이 작품은 아동 건강 및 인간 발달의 유니스 케네디 슈라이버 국립 연구소, NIH / DHHS에 의해 지원되었다. 이 작품은 또한 모자, 주 산기 모자 건강에 웨인 주립 대학 주 산기 이니셔티브에 의해 부분적으로 지원되었다. 우리는 기꺼이 원고의 그녀의 중요한 측정 값에 대한 모린 McGerty (웨인 주립 대학)을 인정합니다.

이 프로토콜은 유동 세포 계측법에 의해 모두 면역을위한 준비에 탈락의 basalis과 탈락의 parietalis에서 백혈구 분리에 적합합니다. 또한, 분리 된 세포는 세포 분류, 세포 배양, RNA 분리 및 세포학에 사용될 수있다. 이 프로토콜에 언급 된 샘플 작업을 시작하기 전에, 인간의 윤리적 승인은 지역 연구 윤리위원회 및 기​​관 검토 보드에서 얻을 수 있어야합니다. 수집 및 연구 목적으로 인간의 샘플의 활용은 아동 보건 인간 개발 (NICHD)의 유니스 케네디 슈라이버 국립 연구소의 임상 시험 심사 보드, 건강 (NIH)의 국립 연구소, 보건 복지부 (DHHS에 의해 승인되었다 베데스다, 메릴랜드, 미국)와 웨인 주립 대학 (디트로이트, 미시간, 미국). 서면 동의서 전에 조직 샘플의 컬렉션에 모든 임산부로부터 얻은 것입니다. 참고 : 동물의 혈액, 세포, 또는 위험 작업하는 동안이 프로토콜에서 언급 한 바와 같이 OU에 에이전트, 그것은 적절한 바이오 안전성 및 실험실 안전 조치가 따라야하는 것이 필수적이다. 인간의 탈락 조직 1. 해부 주 : 기부 플레이트 아래 및 기부 태반에 부착되고 모체의 표면을 나타낸다. chorioamniotic 막은 양막과 융모막을 포함한다. 기초 판은 탈락의 basalis을 포함하고 융모막은 탈락의 parietalis (그림 1)을 포함한다. <ol><li> 탈락 Basalis <ol><li> 태반 (도 1a 및 1b) 중 하나 자엽으로부터 기부 판의 부분을 해부. </li><li> 위로 향 태반 융모와 멸균 커팅 보드에 배치합니다. 태반의 융모를 보여주는 측면은 일반적으로 모양 털이 조직과 피 묻은 빨간색입니다. 기초 판은 부드럽고 붉은 색 옅은입니다. </li><li> VILL을 제거하기 위해 날카로운, 미세 포인트 가위와 집게를 사용하여OU를 조직과 혈관. 프로세스 (그림 1C) 동안 (무료 - - 2+ 및 마그네슘 칼슘) 1X PBS에 담가 조직을 유지합니다. 이 조각의 3에 2를 수집하고 혈액 (그림 1D)를 제거하는 1X PBS로 철저히 씻어. </li></ol></li><li> 탈락 Parietalis <ol><li> chorioamniotic 세포막의 조각을 해부 (약 10cm는 10cm, 그림 1E을 X). 융모막이 위로 향하게하여 보드에 놓습니다. 융모막 쪽은 피의 응고를 포함하고 일반적으로 색에 노란 빛입니다. </li><li> 가능 (그림 1E)로 혈전의만큼을 제거하는 미세 포인트 집게를 사용합니다. 1X PBS 분명히 실행될 때까지 막에서 여분의 혈액을 청소하는 멸균 1X PBS에서 막을 씻어. </li><li> 부드럽게 막에서 탈락 층을 긁어 일회용 멸균 세포 스크레이퍼를 사용합니다. MEM에 멸균 1X PBS 적용brane이 과정 (그림 1 층)을 완료한다. 탈락 조직을 수집하고 멸균 1X PBS (그림 1G)와 50 ㎖의 플라스틱 튜브에 배치합니다. </li></ol></li></ol> 2. 기계 세분화 및 효소 소화 <ol><li> 50 ㎖의 플라스틱 튜브에 멸균 1X PBS로 (단계 1.1.3에서) 탈락의 basalis 해부 조직 또는 (단계 1.2.3에서) 탈락의 parietalis을 씻으십시오. 실온에서 5 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 조직의 알약을 수집합니다. </li><li> 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 조직 펠렛 위에있는 뜨는을 대기음. 참고 : 그들은 적혈구 포함되어 있기 때문에이 시점에서, 펠릿은 매우 느슨. 펠릿의 부피에 대해 또는 3 ㎖ 미만이면, 세포 분리 용액 6 ml를 37 ℃로 미리 가온에 펠렛을 재 - 보류. 펠릿을 3 ml의 용적보다 더 크다면, 더 많은 세포 분리 용액을 추가 (토륨의 약 2 배를 추가조직 샘플의 전자 볼륨). </li><li> C 튜브에 균질 조직 (탈락의 basalis + 세포 분리 솔루션 또는 탈락 parietalis + 세포 분리 솔루션)를 전송합니다. </li><li> 자동 dissociator에서 C 튜브를 삽입하고 해당 프로그램을 실행합니다. 참고 : 탈락의 basalis의 프로그램이 실행 당 668 총 라운드 17 초 동안 실행됩니다. 탈락의 parietalis의 프로그램이 실행 당 235 총 라운드 37 초 동안 실행됩니다. 