Bu eser Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü, NIH / DHHS tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma aynı zamanda Anne, Perinatal ve Çocuk Sağlığı Wayne State Üniversitesi Perinatoloji Girişimi tarafından, kısmen, desteklenmiştir. Biz minnetle yazının onun eleştirel okumalar için Maureen McGerty (Wayne State Üniversitesi) kabul eder.

Bu protokol, akış sitometrisi ile, immünofenotipik hazırlık Desidua basalis ve Desidua parietalis lökosit izolasyonu için uygundur. Bundan başka, izole edilen hücreler hücre sıralama, hücre kültürü, RNA izolasyonu ve sitoloji için kullanılabilir. Bu protokolde belirtilen numuneler ile çalışmaya başlamadan önce, insan etik onay Yerel Araştırma Etik Kurulu ve Kurumsal Gözden Kurulları alınmalıdır. toplanması ve araştırma amaçlı insan örneklerinin kullanılması Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi (NICHD) Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü Kurumsal İnceleme Kurulları, Sağlık (NIH) National Institutes of, Sağlık ve İnsan Hizmetleri Departmanı (DHHS tarafından kabul edildi , Bethesda, MD, ABD) ve Wayne State Üniversitesi (Detroit, MI, USA). Yazılı bilgilendirilmiş onam önce doku örneklerinin toplanması için tüm hamile kadınların elde edilmiştir. NOT: Hayvan kanı, hücreleri, ya da tehlike ile çalışırkenBu protokolde belirtildiği gibi lı ajanlar, doğru biyogüvenlik ve laboratuvar güvenliği eylemleri takip edilmesi esastır. İnsan Desidual Dokuların 1. Diseksiyon NOT: Bazal plaka tabanı altında ve plasenta bağlı olduğu ve anne yüzeyi temsil eder. chorioamniotic membranlar amniyon ve koryon bulunmaktadır. bazal plaka desidua basalis içerir ve koryon desidua parietalis (Şekil 1) içerir. <ol><li> Desidua Basalis <ol><li> Plasenta (Şekil 1A ve 1B) bir kotiledondan taban levhasının bir parça teşrih. </li><li> Yukarı bakacak şekilde plasental villus ile steril bir kesme tahtası üzerine yerleştirin. plasental villus gösteren tarafı genellikle görünüşte kıllı doku ile kanlı kırmızı. bazal plaka pürüzsüz ve kırmızı renkli solgun. </li><li> Vill çıkarmak için keskin, ince nokta makas ve forseps kullanınlı doku ve kan damarları. Süreç (Şekil 1C) sırasında (serbest - - 2 + ve Mg Ca 2+) 1x PBS batırılmış doku tutun. Bu parçaların 2-3 toplayın ve kan (Şekil 1D) kaldırmak için 1x PBS ile iyice durulayın. </li></ol></li><li> Desidua Parietalis <ol><li> Chorioamniotic membran bir parça teşrih (yaklaşık 10 cm, 10 cm, Şekil 1E x). Koryon yukarı bakacak şekilde gemide yerleştirin. koryon tarafı kanlı pıhtıları içerir ve genellikle sarımsı renkte ışık. </li><li> Mümkün (Şekil 1E) olarak kan pıhtılaşması gibi birçok kaldırmak için ince nokta forseps kullanın. 1x PBS berrak bitene kadar membran aşırı kan temizlemek için steril 1x PBS membran durulayın. </li><li> Yavaşça zardan desidual katman kazımak için tek kullanımlık steril hücre kazıyıcı kullanın. Mem steril 1x PBS Uygulabrane bu süreci (Şekil 1F) tamamlarken. Desidual dokuları toplamak ve steril 1 x PBS (Şekil 1G), bir 50 ml plastik tüp içine yerleştirin. </li></ol></li></ol> 2. Mekanik Ayrıştırma ve Enzimatik Sindirim <ol><li> Bir 50 ml&#39;lik plastik bir tüp içinde, steril 1 x PBS ile (Aşama 1.1.3 den) Desidua basalis kesilerek doku ya da (Kademe 1.2.3 den) Desidua parietalis yıkayın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile pelet doku toplanır. </li><li> Dikkatlice pelet bozmadan doku pelet üzerinde bulunan süpernatant aspire. NOT: kırmızı kan hücreleri içerdiğinden bu noktada, pelet çok gevşek. Pelet hacmi veya 3 mi ise, hücre ayırma çözeltisi, 6 ml, 37 ° C&#39;ye kadar önceden ısıtılmış pelet yeniden askıya. Pelet hacmi 3 ml büyükse, daha fazla hücre dekolmanı çözüm eklemek (th yaklaşık 2 kat eklemekdoku örneklerinin e hacmi). </li><li> Bir Cı tüpüne homojenize dokular (Desidua basalis + hücre dekolmanı çözelti veya Desidua parietalis + hücre sıyrılma çözeltisi) aktarın. </li><li> Otomatik dissociator C tüpü yerleştirin ve ilgili programı çalıştırın. NOT: desidua bazalisin program çalıştırmak başına 668 toplam mermi ile 17 saniye boyunca çalışır. desidua parietalis program çalıştırmak başına 235 toplam mermi ile 37 saniye boyunca çalışır. Bu programlar desidua bazalisin ya da iyi verim ve hücre canlılığı ile desidua parietalis gelen lökosit izole etmek için özelleştirilmiş edilmiştir. </li><li> Örneğin Accutase gibi ticari olarak temin edilebilen hücre ayırma çözeltisi ile dokuları sindirmek, dokuların mekanik parçalanmalanna sonra; Hafifçe çalkalama ile 37 ° C&#39;de 45 dakika boyunca (proteolitik ve kolajenolitik enzimleri içeren bir kokteyl). </li></ol> Lökosit 3. İzolasyonu <ol><li> İnkübasyondan sonra, Dige 1x 10 ml PBS ilavestion Karışım bir 50 ml plastik tüp içine, bir 100 mikron hücre süzgecinden geçirilir. Sindirim karışımı yapışkanlığının bağlı olarak, bir tek bir karışım için çok sayıda hücre gericileri kullanmak gerekebilir. