Biz yardım için CIBIO (Trento Üniversitesi) ve CNR Nörobilim Enstitüsü idari personeline teşekkür etmek istiyorum. Giovanni Veronesi Provenzano Fondazione (Milan, İtalya) doktora sonrası bursu ile desteklenmektedir. Bu eser İtalyan Üniversitesi Bakanlığı ve Araştırma (PRIN 2008 hibe # YB ile 200894SYW2_002 ve PRIN 2010-2011 hibe # 2010N8PBAA_002), Trento Üniversitesi (YB için CIBIO start-up hibe) ve Telefon Kurumu (hibe # GGP13034 tarafından finanse edildi YB).

Tüm deneyler Avrupa Topluluğu Direktifi 2010/63 / AB ile uyumlu yapılmıştır ve İtalyan Sağlık Bakanlığı tarafından onaylanmıştır. 1. Hayvan Bakımı, Konut ve Tedavisi <ol><li> İlgili kurum hayvan bakım yönergelerine uygun olarak fareleri kullanarak tüm deneysel protokolleri gerçekleştirin. </li><li> Yiyecek ve su ad libitum ile 12 saat ışık / karanlık döngüsünde hayvanları korumak. </li><li> Ev talaş ve yatak malzemesi ile standart boyutlu polikarbonat fare kafeslerinde 2-4 gruplar, fareler haftada değişti. </li><li> Hastalığa yatkınlık nörogelişimsel bozuklukların farklı fare modellerinde yaş ve cinsiyet ile değişebilir, çünkü yaş ve cinsiyet uyumlu fareler kullanın. </li><li> Istatistiksel olarak anlamlı (davranışsal çalışma için genotip başına 10 fare ve immünohistokimya deney için genotip için 4 farelik bir minimum) ulaşmak için hayvan uygun sayıda seçin. </li></ol> 2. Morris Water Maze (MWM) <ol><li> Bir Genelge Tank (çapı 100 cm, yüksekliği 50 cm) kullanın. <ol><li> Tankın etrafına oda bölücüler bazı görsel ipuçları yerleştirin. </li><li> Dört hayali kadranın birinin merkezinde sabit bir yerde tankın içine 10 cm çapında bir platform yerleştirin. Tüm eğitim oturumlarında tüm çalışmalar için aynı kadranda gizli platformu tutun. </li><li> Platform su yüzeyinden 1 cm kadar musluk suyu ile havuz doldurun. Dengelenmesi su sıcaklığı 22 ° C&#39;ye yakın olmalıdır; Bu adımı birkaç saat sürebilir. Su sıcaklığını dengeye için gereken süreyi kısaltmak için, sıcak su eklenir. </li><li> Su opak hale getirmek için beyaz, toksik olmayan boya yaklaşık 1.5-2 L ekleyin. </li></ol></li><li> Parça Toplama İşlemi <ol><li> Standart CCD kamera ve video kurulları ile MWm adlı izleme sistemi kurun. Böyle yol uzunluğu gibi çeşitli değişkenler izlemek ve analiz etmek için bir video izleme sistemi seçin escape gecikme ve zaman her kadranda geçirdi. </li><li> Dört kadranda arenada bölün ve canlı izleme hayvanlar ve arka plan arasındaki optimum kontrast sağlamak için algılama ayarlarını. </li><li> Platform bölgeyi belirtin. </li><li> 60 sn maksimum deneme süresini ayarlayın. </li></ol></li><li> MWM Testi <ol><li> Davranış testleri öncesinde, farelere onlar havuz ya da mekansal ipuçları göremiyorum bir alanda 20-25 dakikalık bir adaptasyon dönemi sağlar. </li><li> (Aralarında 20-30 dk aralıklarla, günde iki ardışık denemeler) 9 gün boyunca her fare eğitin. </li><li> Bilgisayar ve fotoğraf makinesini açın ve video izleme sistemi yazılımını başlatmak. </li><li> Kendi kuyruğundan fare atın ve baş dört başlangıç ​​pozisyonları (kuzey, güney, doğu, batı) birinden başlayarak, havuz tarafına doğru işaret ile, suya koyun. Her fare için, başlama pozisyonu ve farklı çalışmalar boyunca pseudorandomized olmalıdır. </li><li> Fare yüzmek edelim ve platf arama60 saniyelik bir süre için biçiminde olabilecektir. Hayvan platformu ulaştığında, 20 saniye platformda kalmak için izin verir. </li><li> Fare bu süre içinde platformu bulmak için başarısız olursa, nazikçe kuyruğunu tutarak, platforma fare rehberlik ve 20 saniye boyunca orada kalmak için izin verin. Hayvan hepsi iki denemeler tamamlandıktan sonra, bir havlu ile kurulayın ve kafes içine geri koymak. </li><li> Eğitim süresinin her gün, aynı prosedürü (adımları 2.3.4-2.3.6) tekrarlayın. </li><li> Geçen eğitim iz gün sonra 9 prob testi yapın. </li><li> Havuzdan platformu çıkarın. </li><li> Fare yüzmek edelim ve 60 saniye maksimum platformu için arayın. </li><li> Periyodik olarak, aynı (22 ° C) olmalıdır, böylece su sıcaklığını kontrol edin ve havuz temizlemek. </li></ol></li></ol> Perfüze Animals Bölüm 3. hazırlanması <ol><li> MWM sonunda fareler kurban. Genotip başına dört fare euthaniz öncesinde