Bu protokol, diğer araştırmacılara doğrudan ve etkili deneysel yaklaşımlar ve yeni aşı adjuvanlarının hücresel yanıt etkinliklerini değerlendirmek için ayrıntılı adımlar sağlayabilir. Araştırmacılara sadece adjuvanlar için spesifik hücresel değerlendirme yöntemleri sağlamakla kalmaz, aynı zamanda BM hastalığı gibi ekstraksiyon yöntemlerini de parçalayabilir. Bu protokoller sadece toksisite ve yüksek hücresel doğum göstermemekle kalmaz, aynı zamanda adjuvan değerlendirme alanı için ayrıntılı prosedürler sağlar.
Başlamak için su banyosunu açın ve sıcaklığı 37 santigrat dereceye ayarlayın. Daha sonra sıvı azottan bir tüp dondurulmuş L929 hücresi topladıktan sonra, su banyosunda hızla çözülür. Hücreleri 15 mililitrelik steril bir santrifüj tüpüne pipetledikten sonra, iki mililitre DMEM ekleyin ve iyice karıştırın.
Numuneleri beş dakika boyunca 129 x g'de santrifüj yapın. Süpernatanı attıktan sonra, hücreleri yeniden askıya almak için iki mililitre DMEM ekleyin. Numuneleri tekrar santrifüj yapın.
Süpernatanı attıktan sonra, yeniden süspansiyon için altı mililitre DMEM tam ortamı ekleyin ve 48 saat boyunca% 5 karbondioksit içeren 37 santigrat derecelik bir inkübatörde T25 santimetrekare kültür şişesine aktarın. Birincil aşılamadan sonraki 24. günde, fareleri hayvan odasından çıkarın, bir cam kaba koyun ve beş dakika boyunca% 75 alkole batırın. Santrifüj tüplerini bir santrifüj tüp rafına yerleştirin, tek kullanımlık Petri kaplarını numaralandırın ve 10 mililitrelik bir pipetle her Petri kabına beş mililitre PBS ekleyin.
Farenin sol ventral tarafının ortasında makasla altı ila sekiz santimetrelik bir kesi yapın. Karın duvarını açığa çıkarmak ve dalağın uzun kırmızı şeridini bulmak için cildi yırtın. Daha sonra, dalağın alt tarafındaki peritonu, forseps ile kaldırın.
Dalağı ortaya çıkarmak için kesin ve yukarı doğru çevirin. Dalağı forseps ile kaldırın. Dalağın altındaki bağ dokusunu oftalmik makasla ayırın ve dalağı çıkarın.
Dalağı beş mililitre PBS içeren bir Petri kabına yerleştirin ve bir elek ve şırınga pistonu ile öğütün. Taşlamadan sonra, sıvıyı numaralandırmaya uygun olarak pipetli 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra, sıvıyı beş dakika boyunca 453 x g'de santrifüj edin.
Süpernatanı attıktan sonra, her tüpe üç mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponu ekleyin. Hücreleri tekrar askıya alın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca lize edin. Daha sonra her tüpe 10 ila 12 mililitre PBS ekleyin.
Ve beş dakika boyunca 453 x g'de karıştırıp santrifüj yaptıktan sonra, süpernatantı atın ve her santrifüj tüpüne 10 mililitre PBS ekleyin ve hücreleri yeniden askıya alın. Hücre sayma plakasının bir kuyucuğuna her numunenin 20 mikrolitresini alın ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak canlı hücre sayısını kaydedin. Daha sonra, numuneleri beş dakika boyunca 453 x g'de santrifüj yapın.
Süpernatanı attıktan sonra, RF10 ortamı ile mililitre başına altıncı hücrelere 2,5 x 10 oranında seyreltin ve kuyu başına 100 mikrolitrede 96 delikli bir plakaya ekleyin. Farenin karnının altında altı ila sekiz santimetrelik bir kesiyi makasla kesin ve farklı yönlerde ayırmak ve farenin bacaklarını ortaya çıkarmak için açıklığın iki ucunu kelepçeleyin. Fare femurunu fare gövdesinden ve tibiası eklemden ayırın.
