Yeni tekniğimizin en büyük avantajı, ona E artı E olarak adlandırdık, ki bu zenginleştirme artı genişleme anlamına gelir, bu hücreleri zenginleşebilir ve genişletebiliriz, nadir antijene özgü hücreler, aynı anda. Bu bize farklı ortamlarda ve farklı klinik ortamlarda rollerini araştırmak için kullanmak mümkün olacak hücrelerin yeterli sayıda geliştirmek için izin verir hatta bize daha önce yapamadık bir şekilde immünoterapi için kullanabileceğiniz hücrelerin çok sayıda şimdi geliştirmek için izin verir. Geliştirdiğimiz yöntem, bu E artı E, neoepitopların varlığı hakkında temel immünolojide anahtar soruların cevaplatEdilmesine yardımcı olabilir.
Neoepitoponlar nelerdir? Bunlar bildiğimiz kişiselleştirilmiş epitoplar artık kanser immünoterapisi ve aynı zamanda antijene özgü dinamikler ve bu faktörlerin hastalık durumlarını nasıl etkilediği ve etkili hücresel tedavi açısından çok önemlidir. Nanopartikül yapay antijen sunan hücre kolayca bireysel hasta bağışıklık yanıtları için uyarlanmış bir off-the-raf ürün olabilir gibi bu tekniğin etkileri, immünoterapi doğru uzanır.
Nanopartikül yapay antijen sunan hücreler oluşturmak için, resuspension tampon bir mililitre liyophilized parçacıklar resuspend ve kuvvetle hiçbir agrega görünür kadar en az 15 dakika boyunca süspansiyon girdap. Proteinle reaksiyondan önce yeterince girdaplanmamış ve yeniden askıya alınmamış parçacıklar, ayrıştırılamayan daha büyük birleştirilmiş parçacıklara neden olur. Manyetik parçacıkları manyetik bir standa yerleştirin ve süpernatantı çıkarın ve 0,5 mililitre taze süspansiyon tamponu yla yeniden askıya alın.
Parçacık süspansiyonunu, agrega lar görünmeyene kadar girdap için bir cam ışıltılı şişeye aktarın ve bir miligram yeniden askıda parçacık başına 0,1 miligram toplam uyarıcı sinyal ekleyin. Girdap sonra, süspansiyon bir rotator karıştırma ile oda sıcaklığında 2,5 saat boyunca tepki sağlar, karıştırma ile oda sıcaklığında ek bir 30 dakikalık kuluçka için söndürme tampon 0,1 mililitre eklenmesi izledi. İkinci reaksiyonun sonunda, scintillation şişesini manyetik standın üzerine yerleştirin ve parçacıkları bir mililitre resuspension tamponunda dört kez yıkayın, her yıkamadan sonra netolduğunda tamponu temizleyin ve mıknatısın üzerindeki sonraki yıkama için taze süspansiyon tamponuyla değiştirin.
Son yıkamadan sonra, çözeltiyi aspire edin ve parçacıkları manyetik standdan çıkarın, sonra parçacıkları bir mililitre taze resuspension tamponunda dört derece ye kadar altı aya kadar saklayın. Antijene özgü CD8+T hücrelerini izole etmek için, yabani tip C57 siyah 6J farelerden dalak ve lenf düğümlerini sık PBS durulamaları olan steril, 70 mikrometrelik hücresüzve üreticinin talimatlarına göre CD8+T olmayan hücreleri ortadan kaldırmak için bir no-touch CD8+T hücre izolasyon kiti kullanın. Saydıktan sonra, izole CD8+T hücrelerini santrifüj ile toplayın ve peleti %0.5 Bovine Serum Albumin ve iki milimolar EDTA ile desteklenen 100 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın, sonra nanopartikül yapay antijen sunan hücreler ile hücreleri kuluçkaya yatırın ki, 11.peptid yüklü MHC-ig'den 11'e kadar bir kere10'dan steril olarak altıncı izole CD8+T hücrelerine kadar , beş mililitre polistiren yuvarlak dipli tüp sürekli karıştırma ile dört derece santigrat bir saat için.