anestezi gerekiryerel ve uluslararası kılavuzlara göre Ation. </li><li> (Kanama izin vermek için bir makas auriclewith doğru kesilir ve serpmek için sol ventrikül içine, bir kelebek kanül tanıtmak) transkardiyal hayvan serpmek 10-15 PBS içinde% 4 paraformaldehid, ardından fosfat tamponlu tuzlu su, 4-5 dakika boyunca (PBS) ile dk 22. </li><li> Inceleyin ve en az 12 saat süre ile 4 ° C &#39;de% 4 paraformaldehid içinde beyinleri sonrası sabitleyin. </li><li> Dilimleme için gerekli olana değin 4 ° C&#39;de 15 0.1 M PBS,% 0.02 sodyum azid ilave edildi ve deposu ihtiva eden 50 ml polistiren konik tüplerde beyinleri yerleştirin. </li><li> Kes ve vibratome kesme önce beyincik çıkarın. </li><li> Vibratome sahibi plaka üzerine, yapıştırıcı kullanarak, kesme site beyin dik Tutkal. </li><li> Uygun vibratome üzerine, dorsal hipokampusun boyunca seri sırayla, 20-40 mikron kalınlığında koronal bölüme beyin kesin. </li><li> Bir boya fırçası ile vibratome dilim toplayın ve 2 aktarmakHer bir kuyu için 0.1 M PBS içinde 1 ml ihtiva eden 4, çok-yuvalı plaka. </li><li> 4 ºC PBS içinde% 0.02 Sodyum Azid içinde PBS içinde kısa vadede veya uzun vadede mağaza bölümleri (doku kadar bir yıl süreyle kullanılmış olabilir). </li></ol> 4. İmmünhistokimya <ol><li> Aktarım her bir kuyu için, 0.1 M 500 ul PBS içeren 24 çok oyuklu bir plakaya her bir fare için 3-5 dorsal hipokamp bölümleri. </li><li> 0.1 M PBS içinde 500 ul (5 dakika, hafifçe çalkalanarak 3 kez) ile her yuva içinde yer alan bölümleri yıkayın. </li><li> Hafifçe çalkalama ile 20 dakika boyunca PBS içinde% 1 H2 O 2 bölümleri inkübe edilerek, bir endojen peroksidaz etkinliğini Quench. </li><li> Yumuşak çalkalama ile (3 x 5 dk) ile, 0.1 M PBS bölümleri yıkayın. </li><li> Doku geçirgenliği: PBS içinde% 0.2 Triton X-100, 5 dakika için bölümler inkübe edin. </li><li> Yukarıdaki adımlarda (4.4; 4.5) içinde, (numbe tüm deney için yeterli engelleme tamponu (PBS içinde% 10 keçi serumu ve% 0.1 Triton-X100) yapmakbölümlerin R x 100 ul x 3 adım). </li><li> Not: (biyotine konjüge edilmiştir), ikincil antikor yapıldığı aynı türden kullanımlar serumu. </li><li> Hafifçe çalkalama ile oda sıcaklığında (RT) 1 saat süre ile tampon (100 ul / bölümü) engelleme bölümleri inkübe edilerek spesifik olmayan antikorun bağlanmasını önler. </li><li> Hafifçe çalkalama ile, gece boyunca 4 ° C &#39;de, bloke edici tampon içinde seyreltilmiş primer Ab (pERK) bölümleri inkübe edin. </li><li> Yumuşak çalkalama ile (3 x 5 dk) ile, 0.1 M PBS bölümleri yıkayın. </li><li> Hafifçe çalkalama ile oda sıcaklığında 1 saat için (adım 4.6 de kullanılan aynı) blokaj tamponunda seyreltilmiş: biyotin (250 1) ile konjüge edilmiş sekonder Ab kuluçkalayın. </li><li> Avidin ve biyotin kompleksi, oda sıcaklığında en az 30 dakika gerektirir, çünkü, aynı zamanda, ABC reaktifi hazırlayın. </li><li> Üreticilerin protokole göre ABC reaktifi gerekli hacmi hazırlayın. </li><li> Yumuşak çalkalama ile (3 x 5 dk) ile, 0.1 M PBS bölümleri yıkayın. </li><li> IncubatABC reaktifi ile oda sıcaklığında 45 dakika boyunca E bölümleri. </li><li> Yumuşak çalkalama ile (3 x 5 dk) ile, 0.1 M PBS bölümleri yıkayın. </li><li> DAB çözümü çalışma hazırlayın DAB karsinojenik ve teratojenik olduğu gibi, DAB içeren her adımda davlumbaz yapılmalıdır. </li><li> Plastik bir transfer pipet yeni bir plaka DAB çözüm aktarın. </li><li> Elle çözüm ve yavaş yavaş girdap plaka çalışma DAB içeren plaka yerleştirin bölümleri, bölümlere maksimum etkiyi sağlamak için. </li><li> Yeterli sinyal gelişene kadar mikroskop DAB reaksiyonu (2-5 dk) izleyin. </li><li> 0.1 M PBS (3 x 5 dk) doku yıkanarak istenen renk yoğunluğuna reaksiyonu durdurun. </li><li> Gecede davlumbaz kalan DAB substrat solüsyonu devre dışı bırakmak ve laboratuvar kurallarına göre onu imha etmek için çamaşır suyu kullanın. </li><li> Jelatin Mount bölümler PBS yüzen slaytlar kaplı. Sonra oda sıcaklığı en az 3-4 saat sonra kurutun. </li><li> % 50 kısımları, kurutmak,% 70,% 95% 100 2 dakika her biri için etanol ve 5 dakika için% 100 ksilen açık ve. </li><li> Montaj orta kullanarak lamel ve gece boyunca kurumaya davlumbaz bırakın. </li></ol> 5. Hücre Sayısı <ol><li> Sayım