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de 1 x PBS ile tüp ve santrifüj doldurun. Dikkatli bir şekilde, hücre peletleri üzerinde 1x PBS çıkarın ve buz gibi soğuk FACS tampon maddesi, 5 ml pelet yeniden askıya. NOT: 6.1 adıma gidin, birlikte polimorfonükleer ve mononükleer lökosit incelemek için; mononükleer lökosit incelemek için, 3.3 Adım ile devam edin. </li><li> 15 ml plastik tüp 20 ila% 5 ml yoğunluk gradyan ortamı (1.077 + 0.001 gr / ml) ilave edin ve yavaş yavaş yoğunluk gradyan medyanın üstüne hücre süspansiyonu kaplar. Örnek katman iken, hücre süspansiyonu ile yoğunluk gradyan ortamı karıştırmak için önemlidir. </li><li> Frensiz 4 ˚C 30 dakika boyunca 500 xg&#39;de bir salıncak-out rotorlu santrifüj. Bu hücreleri ve l karışmasını önlemek için fren kapatmak için çok önemlidirdegrade Osing. Lökositler yoğunluk gradyan medya ve FACS tampon arasındaki arayüz bulunacaktır. </li><li> Bir pipet kullanarak çok dikkatli FACS tampon ve hücre artıkları içeren üst katmanı kaldırın. arayüzde bandı desidual mononükleer hücreleri ve polimorfonükleer lökositlerin bir kısmını içerir. </li><li> Yeni bir 15 ml&#39;lik plastik tüp tamamen Ara yüzeydeki hücreleri aktarın. FACS tampon, en az 3 kat daha fazla hacim. </li><li> Hücreleri topaklaşmasına 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin. Süpernatantı aspire ve FACS tamponu ile hücreleri yıkayın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de bir santrifüj ile hücreler topaklaşmasına. NOT: Adım 6, bkz immünofenotıpleme gerçekleştirmek için adım 5. bkz hücre sıralama gerçekleştirmek için adım 4&#39;e bakın, hücre kültürü gerçekleştirmek için. </li></ol> 4. Uygulamalar - Hücre kültürü <ol><li> USI canlı hücreleri sayın RPMI kültür ortamı 1640 1 ml Adım 3.7 hücreleri yeniden askıyaOtomatik hücre sayıcı veya hemasitometre ve tripan mavisi çözüm% 0.4 ng. </li><li> 1 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir hücre konsantrasyonunu yapmak için RPMI kültür ortamı miktarı kadar ekleyin. Hücreler artık kültür için hazırız. </li></ol> 5. Uygulamalar - Birincil Hücre Kültürü için Makrofagların izolasyonu <ol><li> Manyetik CD14 mikro boncuklar (10 7 hücre başına 20 ul boncuklar) ile Aşama 3,7 hücreleri etiketlemek, CD14 + hücreler izole edilmesi için, 15 ° C&#39;de 4 dakika, ve manyetik bir alan uygulanması ile diğer hücre tiplerinden ayrı CD14 + hücrelerinin inkübe edilir. MACS tamponu ve manyetik alanın ayrılması ile 2 kez yıkamadan sonra, MACS tamponu ile manyetik muhafaza CD14 + hücreler elüte. </li><li> Santrifüj sonrasında yeniden askıya hücreleri kaplama (Şekil 2) için hazır olan RPMI 1640 kültür ortamında, hücre peletleri. </li></ol> 6. Uygulamalar - İmmünofenotipleme <ol><li> Immunophenot hücreleri kullanmak içinyping, 1 x PBS içinde 1 ml Aşama 3.7 hücreleri yeniden askıya. Otomatik hücre sayıcı veya hemasitometre ve tripan mavisi çözeltisi% 0.4 kullanılarak canlı hücreleri saymak. </li><li> Bir fixable canlılığı boya (Şekil 3) ile hücrelerin etiketleyin. FACS tamponu ile hücreler iki kez yıkayın ve leke tampon hücreleri yeniden askıya. 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca bir FcR engelleyicisi ile inkübe edin. </li><li> Florokromların konjüge hücre dışı antikor ekleyin. Örneğin, bu protokolde, anti-CD3 kullanımı, anti-CD19, anti-CD14, anti-CD15 ve anti-CD56 antikorları (Tablo 1). Karanlıkta 4 ° C&#39;de 30 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> 1x PBS ile 2 kez yıkamadan sonra, hücreler, bir akış sitometrisi kullanılarak boya tamponu 500 ul analiz edilecektir. Desidual dokularda bulunan lökosit alt popülasyonları analiz etmek için kullanılan yolluk stratejisinin bir temsili Şekil 4&#39;de gösterilmektedir. </li></ol>