이 프로그램은 탈락의 basalis 또는 좋은 수율 및 세포 생존과 탈락의 parietalis에서 백혈구를 분리 정의하고있다. </li><li> 이러한 accutase로서 시판 세포 분리 용액으로 조직 다이제스트, 조직의 세분화를 따라 기계적; 부드러운 교반과 함께 37 ℃에서 45 분 동안 (단백질 분해 및 collagenolytic 효소를 포함하는 칵테일). </li></ol> 백혈구 3. 분리 <ol><li> 인큐베이션 후, dige로 1X PBS 10 ㎖를 추가stion 혼합물과 50 ml의 플라스틱 튜브에 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 전달합니다. 소화 혼합물의 끈적 거림에 따라, 하나 하나의 혼합물에 대한 몇 가지 세포 여과기를 사용해야 할 수도 있습니다. </li><li> 실온에서 5 분 동안 300 XG에 1X PBS로 튜브와 원심 분리기를 입력합니다. 신중 세포 펠렛 위에 1X PBS를 제거하고 얼음처럼 차가운 FACS 완충액 5 mL를 펠릿을 다시 일시. 참고 : 6.1 단계로 이동, 함께 다형과 단핵 백혈구을 연구; 단핵 백혈구을 연구하기 위해, 3.3 단계로 진행합니다. </li><li> 15 ml의 플라스틱 튜브에 20 %의 5 ml의 밀도 구배 매체 (1.077 + 0.001 g / ㎖)를 첨가하고, 서서히 밀도 구배 매체의 상부에 세포 현탁액을 오버레이. 샘플 적층 동안, 세포 현탁액 밀도 구배 매체를 혼합하지 않는 것이 중요하다. </li><li> 브레이크없이 4 ℃에서 30 분 동안 500 XG에 스윙 아웃 로터와 원심 분리기. 그것은 세포와 L을 혼합 방지하기 위해 브레이크를 해제하는 것이 매우 중요합니다그라디언트입니다 osing. 백혈구 밀도 구배 매체 및 FACS 버퍼 사이의 계면에서 발견 될 것이다. </li><li> 피펫을 사용하여 매우 신중 외과 버퍼와 세포 파편을 포함하는 상위 계층을 제거합니다. 계면에서의 밴드는 탈락 단핵 세포와 다형 핵 백혈구의 일부를 포함하고 있습니다. </li><li> 새로운 15 ml의 플라스틱 튜브로 완전히 계면에 세포를 옮긴다. 외과 버퍼의 최소 3 배 이상의 볼륨을 추가합니다. </li><li> 세포 펠릿을 5 분 동안 300 XG 원심 분리기. 뜨는을 기음과 외과 버퍼로 세포를 씻어. RT에서 5 분 동안 300 XG에 다른 원심 분리하여 세포를 펠릿 화. 참고 : 6 단계를 참조하십시오, 모두 면역을 수행하려면 5 단계를 참조 셀 정렬을 수행하려면 4 단계를 참조 세포 배양을 수행 할 수 있습니다. </li></ol> 4. 응용 프로그램 - 세포 배양 <ol><li> USI 가능한 세포 개수를 RPMI 배지 1640 1 ㎖의 단계 3.7에서 세포를 다시 일시자동 세포 계수기 또는 혈구와 트리 판 블루 용액 0.4 %를 ng를. </li><li> 1 × 106 세포 / ml의 세포 농도를 만들기 위해 RPMI 배지의 양을 추가한다. 셀은 문화에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 5. 응용 프로그램 - 기본 세포 배양을위한 대 식세포의 분리 <ol><li> 자기 CD14 마이크로 비드 (107 세포 당 20 ㎕의 비드)와 단계 3.7에서 세포를 라벨, CD14 + 세포를 분리하기 위해, 15 4 ℃에서 min으로하고, 자장을인가하여 다른 유형의 세포에서 분리 된 CD14 + 세포를 배양한다. MACS 완충액 및 자계의 제거와 2 세척 후에, MACS 완충액 자기 유지 CD14 + 세포를 용출. </li><li> 원심 분리 후, 다시 정지 세포 도금 (그림 2)에 대한 준비가 RPMI 배지 1640에서 세포 펠렛을. </li></ol> 6. 응용 프로그램 - 모두 면역 <ol><li> immunophenot의 세포를 사용하려면yping, 1X PBS 1 ㎖의 단계 3.7에서 세포를 다시 일시. 자동 세포 계수기 또는 혈구와 트리 판 블루 용액 0.4 %를 사용하여 가능한 세포를 계산합니다. </li><li> 고칠 생존 염료 (그림 3)과 세포를 레이블. 외과 버퍼로 두 번 세포를 씻고 얼룩 버퍼에있는 세포를 다시 일시 중지합니다. 4 ° C에서 15 분 동안의 FcR 차단에 품어. </li><li> 형광 색소에 접합 세포 항체를 추가합니다. 예를 들어,이 프로토콜에서, 항 CD3을 사용, 항 CD19, 항 CD14, 항 CD15 그리고 항 CD56 항체 (표 1). 어둠 속에서 4 ℃에서 30 분 동안 품어. </li><li> 1X PBS 2 세척 후, 세포를 유동 세포 계측기를 사용하여 염색 완충액 500 μL를 분석한다. 탈락 조직에서 발견 백혈구 하위 집단을 분석하는 데 사용 게이팅 전략의 표현은도 4에 도시되어있다. </li></ol>