pERK-pozitif hücreler, dorsal hipokamp seviyesinde 3-5 bölümler hayvan başına analiz edilmelidir. </li><li> Uygun bir mikroskop kullanılarak 200X büyütmede her bölüm birden fazla parlak alan görüntüler elde, ve daha sonra bir görüntü işleme yazılımı kullanarak bunları bir araya. </li><li> ImageJ özgür yazılım kullanarak tiff-dönüştürülmüş mozaik görüntülerde hücre sayımı gerçekleştirin. </li><li> 100 × 100 um her 2-3 sayma kutuları üzerinde hilus ve granül hücre tabakasında pERK lekeli hücreleri saymak. </li><li> Hücre yoğunlukları sayma penceresi (100 x 100 um) ortalama işaretli hücrelerin sayısı olarak ifade edilecektir. </li><li> Genotipleri arasında anlamlı farklılık değerlendirmek için istatistiksel analiz gerçekleştirin. Bu Öğrenci t yapılabilirTest veya ANOVA ticari yazılımları kullanarak uygun post hoc testi ile izledi. P &lt;0.05 Set istatistiksel anlamlılık düzeyi. </li></ol>

<ol>
	<li>Castren, E., Elgersma, Y., Maffei, L., Hagerman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+neurodevelopmental+disorders+in+adulthood.">Treatment of neurodevelopmental disorders in adulthood.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14074-14079 (2012).</li><li>Ehninger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+learning+deficits+in+a+Tsc2+/-+mouse+model+of+tuberous+sclerosis.">Reversal of learning deficits in a Tsc2+/- mouse model of tuberous sclerosis.</a> Nature medicine. 14, 843-848 (2008).</li><li>West, A. E., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity-regulated+gene+transcription+in+synapse+development+and+cognitive+function.">Neuronal activity-regulated gene transcription in synapse development and cognitive function.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).</li><li>Goorden, S. M., van Woerden, G. M., van der Weerd, L., Cheadle, J. P., Elgersma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+deficits+in+Tsc1+/-+mice+in+the+absence+of+cerebral+lesions+and+seizures.">Cognitive deficits in Tsc1+/- mice in the absence of cerebral lesions and seizures.</a> Annals of neurology. 62, 648-655 (2007).</li><li>Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibromin+regulation+of+ERK+signaling+modulates+GABA+release+and+learning.">Neurofibromin regulation of ERK signaling modulates GABA release and learning.</a> Cell. 135, 549-560 (2008).</li><li>Brielmaier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism-relevant+social+abnormalities+and+cognitive+deficits+in+engrailed-2+knockout+mice.">Autism-relevant social abnormalities and cognitive deficits in engrailed-2 knockout mice.</a> PloS one. 7, e40914 (2012).</li><li>Provenzano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+dysregulation+of+neurofibromin-dependent+pathways+is+associated+with+impaired+spatial+learning+in+engrailed+2+knock-out+mice.">Hippocampal dysregulation of neurofibromin-dependent pathways is associated with impaired spatial learning in engrailed 2 knock-out mice.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 13281-13288 (2014).</li><li>Morgan, J. I., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus-transcription+coupling+in+neurons:+role+of+cellular+immediate-early+genes.">Stimulus-transcription coupling in neurons: role of cellular immediate-early genes.</a> Trends in neurosciences. 12, 459-462 (1989).</li><li>Steward, O., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+at+synaptic+sites+on+dendrites.">Protein synthesis at synaptic sites on dendrites.</a> Annual review of neuroscience. 24, 299-325 (2001).</li><li>Gutmann, D. H., Parada, L. F., Silva, A. J., Ratner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibromatosis+type+1:+modeling+CNS+dysfunction.">Neurofibromatosis type 1: modeling CNS dysfunction.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14087-14093 (2012).</li><li>Costa, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+for+the+learning+deficits+in+a+mouse+model+of+neurofibromatosis+type+1.">Mechanism for the learning deficits in a mouse model of neurofibromatosis type 1.</a> Nature. 415, 526-530 (2002).