Bu video protokolünün amacı Embriyonik Fare Nöral Kök Hücre İzolasyon ve Kültür için bir kaynak ve verimli bir protokol oluşturmaktır. Merhaba, ben Meryem Sadeghi-Zadeh. Royan Enstitüsü'nde Hücresel ve Moleküler Biyoloji yüksek lisans öğrencisiyim.
Bugün ben ve meslektaşım size 13 embriyo fare ganglionik itibar dan nöral kök hücre hasat nasıl göstermek istiyorum. Merhaba, ben Bahareh Alizadeh-Shoorjestan. Royan Biyoteknoloji Enstitüsü Kök Hücre Bölümü'nde Hücresel ve Moleküler Biyoloji yüksek lisans öğrencisiyim.
Merhaba, ben Rıza Dehghani-Varnamkhasti. Ayrıca Royan Enstitüsü'nde Hücresel ve Moleküler Biyoloji okuyorum. Cerrahi işlemler rahim her 13 fare embriyoları hasat içerir.
Kafatasından beyni çıkaran bükülmüş bir iğne ucuyla embriyonun fontanel'inin ön ünü kesmek. Ganglionik saygınlığı toplamak için izole beynin mikro-diseksiyonu. Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için nöral kök hücre orta hasat doku dissociation.
Ve son olarak, sinir hücreleri oluşturmak için bir süspansiyon kültürü nde hücreleri kaplama. Temiz ve dezenfektan karın bölgesinin cilt% 70 etanol ile püskürterek. Kontrol deri yukarı karın ve daha sonra karın boşluğu ve rahim boynuzları ortaya çıkarmak için makas ile deri ve altı çizili yüz kesti.
Makas ile embriyoiçeren rahim boynuzları çıkarın ve 25 ml soğuk HEPES MEM tampon içeren 50 ml konik tüp içine transfer. Konik tüpü laminal akış başlığının altına yerleştirin. Kaputun altındaki kapağı aç.
Rahim boynuzlarını tüpten dışarı getirin ve enkaz ve kanı ortadan kaldırmak için taze soğuk HEPES MEM tamponunun yeterli hacmiyle üç kez durulayın. Rahim dokusunu 7 ila 10 ml soğuk HEPES MEM tamponu içeren 10 cm'lik petri kabına aktarın. Rahim boynuzlarını ince makas kullanarak açın ve embriyoları 7 ila 10 ml soğuk HEPES MEM tamponu içeren yeni bir tabağa aktarın.
Şimdi mikro-diseksiyon işlemi için diseksiyon mikroskobu n altında embriyolar ile 10 cm çanak koyun. Bir şırınga iğnesinin ucunu çelik neşter bıçak sapına bastırarak bükün. Ucu 70 ila 90 derecelik bir açıyla bükülene kadar iğnenin ucunu bükün.
İğnenin ucundaki bükümü görmek için kesme mikroskobunun altındaki iğnenin ucunu kontrol edin. Doğal olarak embriyolar bu bir lateral konuma sahip. Konumlarını değiştirmeden, ince forceps ile embriyo nun boyun ve vücut düzenlenen ve daha sonra derin embriyo başının fontanel önüne iğne bükülmüş kısmını yerleştirin.
Orada küçük bir kanama ya da kan pıhtısı olurdu. Bükülmüş kısmı alına doğru şişkinlik içinde ve daha sonra başın arkasına doğru iken yüzeysel iğne ucu taşıyın. Deri ve kafatası ile kesmek için emin olun, ve altta yatan beyin zarar değil.
Beyin ortaya çıkarmak için yanal iğne ucu ile cilt itin. İğneyi derinin lateral tarafından beynin altındaki bölgeye deri den lateral tarafına kadar çerçevenin altına yerleştirin. Ve sonra bu kafa derisi nden beyin çıkararak onu parçalanmış kafatası ndan çıkması için iterek.
Ganglionik itibar açıkça medial ve lateral parçaları ile video gösterilir. Beyin bakım forsepskullanarak sabit tuttu ve sonra ganglionik itibar ortaya çıkarmak için her yarımkürenin korteksini kesmek için mikroskalsors kullanarak. Beyin düzenlenen ve nöral kök hücre medya içeren 15 ml santrifüj tüp içine diseksiyon ganglionik itibar yerleştirin.
Tüm beyin mikro-diseksiyon olana kadar bu işlemi tekrarlayın. Tek bir hücre süspansiyon almak için doku kırmak için 2 5 kez yukarı ve aşağı süspansiyon tüp ve pipet altına pipet ucu yerleştirerek kesilen ganglionik itibar kesilir. Süspansiyonu 110 g'da 5 dakika santrifüj edin.
Supernatant çıkarın ve EDTA% 0.05 tüp 1 ml hücreleri yeniden askıya. Hücre süspansiyonuna 37 derece lik bir süre 10 dakika kuluçkaya yat. Ve sonra tripsin aktivitesini durdurmak için soya tripsin inhibitörü eşdeğer bir hacim ekleyin.
Pipet, tripsinin tamamen inaktive edildiğinden emin olmak için hücre süspansiyonu yukarı ve aşağı. Hücre süspansiyonuna 110 g'da 5 dakika santrifüj edin. Supernatant çıkarın ve tam nöral kök hücre orta 1 ml hücreleri resuspend ve hücre sayısını saymak.
Nöral kök hücre orta hücreleri uygun boyutta doku kültürü şişesi içine plaka. 2T25 5 ml, T75'e 20 ml ve T175 şişelerine 40 ml aktarın. Nörosferler 3 gün sonra 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde %5 CO2 ile ortaya çıkar.
Kültür nörosferleri emmek için, 5 dakika boyunca 110 g santrifüj için santrifüj için askıya nörosferler ile orta transfer, ve sonra supernatant atın. 1 ml 0.05% tripsin EDTA ve inkübate 37 derece Santigrat 10 dakika. Sonra soyaben tyrpsin inhibitörü ve pipet kullanarak tripsin inaktive yavaşça yukarı ve aşağı onları tek hücre yapmak için nörosferler.
Hücre süspansiyonuna 110 g'da 5 dakika santrifüj edin. Supernatant atın ve nöral kök hücrelerin orta 1 ml hücreleri resuspend. Bu hücreler ileri deneyler için laminat ve tamamen kaplanmış yüzeyde bir sonraki adım kültür veya kültür için hazırdır.
Yedi gün sonra bir milyon birincil nöral kök hücre yetiştirerek hücre sayısı üç ila dört milyona çıkacaktır. Altı ila yedi gün sonra küreler çapı 150 ila 200 mikrometre arasında ölçmek gerekir ve nöronal farklılaşma için bFGF ve EGF yokluğunda laminat poli ornitin kaplı yemekler alt kültür için hazır olacaktır. Akış sitometri tahdit sonuçları, nörosferleri oluşturan hücrelerin %95'ine yakınının nöral kök hücreler için bilinen bir belirteç olan Nestin pozitif olduğunu göstermektedir.
Beta tubulin III ve ganglio fibröz protein antikorları kullanılarak yapılan tahliller, kaplamalı yüzeyde nöral kök hücrelerin %94 civarında işitilmesi yle nöronal fenotip ve yaklaşık %5'inin glial fenotip gösterdiğini ortaya koymaktadır. Sadece bu kısa video 13 fare embriyo ganglionik saygınlık nöral kök hücrenin hızlı izolasyon için bir laboratuvar tekniği. Umarım nöral kök hücre kültüründe başarılı olursun.