The authors disclose no conflicts of interest.

İnsan maternal-fetal arayüzünde lökositler infiltre fonksiyonel ve fenotipik özelliklerinin karakterizasyonu gebelik bozukluklarına sebep bağışıklık mekanizmalarının anlaşılması için gereklidir. Çeşitli teknikler gebelik 10,14,25,28,37,42,43 boyunca insan maternal-fetal arayüzünden lökositleri izole etmek için tarif edilmiştir. Bununla birlikte, bu tekniklerin her biri farklı olan, her zaman izole edilmiş hücrelerin canlılığını belirtmez, en önemlisi, enzim veya enzim kombinas...

Gebelik üç ayrı aşamadan immünolojik ile karakterize edilir: 1) implantasyon ve pro-enflamatuar yanıt ile ilişkili erken plasenta (yani, implantasyon, bir &#39;açık yara&#39; benzeyen); 2) ikinci trimester ve bağışıklık homeostazı maternal-fetal arayüzünde ağırlıklı anti-inflamatuar devlet yoluyla elde edilir gebeliğin üçüncü trimesterde en; ve 3) doğum, bir pro-inflamatuar durum 1-7. Bağışıklık hücreleri maternal-fetal arayüzünde inflamatuar yanıtın düzenlenmesinde önemli bir rol oynar nerede onların bereket ve gebelik süresince 6-9 yerelleştirme değişim. İnsanlarda, maternal-fetal arayüz anne (desidua) ve fetal (koryon veya trofoblast) dokular arasındaki doğrudan temas bir alanı temsil eder. 1) desidua hatları uterin kavite plasenta kapsamında değil parietalis ve yan yana olan: Bu arayüz içerirkoryon laeve için; ve 2) interstisyel trofoblastlar 10 (Şekil 1) tarafından işgal plasenta bazal plaka bulunan desidua basalis. temas bu alanların samimiyet maternal bağışıklık sistemi 11-13 fetal antijenik maruz kalma koşulları yaratır. Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, lökositlerin normal stromal tipi hücreler ve bez hücrelerinde 8,14,16 ilave olarak desidual hücrelerde 8,9,14,15% 30-40 kadar içermektedir. maternal-fetal arayüzünde lökositlerin rolü trofoblast invazyonu 17 sınırlandırılmasına spiral arterlerin 18,19 yenileme, anne hoşgörü 12,20 bakım ve emek 21-26 başlatılmasını dahil çoklu süreçleri kapsar. Uyarlanabilir ve örneğin, T hücreleri, makrofajlar, nötrofiller, B hücreleri, dendritik hücreler ve NK hücreleri, desidual dokularda tespit edilmiştir bağışıklık sistemi, doğuştan gelen uzuvlar, ve bunların her ikisinin de Lökositleroranlar ve aktivasyon durumu gebelik 6-10,12,14,24,27-30 boyunca mekansal ve zamansal olarak değişir gösterilmiştir. Lökosit nüfus ve / veya işlev tedirginlikler spontan abortus 31 preeklampsi 32, intrauterin gelişme geriliği 32,33 ve preterm eylem 7,24 ile ilişkilidir. Bu nedenle, insan maternal-fetal arayüzünde fenotipik özellikleri ve lökositlerin işlevselliği çalışma gebelik bozukluklarında disregüle immünolojik yolların açıklanmasını kolaylaştıracaktır. Birden parametrelerin eş zamanlı olarak 34-36 kantitatif analiz sağlar akım sitometri olan fenotip ve lökositlerin işlevsel özelliklerini belirlemek için kullanılan en güçlü araçlardan biri, teknoloji. Akış sitometrisi ile lökosit analiz etmek için, tek hücreli bir süspansiyon içinde lökositlerin izolasyonu gereklidir. Bu nedenle, bir yöntem, leu infiltre ayırmakmaternal-fetal arayüzden kocytes kendi fenotipik ve fonksiyonel özelliklerini incelemek için gereklidir. Çeşitli yöntemler, insan maternal-fetal arayüz 10,14,25,27,37-39 gelen lökositleri izole etmek için tarif edilmiştir. Bazı mekanik ayrıştırılmasına yönelik çabalara 10,25,27,38 geçerli olsa da, diğerleri doku ayrılma için enzimatik sindirimi 37,40 kullanın. Mekanik parçalanma daha düşük bir verim ve düşük canlılığı 41 ve canlılık ve hücre yüzeyi işaretleme tutma 42 etkileyebilir enzimatik dissosiasyonunu için, burada tarif edilen yöntem, hücre canlılığını tehlikeye atmadan izole lökositlerin verimini artırmak için enzimatik ön-muamele ile hafif mekanik bir ayrışma birleştirir. Yöntemlerin de benzer bir kombinasyonu maternal fetal arabirim 39 ile desidual dokulardan lökositlerin izolasyonu ile etkili olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, burada tarif edilen bir protokol mekanizmalarını içermektedirkarşıt neşter, tıraş bıçakları, veya cerrahi makas 10,28 geleneksel kıyma haline gelme işleminde göre zaman ve emek tasarrufu sağlarken tutarlılığını artırır otomatik doku dissociator ile nical parçalanma. Doku Ayrılma için seçilen enzim Accutase oldu. Yaygın olarak kullanılan kollajenaz 43 aksine 44 dispase ve tripsin 45 Accutase (hücre dekolmanı çözeltisi) genel proteolitik ve verimli henüz nazik ayrılma 46,47 katkıda kolajenolitik faaliyetleri hem birleştirir. Ayrıştırmadan sonra, lökosit yoğunluk gradyan santrifüjü ile desidual hücrelerin toplam popülasyonundan zenginleştirilmiştir. Çeşitli yoğunluk gradyan Ortam daha önce Percoll (koloidal silis taneciklerinin bir süspansiyon), 48 ve Ficoll (yüksek sentetik bir molekül ağırlığına sahip