</li><li>Silva, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+the+learning+and+memory+deficits+associated+with+neurofibromatosis+type.">A mouse model for the learning and memory deficits associated with neurofibromatosis type.</a> I. Nature. 15, 281-284 (1997).</li><li>Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Place+navigation+impaired+in+rats+with+hippocampal+lesions.">Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions.</a> Nature. 297, 681-683 (1982).</li><li>Praag, H., Kempermann, G., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Running+increases+cell+proliferation+and+neurogenesis+in+the+adult+mouse+dentate+gyrus.">Running increases cell proliferation and neurogenesis in the adult mouse dentate gyrus.</a> Nature. 2, 266-270 (1999).</li><li>Adams, J. P., Sweatt, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+psychology:+roles+for+the+ERK+MAP+kinase+cascade+in+memory.">Molecular psychology: roles for the ERK MAP kinase cascade in memory.</a> Annual review of pharmacology and toxicology. 42, 135-163 (2002).</li><li>Di Cristo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+ERK+activation+for+visual+cortical+plasticity.">Requirement of ERK activation for visual cortical plasticity.</a> Science. 292, 2337-2340 (2001).</li><li>Satoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERK2+contributes+to+the+control+of+social+behaviors+in+mice.">ERK2 contributes to the control of social behaviors in mice.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 11953-11967 (2011).</li><li>Sgado, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+GABAergic+neurons+in+the+hippocampus+and+cerebral+cortex+of+Engrailed-2+null+mutant+mice:+implications+for+autism+spectrum+disorders.">Loss of GABAergic neurons in the hippocampus and cerebral cortex of Engrailed-2 null mutant mice: implications for autism spectrum disorders.</a> Experimental neurology. 247, 496-505 (2013).</li><li>Sgado, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+in+engrailed-2+mutant+mice+reveals+common+molecular+pathways+associated+with+autism+spectrum+disorders.">Transcriptome profiling in engrailed-2 mutant mice reveals common molecular pathways associated with autism spectrum disorders.</a> Molecular autism. 4, 51 (2013).</li><li>Cheh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=En2+knockout+mice+display+neurobehavioral+and+neurochemical+alterations+relevant+to+autism+spectrum+disorder.">En2 knockout mice display neurobehavioral and neurochemical alterations relevant to autism spectrum disorder.</a> Brain research. 1116, 166-176 (2006).</li><li>Dawson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+broader+phenotype+of+autism:+genetic,+brain,+and+behavioral+perspectives.">Defining the broader phenotype of autism: genetic, brain, and behavioral perspectives.</a> Development and psychopathology. 14, 581-611 (2002).</li><li>Gage, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Maei, H. R., Zaslavsky, K., Teixeira, C. M., Frankland, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+Most+Sensitive+Measure+of+Water+Maze+Probe+Test+Performance.">What is the Most Sensitive Measure of Water Maze Probe Test Performance.</a> Frontiers in integrative neuroscience. 3, 4 (2009).</li><li>Guzowski, J. F., Setlow, B., Wagner, E. K., McGaugh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+gene+expression+in+the+rat+hippocampus+after+spatial+learning:+a+comparison+of+the+immediate-early+genes+Arc,+c-fos+and+zif268.">Experience-dependent gene expression in the rat hippocampus after spatial learning: a comparison of the immediate-early genes Arc, c-fos and zif268.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 5089-5098 (2001).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok

/ - - Fareler, nörogelişimsel bozuklukların fare modelini Burada, biz nöronal en2 içinde MWm aşağıdaki aktivasyon ifşa ettiği için bir pERK immünhistokimya protokol sağlar. / - - PERK düzeylerinin azalması en2 CA3 subfield tespit edilmiştir mutantlar WT ile karşılaştırıldığında. Farklı CA3 alt alanına, pERK pozitif nöronlarının genel bir artış gözlenen ne yerine iki hilus saptanmış ve EN2 bölgesinin GCL - / - fareler WT ile karşılaştırıldığında....