Ve kemikleri her iki ucunda da sağlam tutun. Daha sonra, femur her iki ucundaki eklem eklemlerinden kalan doku ve kıkırdağı makas ve forseps ile çıkarın. Femurları beş dakika boyunca% 75 alkole batırın ve ardından yüzey alkolünü yıkamak için steril bir PBS çözeltisine batırın.
Daha sonra femurların uçlarını makasla kesin ve kemik iliğini steril PBS çözeltisi ile steril bir Petri kabında durulayın, ardından bir mililitrelik bir şırınga ile aspirasyon yapın. Yıkamayı üç ila beş kez tekrarlayın. Daha sonra, bir hücre eleği ile filtreleyin ve kemik iliği kaynaklı dendritik hücreleri 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın.
Numuneleri beş dakika boyunca 290 x g'de santrifüj ettikten sonra, süpernatantı atın ve dört mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponu ekleyin, beş dakika boyunca oda sıcaklığında yeniden askıya alın ve lize edin. Daha sonra, lizatı nötralize etmek için 10 mililitre steril PBS çözeltisi ekleyin ve beş dakika boyunca 290 x g'de santrifüj yaptıktan sonra, süpernatanı atın. Hücreleri% 1 penisilin-streptomisin çözeltisi ve% 10 fetal sığır serumu içeren bir mililitre DMEM'de yeniden askıya alın ve sayın.
Daha sonra ortama granülosit makrofaj kolonisi uyarıcı faktör artı interlökin-4 ekleyin. Hücre konsantrasyonunu mililitre başına 5 x 10 ila beşinciye ayarlayın ve hücreleri kapak fişlerine aşılayın. Hücre süspansiyonunu kuyu başına iki mililitrede altı kuyucuklu bir plakaya ekledikten sonra, plakayı 48 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin.
İki gün sonra ortamı tamamen değiştirin ve dört gün sonra ortamın yarısını değiştirin. Fareleri% 75'e batırınötenaziden sonra alkolün ve yüzüstü bir cam Petri kabına numaralandırılmış sırayla yerleştirin. Fareleri transfer penceresinden steril ameliyathaneye geçirin ve beş dakika boyunca ameliyat masasına yerleştirin.
Şırıngayı kullanarak, 10 mililitre salin aspire edin. Fareleri yaklaşık 45 derecede aşağı doğru eğin ve karın boşluğunun ortasına enjekte edin. Her 10 mililitre için 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yaklaşık beş mililitre hücre süspansiyonu çekin ve enjeksiyonu üç kez tekrarlayın.
Fare periton primer makrofajlarını elde etmek için hücre süspansiyonunu beş dakika boyunca 129 x g'de santrifüj yapın. L929 fibroblastları, NOD'nin in vitro toksisite testi için yararlı bir tarama modelidir. Dalaktaki enflamatuar sitokin seviyelerinin miktarı, araştırmacıların bağışıklık tepkisini daha iyi anlamalarına yardımcı olabilir.
Sitotoksik T lenfositlerin enzime bağlı immünospot ile izlenmesi, klinik çalışmalarda antijene özgü T hücresi bağışıklığının değerlendirilmesinde ve aşı adaylarının taranmasında altın standarttır. Bir antijenin dendritik hücreler tarafından artan alımı, gelişmiş adaptif immün yanıtlar ortaya çıkarabilir. Makrofajlar, antijenlerin T hücrelerine sunulmasında ve diğer antijen sunan hücrelerin ko-uyarıcı molekülleri eksprese etmelerini ve böylece adaptif immün tepkilerin başlatılmasında önemli bir rol oynamaktadır.
Hücrelerin ilacın hücre etkisine oranı altında izole edilmesi son derece önemlidir.