The authors disclose no conflicts of interest.

인간의 산모 - 태아 인터페이스에서 백혈구 침투의 기능 및 표현형 특성의 특성은 임신 장애로 이어질 면역 메커니즘의 이해에 필수적이다. 몇 가지 기술은 임신 10,14,25,28,37,42,43에 걸쳐 인간의 모체 - 태아 인터페이스로부터 백혈구를 분리하기 위해 설명되었다. 그러나, 이들 기술들의 각각은 별개 항상 분리 된 세포의 생존 능력을 지정하지 않고, 가장 중요한 것은, 효소 또는 효소 결합 ?...

임신은 세 가지 면역 학적 상 특징 : 1) 주입 및 프로 - 염증 반응과 관련된 초기 태반이 (즉, 주입은 &#39;열린 상처&#39;과 유사) 2) 두 번째 임신과 면역 항상성이 산모 - 태아 인터페이스에서 주로 항 염증 상태를 통해 달성 임신의 세 번째 임신의 대부분; 3) 분만, 염증성 상태 1-7. 면역 세포는 모체 - 태아의 계면에서 염증 반응을 조절하는데 중요한 역할을하는 곳들이 풍부 임신 6-9 걸쳐 파악 변화. 인간으로, 산모 - 태아 인터페이스는 모성 (탈락) 태아 (융모막 또는 영양막 세포) 조직 사이의 직접 접촉의 영역을 나타냅니다. 1) 탈락 선 자궁강이 태반에 포함하지 않는 것이 parietalis과 병렬 인 :이 인터페이스는 포함융모막의 laeve에; 2)이 침입 trophoblasts (10) (그림 1)에 의해 침략하는 태반의 기초 판에있는 탈락의 basalis. 접촉이 지역의 친밀감은 산모의 면역 체계 11-13에 태아 항원 노출에 대한 조건을 만듭니다. 당연히 백혈구 전형적인 기질 형 세포 및 세포 선의 8,14,16 이외에 탈락 세포 8,9,14,15 30-40 %까지 포함한다. 산모 - 태아 인터페이스에서 백혈구의 역할은 영양막 세포의 침윤 (17)의 제한, 나선형 동맥 (18, 19)의 리모델링, 어머니의 허용 오차 12, 20의 유지 보수 및 노동 21-26의 개시를 포함하는 여러 프로세스를 포함한다. 적응 및 즉, T 세포, 대 식세포, 호중구, B 세포, 수지상 세포 및 NK 세포, 탈락 막 조직에서 확인되었다 면역계의 타고난 사지, 그 양의 백혈구비율 및 활성화 상태는 임신 6-10,12,14,24,27-30 걸쳐 공간적 및 시간적으로 변화시키는 것으로 나타났다. 백혈구 인구 및 / 또는 기능의 교란은 자연 유산 (31), 자간전증 (32), 자궁 내 성장 제한 32, 33, 및 조산 7,24과 연결되어 있습니다. 따라서, 인간의 모체 - 태아의 계면에서의 표현형 특성과 백혈구의 기능에 대한 연구는 임신 장애의 조절 곤란 면역 학적 경로의 해명을 촉진 할 것이다. 여러 매개 변수를 동시에 34 ~ 36의 정량 분석을 할 수 있습니다 유동 세포 계측법 된 표현형과 백혈구의 기능적 특성을 결정하는 데 사용되는 가장 강력한 도구 중 하나, 기술. 유동 세포 계측법에 의한 백혈구를 분석하기 위해, 단일 세포 현탁액 내의 백혈구의 분리가 필요하다. 따라서, 방법은 레 침투 분리하는산모 - 태아 인터페이스에서 kocytes들은 표현형 및 기능적 특성을 연구하기 위해 필요합니다. 몇 가지 방법이 인간 모체 - 태아 인터페이스 10,14,25,27,37-39로부터 백혈구를 분리하는 기술되었다. 일부는 기계 세분화 10,25,27,38을 적용하는 동안, 다른 사람은 조직 분리에 대한 효소 소화 37,40를 사용합니다. 기계적인 세분화가 낮은 수율 및 감소 된 생존 41과 생존 세포 표면 마커 보유 42에 영향을 미칠 수있는 효소 적 분해를 생성하기 때문에, 본원에 기재된 방법은 세포 생존을 손상시키지 않고 절연 백혈구의 수율을 증가시키는 효소 전처리와 부드러운 기계적 해리를 결합한다. 방법의 유사한 조합이 모체 - 태아의 인터페이스 (39)에서 탈락 조직으로부터 백혈구 분리에 효과적인 것으로 입증되었다. 따라서, 본 명세서에 설명 된 프로토콜을 포함 메카반대 메스, 면도날, 또는 수술 가위 10,28 전통 닦지에 비해 시간과 노동을 절약하면서 일관성을 증가시키는 자동 조직 dissociator와 nical 세분화. 티슈 해리를 위해 선택된 효소 Accutase이었다. 일반적으로 사용되는 43 콜라게나 제와는 달리, 44 디스 파제, 트립신 45 Accutase (세포 분리 용액)을 일반적으로 단백질 가수 분해하고 효율적인 아직 부드러운 (46, 47)의 해리에 기여 collagenolytic 활동 모두를 결합한다. 분리 후, 백혈구는 밀도 구배 원심 분리에 의해 탈락 막 세포의 전체 인구에서 농축된다. 각종 밀도 구배 매체는 이전 퍼콜 (콜로 이달 실리카 입자의 현탁액) (48) 및 피콜 (합성 고 분자량의 중합체 자당) (49)이다 가장 일반적인 그중, 이용되어왔다. 크로스 폴리머에 의한 분리의 우수한 효율 previo있다usly 50를 도시하고, 본 명세서에서 더 설명 프로토콜이 밀도 구배 매체 단핵구의 충분히 높은 순도를 생산하고 있음을 증명한다. 따라서, 본원에 기재된 프로토콜은 인간 탈락 조직으로부터 백혈구를 분리하는 밀도 구배 매체 (1.077 + 0.001 g / mL)로 자동 티슈 dissociator, 세포 분리 용액과 소화 효소, 백혈구 분리하여 기계적 조직의 세분화를 결합한다. 이 프로토콜은 세포 생존과 함께 세포 표면 항원을 유지하는 입증되었다. 고립 된 백혈구는 유동 세포 계측법 및 체외에서 기능 연구와 면역 표현형을 포함 여러 애플리케이션에 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Dissection&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers&amp;nbsp;</td><td>Any vendor</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>1X phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>(1X PBS)</td></tr><tr><td>Large and small Petri dishes</td><td>Any vendor</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Dissociation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td>(cell detachment solution)</td></tr><tr><td>Sterile 2 ml safe-lock conical tubes</td><td>Any vendor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical centrifuge