olan, sukrozun bir polimer) 49 En yaygın olanı, kullanılmıştır. sakaroz polimerin tarafından tecrit üstün verim onceki olmuşturusly 50 gösterilmektedir, ve burada daha fazla tarif protokolü bu yoğunluk gradyan ortam mononükleer lökositlerin yeterince yüksek saflığa ürettiğini kanıtlamaktadır. Bu nedenle, burada tarif edilen bir protokol, insan desidual dokularından lökosit izole etmek için bir yoğunluk gradyan ortam (1.077 + 0.001 gr / ml) ile otomatik bir doku aynştıncı, bir hücre ayırma çözeltisi ile enzimatik sindirme ve lökosit ayırma mekanik doku parçalanmalanna birleştirir. Bu protokol, hücre canlılığı ile birlikte hücre yüzey antijenlerini korumak için kanıtlanmıştır. İzole lökosit akış sitometrisi ve in vitro fonksiyonel çalışmalar ile immünofenotıpleme birden fazla uygulama için de kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Dissection&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers&amp;nbsp;</td><td>Any vendor</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>1X phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>(1X PBS)</td></tr><tr><td>Large and small Petri dishes</td><td>Any vendor</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Dissociation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td>(cell detachment solution)</td></tr><tr><td>Sterile 2 ml safe-lock conical tubes</td><td>Any vendor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical centrifuge tubes</td><td>Any vendor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;micro;m cell strainers</td><td>FALCON/Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>5 ml round bottom polystyrene test tubes</td><td>Any vendor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipettes</td><td>Any vendor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Cell Culture&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>RPMI culture medium 1640&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>22400-089</td><td>(1X) (10% FBS and 1% P/S)</td></tr><tr><td>Plastic chamber slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>177437</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermo Scientific Corporation</td><td>HEPA Class 100</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Fisher Scientific</td><td>ISOTEMP 110</td><td></td></tr><tr><td>Cell counter</td><td>Nexelcom</td><td>Cellometer Auto2000</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>Olympus CKX41</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Cell Separation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>MS columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Cell separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td></td></tr><tr><td>30 &amp;mu;m pre-separation filters</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-40</td><td></td></tr><tr><td>Multistand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>15 ml safe-lock conical tubes</td><td>Any Vendor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS buffer&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>(0.5% bovine serum albumin, 2 mM EDTA and 1X PBS)</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>FcR Blocking</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td>(Fc Block)</td></tr><tr><td>Anti-human cell surface antigen antibodies&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>(Table 1)</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD viability dye</td><td>BD Biosciences</td><td>564406</td><td></td></tr><tr><td>Lyse/Fix buffer&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>346202</td><td></td></tr><tr><td>FACS buffer&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>(0.1% BSA, 0.05% Sodium Azide, and 1X PBS, pH=7.4)</td></tr><tr><td>Staining buffer&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>554656</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue solution 0.4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250-011</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>20% density gradient media (1.077 + 0.001 g/ml)</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Additional Instruments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Incubator with shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>MAXQ 4450</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>LSR-Fortessa</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>SpinChron DLX</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum system</td><td>Any vendor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automatic tissue dissociator&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>gentleMACS Dissociator</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of leukocytes from the human maternal-fetal interface