Kuluçka sonunda, nanopartikül hücre süspansiyonunu gösterildiği gibi manyetik standda üç kez yıkayın, yapay antijen sunan hücreleri ve zenginleştirilmiş CD8+T hücrelerini 500 mikrolitre taze, son yıkamadan sonra %1 T hücre büyüme faktörüile takviye edilmiş orta hücrelerde yeniden sulandırın. Maksimum hücre kurtarma için, en az iki dakika boyunca manyetik kolon üzerinde parçacıklar ve hücreler bırakmak ve manyetik alana tabi parçacıklar ve hücreler bozmadan dikkatli bir şekilde tampon aspire etmek önemlidir. Sayma sonra, tohum 2.5 kez 10 beşinci zenginleştirilmiş CD8 + T hücreleri ve manyetik parçacık karışımı başına 160 mikrolitre takviye orta artı 1% TCGF 96-iyi U-dipli plaka.
Üçüncü Gün'de, iyi başına% 2 T hücre büyüme faktörü ile takviye orta 80 mikrolitre ile hücreleri beslemek ve dört gün daha hücre kültürü kuluçka için plaka dönmek. Yedinci Gün' te, uyarılmış hücreleri saymak için beş mililitrelik yuvarlak dipli bir tüpe alın ve santrifüj le hücreleri toplayın. PBS 0.5 mililitre pelet resuspend 0.05% sodyum azit ve 2% fetal sığır serum sayma için takviye ve aliquot beş kez 10 dördüncü beş kez 10 beşinci hücrelere yeni beş mililitre yuvarlak dipli tüpler içine antijen özgü boyama için.
Uygun tüpleri biyotinylated MHC-ig ve anti-mouse CD8a ile dört santigrat derecede bir saat etiketleyin, herhangi bir aşırı biyotinylated immünglobulin kaldırmak için taze PBS bir santrifüj yıkama takip, sonra uygun bir streptavidin konjuge ikincil antikor ve uygun bir canlı ölü fikse edilebilir ölü hücre suş ile örnekleri leke 15 dakika dört santigrat derece ve standart protokollere göre antijen özgül CD8 + T hücrelerinin özgüllüğünü ve sayısını belirlemek için bir akış sitometre hücreleri okuyun. Burada parçacıklara protein bağlanmasının üç farklı yöntemi kullanılarak başarılı bir protein çekimi sağlanmıştır. AAPC ligand yoğunluğu çok düşükse, antijene özgü CD8+T hücrelerinin etkili bir uyarılması olmayacaktır.
Biyotinylated dimer kalite kontrolü boyama doğrulamak için transgenik CD8 + T hücrelerinde tamamlanabilir. Örneğin, bu temsili sonuçlar, arka plan kontrolü olarak antijene özgü olmayan b6 CD8+T hücreleri ile gp100 spesifik CD8+T hücreleri ile pozitif boyama göstermektedir. Ayrıca, biyotinylated dimer arka plan boyama bilgisi önemlidir, biliş lekeli tüplerde bu boyama daha düşük herhangi bir yüzdesi olarak olumsuz bir sonuç olarak kabul edilmelidir.
Yedi günlük zenginleştirme ve genişlemeden sonra, 10-4 ve iki katı arasında 10 ila beşinci antijene özgü ve %5-50 CD8+T hücreleri orijinal beş ten 10'a kadar altıncı endojen CD8+T hücresi başlangıç popülasyonundan beklenebilir. Aynı metodoloji, zenginleştirmeden sonra sadece bir haftalık genişlemeden sonra gözlenen antijene özgü CD8+T hücrelerinin yüzdeve sayısında benzer artışlar ile insan antijene özgü CD8+T hücrelerini izole etmek ve uyarmak için kullanılabilir. Bu yordamı denerken, açıklandığı gibi uygun reaktif kalite denetimleri gerçekleştirmek için hatırlamak önemlidir.
Bu prosedürü takiben, hücre içi sitokin boyama veya yüzey protein ekspresyonu için akış sitometrisi gibi diğer yöntemler hücrelerin işlevselliği veya fenotip hakkında ek soruları cevaplamak için gerçekleştirilebilir. Bu teknik, temel immünoloji alanında araştırmacıların kanser, bulaşıcı hastalık veya otoimmünite araştırmaları gibi diğer biyomedikal alanlarda antijene özgü yanıtların genişliğini, derinliğini ve dinamiklerini keşfetmelerinin önünü açar.