tubes</td><td>Any vendor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;micro;m cell strainers</td><td>FALCON/Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>5 ml round bottom polystyrene test tubes</td><td>Any vendor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipettes</td><td>Any vendor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Cell Culture&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>RPMI culture medium 1640&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>22400-089</td><td>(1X) (10% FBS and 1% P/S)</td></tr><tr><td>Plastic chamber slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>177437</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermo Scientific Corporation</td><td>HEPA Class 100</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Fisher Scientific</td><td>ISOTEMP 110</td><td></td></tr><tr><td>Cell counter</td><td>Nexelcom</td><td>Cellometer Auto2000</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>Olympus CKX41</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Cell Separation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>MS columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Cell separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td></td></tr><tr><td>30 &amp;mu;m pre-separation filters</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-40</td><td></td></tr><tr><td>Multistand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>15 ml safe-lock conical tubes</td><td>Any Vendor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS buffer&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>(0.5% bovine serum albumin, 2 mM EDTA and 1X PBS)</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>FcR Blocking</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td>(Fc Block)</td></tr><tr><td>Anti-human cell surface antigen antibodies&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>(Table 1)</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD viability dye</td><td>BD Biosciences</td><td>564406</td><td></td></tr><tr><td>Lyse/Fix buffer&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>346202</td><td></td></tr><tr><td>FACS buffer&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>(0.1% BSA, 0.05% Sodium Azide, and 1X PBS, pH=7.4)</td></tr><tr><td>Staining buffer&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>554656</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue solution 0.4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250-011</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>20% density gradient media (1.077 + 0.001 g/ml)</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Additional Instruments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Incubator with shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>MAXQ 4450</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>LSR-Fortessa</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>SpinChron DLX</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum system</td><td>Any vendor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automatic tissue dissociator&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>gentleMACS Dissociator</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of leukocytes from the human maternal-fetal interface