Gebelik yeniden üretici dokularda ve maternal-fetal arayüzünde lökositlerin (Desidua basalis ve Desidua parietalis) infiltrasyonu ile karakterize edilir. Bu arayüz maternal ve fetal dokular arasındaki temas anatomik sitedir; bu nedenle, gebelik sırasında eylem bir immünolojik sitedir. Maternal-fetal arayüzünde infiltre lökositler teslimat merkezi implantasyon rol, gebelik bakımı ve zamanlama oynarlar. Bu nedenle, bu lökositlerin fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonu gebelik bozukluklarına sebep mekanizmalarına fikir verecektir. Birçok protokol Desidua basalis ve Desidua parietalis gelen lökositlerin infiltre izole etmek için de tarif edilmiştir; bununla birlikte inkübasyon, reaktifler, enzimler ve belirli bir süre içinde düzenli olmaması zor bu sonuçları karşılaştırma yapar. Burada tarif edilen yumuşak mekanik ve enzimatik diss kullanımını birleştiren yeni bir yaklaşımdırociation teknikleri maternal fetal ara yüzeyde insan dokularından izole edilen lökosit hücre dışı ve hücre içi işaretlerinin canlılığı ve bütünlüğünü korumak için. Kenara immünofenotiplendirme, hücre kültürü ve hücre sıralama gelen, bu protokolün gelecekteki uygulamaları çok sayıda ve çeşitlidir. Bu protokol, izole edilmiş DNA, lökosit nitro lökosit işlev (yani, fagositoz, sitotoksisite, T-hücresi çoğalması ve plastiklik, vs.) metilasyonu, hedef genlerin ekspresyonunu, ve reaktif oksijen türlerinin üretimini belirlemek için kullanılabilir maternal-fetal arayüzünde. Ayrıca, açıklanan protokolünü kullanarak, bu laboratuar maternal-fetal arayüzünde yeni ve nadir lökosit tanımlamak mümkün olmuştur.

