown to serve as a robust, inducible model for the study of the development of fulminant fatal myocarditis, characterized by lethal cardiac arrhythmias. This protocol includes myocarditis induction, intravital antibody-mediated cell staining, organ preparation, and LSFM with subsequent computer-assisted image post-processing. Although presented as a highly-adapted method for our particular scientific question, the protocol represents the blueprint of an easily adjustable system that can also target completely different fluorescent structures in other organs and even in other species.

Here, we describe a light-sheet microscopy approach to visualize the cardiac CD45+ leukocyte infiltrate in a murine model of aseptic fulminant myocarditis, which is induced by the intratracheal diphtheria toxin treatment of CD11c.DTR mice.

Bir Fulminan Miyokardit Modelinde Işık Yeri Mikroskopisi İle Lökosit İnfiltrasyonunun Nicel Görselleştirilmesi

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

İzometrik Contractility ölçüm tel Myography kullanarak fare mezenterik arter

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue (ISWAT) Transplantation Model of Murine Islets

Pancreatic islet transplantation is a well-established therapeutic treatment for type 1 diabetes. The kidney capsule is the most commonly used site for islet transplantation in rodent models. However, the tight kidney capsule limits the transplantation of sufficient islets in large animals and humans. The inguinal subcutaneous white adipose tissue (ISWAT), a new subcutaneous space, was found to be a potentially valuable site for islet transplantation. This site has better blood supply than other subcutaneous spaces. Moreover, the ISWAT accommodates a larger islet mass than the kidney capsule, and transplantation into it is simple. This manuscript describes the procedure of mouse islet isolation and transplantation in the ISWAT site of syngeneic diabetic mouse recipients. Using this protocol, murine pancreatic islets were isolated by standard collagenase digestion and a basement membrane matrix hydrogel was used for fixing the purified islets in the ISWAT site. The blood glucose levels of the recipient mice were monitored for more than 100 days. Islet grafts were retrieved at day 100 after transplantation for histological analysis. The protocol for islet transplantation in the ISWAT site described in this manuscript is simple and effective.

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue ISWAT Transplantation Model of Murine Islets

In this protocol, a method of murine islet isolation and transplantation into the inguinal subcutaneous white adipose tissue is described. Isolated syngeneic murine islets are transplanted into a murine recipient using a basement membrane hydrogel. The blood glucose level of the recipients is monitored, and histology analysis of the islet grafts is performed.

Inguinal Subkutan Beyaz Yağ Dokusu (ISWAT) Transplantasyon Modeli Murine Adacıkları

Pancreatic islet transplantation is a well-established therapeutic treatment for type 1 diabetes. The kidney capsule is the most commonly used site for ...