임신은 생식 조직과 모성 - 태아 인터페이스에서 백혈구 (탈락의 basalis과 탈락의 parietalis)의 침윤을 특징으로한다. 이 인터페이스는 산모와 태아 조직 사이의 접촉의 해부학 적 위치이다; 따라서, 임신 동안 작업의 면역 사이트이다. 산모 - 태아 인터페이스에서의 침투 백혈구는 전달의 중심 주입 역할, 임신의 유지 보수 및 타이밍을한다. 따라서 이러한 백혈구의 표현형 및 기능 특성화 임신 장애로 이어질 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 것입니다. 몇몇 프로토콜들은 탈락의 basalis 및 탈락의 parietalis로부터 백혈구 침윤 분리하기 위해 설명되었다; 그러나, 배양 시약, 효소, 및 시간에서의 일관성 결여 어려운 이들 결과를 비교한다. 본원에 기재된 부드러운 기계적 및 효소 DISS의 사용을 겸비한 신규 한 접근법ociation 기술 모체 - 태아의 계면에서의 인간 조직에서 분리 된 백혈구 세포 및 세포 마커의 생존과 무결성을 보존한다. 제외하고 모두 면역, 세포 배양, 세포 분류에서,이 프로토콜의 미래 응용 프로그램은 많고 다양하다. 이 프로토콜에 따라, 절연 백혈구 DNA를 시험 관내 백혈구 기능 (즉, 식세포 작용, 세포 독성 T 세포 증식 및 가소성 등)에 메틸화, 표적 유전자의 발현 및 활성 산소 종의 생성을 결정하는데 사용될 수있다 산모 - 태아 인터페이스에서. 또한, 설명 된 프로토콜을 사용하여,이 연구소는 산모 - 태아 인터페이스에서 새로운 희귀 백혈구를 설명 할 수있다.