. maternal fetal ara yüzeyde insan dokularıyla (Desidua basalis ve Desidua parietalis) disseksiyon Şekil 1 &#39;de gösterilen bu prosedür, Desidua basalis (- D Şekil 1 A) içeren taban plaka, diseksiyon içerir. Desidua basalis taban plakasına (Şekil 1C) plasental villi (fetal yan) çıkarılması ile elde edilir. Desidua parietalis yavaşça koryonik membran (Şekil 1E - F) kazınarak toplanır. 2 manyetik hüc...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface at JoVE.com

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

İnsan Maternal-Fetal Arabirimi lökosit İzolasyonu

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

isolation-of-leukocytes-from-the-human-maternal-fetal-interface

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.9K Görüntüleme.  NICHD/NIH/DHHS. Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis. 

Video: Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

Beyin-infiltre lökositler izolasyonu

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

İnsan Plasenta Doku türetilen İzolasyon ve mezenkimal kök Genişleme / Stromal hücreler

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Gelişim Biyolojisi

Neutrophil Isolation Protocol

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response. Due to their key role in inflammation, neutrophil functions such as locomotion, cytokine production, phagocytosis, and tumor cell combat are extensively studied. To characterize the specific functions of neutrophils, a clean, fast, and reliable method of separating them from other blood cells is desirable for in vitro studies, especially since neutrophils are short-lived and should be used within 2-4 hours of collection. Here, we demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media that is a mixture of sodium metrizoate and Dextran 500. The procedure consists of layering whole blood over the density gradient medium, centrifugation, separation of neutrophil layer, and lysis of residual erythrocytes. Cells are then washed, counted, and resuspended in buffer to desired concentration. When performed correctly, this method has been shown to yield samples of >95% neutrophils with >95% viability.

Neutrophils are among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response, and their functions and mechanisms have been studied extensively in vitro. We demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media.

Nötrofil İzolasyon Protokolü

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

Biyoloji

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of neutral lipids surrounded by a phospholipid monolayer. One of the most useful techniques in determining the cellular roles of droplets has been proteomic identification of bound proteins, which can be isolated along with the droplets. Here, two methods are described to isolate lipid droplets and their bound proteins from two wide-ranging eukaryotes: fission yeast and human placental villous cells. Although both techniques have differences, the main method - density gradient centrifugation -&#160;is shared by both preparations. This shows the wide applicability of the presented droplet isolation techniques.

In the first protocol, yeast cells are converted into spheroplasts by enzymatic digestion of their cell walls. The resulting spheroplasts are then gently lysed in a loose-fitting homogenizer. Ficoll is added to the lysate to provide a density gradient, and the mixture is centrifuged three times. After the first spin, the lipid droplets are localized to the white-colored floating layer of the centrifuge tubes along with the endoplasmic reticulum (ER), the plasma membrane, and vacuoles. Two subsequent spins are used to remove these other three organelles. The result is a layer that has only droplets and bound proteins.

In the second protocol, placental villous cells are isolated from human term placentas by enzymatic digestion with trypsin and DNase I. The cells are homogenized in a loose-fitting homogenizer. Low-speed and medium-speed centrifugation steps are used to remove unbroken cells, cellular debris, nuclei, and mitochondria. Sucrose is added to the homogenate to provide a density gradient and the mixture is centrifuged to separate the lipid droplets from the other cellular fractions.

The purity of the lipid droplets in both protocols is confirmed by Western Blot analysis. The droplet fractions from both preps are suitable for subsequent proteomic and lipidomic analysis.

Two techniques for isolating cellular lipid droplets from 1) yeast cells and 2) human placentas are presented. The centerpiece of both procedures is density gradient centrifugation, where the resulting floating layer containing the droplets can be readily visualized by eye, extracted, and quantified by Western Blot analysis for purity.

