İmmüno-onkoloji araştırmalarında tümör mikroçevresini kapsamlı bir şekilde karakterize etmek esastır. Bu test katı tümör dokusunda bağışıklık hücrelerini ölçmek için RNA tabanlı sağlık ekspresyonu modelleri kullanmak için ilk. Bu taht, araştırmacıların FFB solid tümör dokularında immün kondoku üzerinde son derece hassas ve spesifik ölçümler elde etmelerini ve bu sonuçları çok boyutlu bir biyomarker de birleştirmelerini sağlar.
Tüm kanser tedavileri, sadece immünoterapiler, katı tümör yerinde bir bağışıklık yanıtı ortaya çıkarmak. Bu immün yanıtın ölçülmesi hastalığın ilerlemesini ve tedavi yanıtlarını anlamak için önemlidir. Bu protokol, geleneksel RNA kitaplık hazırlama tekniklerini hedefli yakalama ile birleştirir.
Zaman alıcı iken, yıkama adımlarını takip etmek ve önerilen kalite kontrol kontrol noktalarının izlenmesi başarı için çok önemlidir. Formalin-sabit parafin gömülü numunelerden yüksek oranda bozulmuş RNA için, ilk iplikçik sentez reaksiyonunu buz üzerinde tabloya göre birleştirin. Numuneleri mikrosantrifüj de kısa bir süre eğilmeden önce birkaç kez yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak reaksiyonları iyice karıştırın.
Santrifüjün sonunda, numuneleri hemen masadan üç numaralı programı takiben önceden ısıtılmış bir termal döngüye yerleştirin. Yüksek kaliteli bozulmamış RNA için, tablolarda belirtildiği gibi çekirdeksiz BIR PCR tüpünde buz üzerinde ilk iplikçik sentez reaksiyonu monte edin. Bu prosedüre başlamak için, 200 nanogramlık barkodlu ilgi alanıile iki mikrogram COT-1 DNA'sını ve iki mikrolitre bloke oligoyu çekirdeksiz bir PCR tüpünde karıştırın.
Sonra tüp içeriğini kurutmak için 30 ila 45 santigrat derece ayarlanmış bir vakum konsantratör kullanın. Hibridizasyondan sonra, termal döngüceden numuneleri çıkarın ve ısıl işlem kapağı 70 santigrat dereceye ayarlanmış 65 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. 17 mikrolitre tam homojenize boncukları numunelere ve pipetlere 10 kez yukarı ve aşağı aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın.
DNA'yı boncuklara bağlamak için tüpleri termal döngücünün içine yerleştirin 10 adet kısa bir süre için, boncukları yeniden asılı tutmak için üç saniyelik nazik girdap için her 10 ila 12 dakikada bir soyulmuş tüpleri çıkartın. Bağlayıcı kuluçka hemen ardından, termal döngücün tüpleri bir şerit çıkarın ve tüpler için önceden ısıtılmış yıkama tampon biri 100 mikrolitre ekleyin. Pipet iyice yukarı ve aşağı 10 kez ve boncuktamamen supernatant içeren sınırsız DNA aspire etmeden önce yıkama çözeltisinden ayırmak için izin vermek için bir manyetik raf tüpleri yerleştirin.
Raftan tüpleri çıkarın ve kabarcıkları önlemek için özen boncuk lar tamamen askıya almak için kapsamlı karıştırma ile önceden ısıtılmış sıkı yıkama tampon 150 mikrolitre ekleyin. Tüpleri 65 santigrat derecede, tüpleri manyetik rafa yerleştirmeden önce beş dakika boyunca termal döngüye geri yerleştirin ve boncukların süpernatants'tan tamamen ayrılmasını bekleyin. Supernatants içeren sınırsız DNA atın, sadece iki sıkı yıkama toplam gösterildiği gibi önceden ısıtılmış sıkı yıkama tampon ile boncukbir kez daha yıkayın.
Son yıkamadan sonra, supernatant çıkarın ve tüpler için oda sıcaklığında yıkama tampon bir 150 mikrolitre ekleyin. Pipet, boncukları tamamen yeniden askıya almak ve kapakları iki dakika boyunca kapatılan numuneleri 30 saniye girdap arasında dönüşümlü olarak ve 30 saniye dinlendirerek 10 ila 20 kez yıkayın. Kuluçka sonunda, kısa bir süre santrifüj ve manyetik raf tüpleri yerleştirin ve boncuklar tamamen mıknatıs yapışmış bir kez supernatant çıkarın.