. 산모 - 태아 인터페이스에서 인체 조직 (탈락의 basalis과 탈락의 parietalis)의 해부는 그림 1에 나타낸다이 절차는 탈락의 basalis (- D 그림 1A)를 포함하는 기초 판의 절개를 포함한다. 탈락 된 basalis는 기부 플레이트 (도 1C)에서 태반 융모 (태아 측)을 제거함으로써 얻어진다. 탈락의 parietalis 부드럽게 융모 막 (그림 1E - F)를 긁어에 의해 ?...

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Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

인간의 산모 - 태아 인터페이스에서 백혈구의 분리

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.9K 조회수.  NICHD/NIH/DHHS. Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis. 

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Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

브레인 - 침투 Leukocytes의 분리

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

인간 태반 조직에서 추출 분리 및 중간 엽 줄기의 확장 / 기질 세포

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

발생학

Neutrophil Isolation Protocol

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response. Due to their key role in inflammation, neutrophil functions such as locomotion, cytokine production, phagocytosis, and tumor cell combat are extensively studied. To characterize the specific functions of neutrophils, a clean, fast, and reliable method of separating them from other blood cells is desirable for in vitro studies, especially since neutrophils are short-lived and should be used within 2-4 hours of collection. Here, we demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media that is a mixture of sodium metrizoate and Dextran 500. The procedure consists of layering whole blood over the density gradient medium, centrifugation, separation of neutrophil layer, and lysis of residual erythrocytes. Cells are then washed, counted, and resuspended in buffer to desired concentration. When performed correctly, this method has been shown to yield samples of >95% neutrophils with >95% viability.

Neutrophils are among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response, and their functions and mechanisms have been studied extensively in vitro. We demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media.

호중구 격리 프로토콜

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

생물학

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of neutral lipids surrounded by a phospholipid monolayer. One of the most useful techniques in determining the cellular roles of droplets has been proteomic identification of bound proteins, which can be isolated along with the droplets. Here, two methods are described to isolate lipid droplets and their bound proteins from two wide-ranging eukaryotes: fission yeast and human placental villous cells. Although both techniques have differences, the main method - density gradient centrifugation -&#160;is shared by both preparations. This shows the wide applicability of the presented droplet isolation techniques.

In the first protocol, yeast cells are converted into spheroplasts by enzymatic digestion of their cell walls. The resulting spheroplasts are then gently lysed in a loose-fitting homogenizer. Ficoll is added to the lysate to provide a density gradient, and the mixture is centrifuged three times. After the first spin, the lipid droplets are localized to the white-colored floating layer of the centrifuge tubes along with the endoplasmic reticulum (ER), the plasma membrane, and vacuoles. Two subsequent spins are used to remove these other three organelles. The result is a layer that has only droplets and bound proteins.

In the second protocol, placental villous cells are isolated from human term placentas by enzymatic digestion with trypsin and DNase I. The cells are homogenized in a loose-fitting homogenizer. Low-speed and medium-speed centrifugation steps are used to remove unbroken cells, cellular debris, nuclei, and mitochondria. Sucrose is added to the homogenate to provide a density gradient and the mixture is centrifuged to separate the lipid droplets from the other cellular fractions.

The purity of the lipid droplets in both protocols is confirmed by Western Blot analysis. The droplet fractions from both preps are suitable for subsequent proteomic and lipidomic analysis.

Two techniques for isolating cellular lipid droplets from 1) yeast cells and 2) human placentas are presented. The centerpiece of both procedures is density gradient centrifugation, where the resulting floating layer containing the droplets can be readily visualized by eye, extracted, and quantified by Western Blot analysis for purity.