Hücresel Lipid damlacıklar İzolasyonu: Maya Hücreleri ve insan plasentası itibaren iki Arıtma Teknikleri

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

Biyomühendislik

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

Kordon Kanı gelen Prekürsör B-hücreli altkümeleri İzolasyonu

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Maternal Fetal Arayüz at Fare Dokular lökosit İzolasyonu

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

İnsan Plasental ve Desidual Organ Kültürleri Maternal-Fetal Arayüz de Enfeksiyonlar Eğitim için

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect of breast milk (BM). Unless access to clean water and appropriate infant formula is reliable, the WHO does not recommend cessation of breastfeeding for HIV-infected mothers. Numerous factors likely work in tandem to reduce BM transmission. Breastfed infants ingest ~105&#8722;108 maternal leukocytes daily, though what remains largely unclear is the contribution of these cells to the antiviral qualities of BM. Presently we aimed to isolate cells from human BM in order to measure antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP), one of the most essential and pervasive innate immune responses, by BM phagocytes against HIV targets. Cells were isolated from 5 human BM samples obtained at various stages of lactation. Isolation was carried out via gentle centrifugation followed by careful removal of milk fat and repeated washing of the cell pellet. Fluorescent beads coated with HIV envelope (Env) epitope were used as targets for analysis of ADCP. Cells were stained with the CD45 surface marker to identify leukocytes. It was found that ADCP activity was significant above control experiments and reproducibly measurable using an HIV-specific antibody 830A.

Breast milk transmits human immunodeficiency virus (HIV), though only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected. Breastfed infants ingest ~105&#8722;108 maternal leukocytes daily, though these cells are understudied. Here we describe the isolation of breast milk leukocytes and an analysis of their phagocytic capacity.

Hiv Hedeflerinin Antikorbağımlı Hücresel Fagositoz Sataşanında Kullanılmak Üzere İnsan Anne Sütünden Lökositlerin İzolasyon

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized stromal cells and immune cells, are responsible for the secretion of hormonal and inflammatory factors which are critical for successful blastocyst implantation, placental development and play a role in the initiation of labor at term and preterm. Many pregnancy complications can arise from perturbations of a fine balance of different cell populations comprising decidua. Alterations in the proportion of specific decidual cell types may disrupt these crucial processes and increase the risk of developing serious complications of pregnancy, such as embryo implantation failure, intrauterine growth restriction, preeclampsia and preterm labor. The protocol outlined here demonstrates a cost and time effective method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae. By combining enzymatic digestion and gentle mechanical disruption of the decidual tissue, a high yield of decidual cells was obtained with virtually no chorion contamination. Importantly, isolated decidual cells were characterized (stromal cells (55-60%), leukocytes (35%), epithelial (1%) or trophoblast (0.01%) cells) and maintained high viability (80%) which was confirmed by multicolor imaging flow cytometry assay. This protocol is specific to the decidua parietalis and can be adapted to first and second trimester placentae. Once isolated, decidual cells can be used for a multitude of experimental applications aiming to understand the role of different decidual cell sub-populations in pregnancy complications.

This protocol demonstrates a method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae which can be used for a variety of applications (i.e. immunocytochemistry, flow cytometry, etc.) aiming to study the role of different cell populations in pregnancy complications.

Dönem Placentae Fetal membranlar birincil insan Decidual hücre izolasyon

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

Tıp

Isolation of Uterine Innate Lymphoid Cells for Analysis by Flow Cytometry

Described here is a simple method to isolate and phenotype mouse group 1 uterine innate lymphoid cells (g1 uILCs) from individual pregnant uterus by flow cytometry. The protocol describes how to set up time mating to obtain multiple synchronous dams, the mechanical and enzymatic digestion of the pregnant uterus, the staining of single-cell suspensions, and a FACS strategy to phenotype and discriminate g1 uILCs. Although this method inevitably loses the spatial information of cellular distribution within the tissue, the protocol has been successfully applied to determine uILC heterogeneity, their response to maternal and foetal factors affecting pregnancy, their gene expression profile, and their functions.

This is a method to isolate uterine lymphoid cells from both pregnant and non-pregnant mice. This method can be used for multiple downstream applications such as FACS phenotyping, cell sorting, functional assays, RNA-seq, and proteomics. The protocol here demonstrates how to phenotype group 1 uterine innate lymphoid cells by flow cytometry.

Akış Sitometrisi ile Analiz için Uterus Doğuştan Gelen Lenfoid Hücrelerin İzolasyonu

Described here is a simple method to isolate and phenotype mouse group 1 uterine innate lymphoid cells (g1 uILCs) from individual pregnant uterus by flow ...