Tüpleri kapaklar kapalı kısa bir süre için santrifüj edin ve örnekleri manyetik rafa geri döndürün. Herhangi bir artık yıkama tampon kaldırmak ve oda sıcaklığında yıkama tampon iki 150 mikrolitre eklemek için 10 mikrolitre pipet kullanın. Pipet, boncukları tamamen yeniden askıya almak ve kapakları iki dakika boyunca kapamak ve 30 saniye boyunca girdap arasında dönüşümlü olarak numuneleri kuluçkaya yatırmak için 10 ila 20 kez yıkayın.
Kısa bir santrifüjden sonra, her tüpteki boncuk ların tüm hacmini temiz nükleaz içermeyen PCR tüplere aktarın ve tüpleri manyetik rafa yerleştirin. Süpernatants içeren sınırsız DNA attıktan sonra, kısaca örnekleri tekrar santrifüj ve manyetik raf içinde iken boncuk herhangi bir artık yıkama tampon kaldırmak için 10 mikrolitrelik pipet kullanın. Boncukları tamamen yeniden askıya almak için tüplere ve pipetlere 150 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin ve 10-20 kez pipet ekleyin.
Kısa bir süre santrifüj etmeden önce tüpü 30 saniye lik nazik girdap ile 30 saniye arasında değişen iki dakika kuluçkaya yatırın. Tüpleri manyetik rafa yerleştirin ve boncuk örneklerini kısaca santrifüj edin. Onlar raftüpleri çıkarmadan önce manyetik raf ve tüp başına çekirdeksiz su 20 mikrolitre boncuk resuuse önce boncuk herhangi bir artık yıkama tampon kaldırmak için 10 mikrolitrelik pipet kullanın.
Daha sonra boruların yan tarafına yapışmış boncukların askıya alınmasından emin olmak için boncukları 10 kez alın. Ek temizleme gerekip gerekolmadığını belirlemek için bağdaştırıcı dimers varlığı değerlendirilmelidir. Örneğin, bu elektroperogram adaptör dimer kabul edilemez bir düzeyde gösterirken, bu elektroferogram 128 baz çifti etrafında keskin bir tepe olarak görünür adaptör dimer kabul edilebilir bir düzeyde gösterir.
Tedavi öncesi ve sonrası immün profiller, belirli bir tedavinin tümör mikroortamı üzerindeki etkilerini anlamak için kullanılabilir, çünkü bu temsili analizde ilgi çeken her bir bağışıklık hücresi için yüzde değişimleri ve toplam immün içerik tek bir hasta için kemoterapi öncesi ve sonrası gösterilmiştir. Bu analizde hasta grupları arasındaki örnekler tedavi sonrası hastalık progresyonu ile zamanlarına göre karşılaştırıldı. Hastaların bir alt kümesi 18 ay sonra hastalık nüks gösterdi, başka bir alt küme 18 veya daha az ay içinde daha hızlı ilerledi.
Ortanca delta değeri daha sonra hastalığın ilerlemesi putatif biyobelirteçleri tanımlamak için her örnek için karşılaştırılabilir. Örneğin, burada iki immün kaçış geni örnek gruplandırmaların istatistiksel olarak anlamlı ayırıcıları olarak tanımlanmıştı. Bireysel gen biyobelirteçleri net istatistiksel anlamlılıkla sağlam olduğundan, çok boyutlu biyomarker önemli bir tahmin değeri eklemedi.
Isıtılan yıkıntıları numune soğutmasını önlemek için bir seferde bir şerit ten teşkezlediğinden emin olun ve hedef dışı kontaminasyonu önlemek için boncukları taze tüplere aktarmayı unutmayın. Bu protokol, gen ekspresyonu modellerinin bağışıklık hücreleri ve tümör dokusunu ölçmek için kullanıldığını göstermektedir. Yeni modeller tükenme veya aktivasyon gibi hücre durumlarını ölçmek için geliştirilmektedir.