세포 지질 방울의 분리 : 효모 세포와 인간의 태반에서 시작 두 정화 기술

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

생체공학

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

탯줄 혈액에서 전구체 B-세포 하위 집합의 절연

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

산모 - 태아 인터페이스에서 쥐의 조직에서 백혈구의 분리

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

인간의 태반과 탈락 오르간 문화는 산모 - 태아 인터페이스에서 감염을 연구하는

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect of breast milk (BM). Unless access to clean water and appropriate infant formula is reliable, the WHO does not recommend cessation of breastfeeding for HIV-infected mothers. Numerous factors likely work in tandem to reduce BM transmission. Breastfed infants ingest ~105&#8722;108 maternal leukocytes daily, though what remains largely unclear is the contribution of these cells to the antiviral qualities of BM. Presently we aimed to isolate cells from human BM in order to measure antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP), one of the most essential and pervasive innate immune responses, by BM phagocytes against HIV targets. Cells were isolated from 5 human BM samples obtained at various stages of lactation. Isolation was carried out via gentle centrifugation followed by careful removal of milk fat and repeated washing of the cell pellet. Fluorescent beads coated with HIV envelope (Env) epitope were used as targets for analysis of ADCP. Cells were stained with the CD45 surface marker to identify leukocytes. It was found that ADCP activity was significant above control experiments and reproducibly measurable using an HIV-specific antibody 830A.

Breast milk transmits human immunodeficiency virus (HIV), though only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected. Breastfed infants ingest ~105&#8722;108 maternal leukocytes daily, though these cells are understudied. Here we describe the isolation of breast milk leukocytes and an analysis of their phagocytic capacity.

HIV 표적의 항체 의존적 세포 식세포 분석에서 사용하기 위해 인간 모유에서 백혈구의 분리

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized stromal cells and immune cells, are responsible for the secretion of hormonal and inflammatory factors which are critical for successful blastocyst implantation, placental development and play a role in the initiation of labor at term and preterm. Many pregnancy complications can arise from perturbations of a fine balance of different cell populations comprising decidua. Alterations in the proportion of specific decidual cell types may disrupt these crucial processes and increase the risk of developing serious complications of pregnancy, such as embryo implantation failure, intrauterine growth restriction, preeclampsia and preterm labor. The protocol outlined here demonstrates a cost and time effective method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae. By combining enzymatic digestion and gentle mechanical disruption of the decidual tissue, a high yield of decidual cells was obtained with virtually no chorion contamination. Importantly, isolated decidual cells were characterized (stromal cells (55-60%), leukocytes (35%), epithelial (1%) or trophoblast (0.01%) cells) and maintained high viability (80%) which was confirmed by multicolor imaging flow cytometry assay. This protocol is specific to the decidua parietalis and can be adapted to first and second trimester placentae. Once isolated, decidual cells can be used for a multitude of experimental applications aiming to understand the role of different decidual cell sub-populations in pregnancy complications.

This protocol demonstrates a method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae which can be used for a variety of applications (i.e. immunocytochemistry, flow cytometry, etc.) aiming to study the role of different cell populations in pregnancy complications.

기간 Placentae의 태아 세포 막에서 기본 인간 Decidual 세포의 고립

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

의학

Isolation of Uterine Innate Lymphoid Cells for Analysis by Flow Cytometry

Described here is a simple method to isolate and phenotype mouse group 1 uterine innate lymphoid cells (g1 uILCs) from individual pregnant uterus by flow cytometry. The protocol describes how to set up time mating to obtain multiple synchronous dams, the mechanical and enzymatic digestion of the pregnant uterus, the staining of single-cell suspensions, and a FACS strategy to phenotype and discriminate g1 uILCs. Although this method inevitably loses the spatial information of cellular distribution within the tissue, the protocol has been successfully applied to determine uILC heterogeneity, their response to maternal and foetal factors affecting pregnancy, their gene expression profile, and their functions.

This is a method to isolate uterine lymphoid cells from both pregnant and non-pregnant mice. This method can be used for multiple downstream applications such as FACS phenotyping, cell sorting, functional assays, RNA-seq, and proteomics. The protocol here demonstrates how to phenotype group 1 uterine innate lymphoid cells by flow cytometry.

유동 세포측정에 의한 분석을 위한 자궁 내 선천 림프구 세포의 격리

Described here is a simple method to isolate and phenotype mouse group 1 uterine innate lymphoid cells (g1 uILCs) from individual pregnant uterus by flow ...