Nörogelişimsel bozukluklar gibi merkezi sinir sistemi (MSS) gelişmesi ve olgunlaşması sırasında erken rahatsız olduğu Down sendromu, frajil X sendromu (FXS), Rett sendromu, nörofibromatozis, yumrulu skleroz ve ASD gibi hastalıkların geniş ve heterojen bir grup içerir Prenatal dönem 1. Bu gelişimsel beyin işlev bozuklukları motor fonksiyon, dil, öğrenme ve bellek süreci üzerinde derin, yaşam boyu etkilere neden olabilir. Genetik ve çevresel faktörlerin bir bolluk son yıllarda 2,3 sırasında nörogelişimsel bozuklukların patogenezinde suçlanmıştır. Klinik fenotip altında yatan moleküler mekanizmalar halen bilinmemektedir bile, yukarıda belirtilen bulgular, bu hastalıkların birkaç fare modellerinin geliştirilmesi sağladı. Öğrenme ve hafıza noksanlıkları gibi +/- tsc1 +/-, TSC2 olarak, bu fare modellerinde bir dizi tespit edilmiştir,NF1 +/- ve En2 - / - fareler 2,4-7. Nörogelişimsel bozuklukların alanında önemli bir zorluk hücresel ve moleküler süreçler bellek yatan ve disfonksiyonu öğrenme belirlenmesidir. Öğrenme ve bellek sırasında aktive Seçilen sinyal yolları spesifik genlerin transkripsiyonunu neden ve sonuç olarak de novo protein sentezinin yol açabilir. Hemen-Erken genler, (bacakları) aktivasyonu ve protein bağımlı sinaptik değişiklikler hızla nöronal aktivite ve davranışsal eğitim 8,9 yanıt olarak beyin nöronlarının indüklenir. Nörofibromin içeren sinyal yolları içinde Açıkları nörogelişimsel bozukluklarda bozulmuş öğrenme ile ilişkili bulunmuştur. Nörofibromin olan mutasyon nörofibromatozis tip 1, karmaşık genetik sendrom sinir sistemi tümörleri, davranışsal ve motor gecikme ve bilişsel DISA ile karakterizedir neden olur NF1 geninin ürünüdürhastanın talimatları 10. Önleyici nöronlarla sınırlı NF1 silinmesi için heterozigoz olan fare, MWM 5,11,12 uzun süreli potansiyasyon erken faz (LTP), hem de tehlikeye uzamsal öğrenme eksiklikler göstermektedir. İlginç olarak, bu fare modelinde NF1 eksikliği artan ERK fosforilasyonu ve son olarak bu nöronların 5 GABA serbest anormal bir artışa yol açar, öğrenme sırasında inhibitör Ras sinyallemesinin bir aşırı aktivasyonuna yol açar. Bu bulgulara dayanarak, davranış görevler sonrasında nöronal aktivitenin görselleştirme nörogelişimsel hastalıklarda rol oynayan spesifik devreleri yeniden bir yol gösterir. Burada açıklanan immünohistokimyası protokolü değerlendirmek ve bilişsel bozukluklar ile ASD fare modelinde MWm aşağıdaki hipokampal ERK fosforilasyon düzeylerini ölçmek hedefliyor. MWM yaygın kemirgenler 13,14 hipokampal bağımlı uzaysal öğrenme ve hafıza araştırmak için kullanılır </s&gt; yedekleyin. Biz ERK öğrenme ve bellek oluşumu 15 önemli bir role sahip olduğu gösterilmiştir beri görev bağımlı hipokampal öğrenme moleküler okuma olarak ERK fosforilasyonu kullanmaya karar. Ayrıca, ERK yolu, geliştirme, görsel korteks 16 deneyime bağlı plastisite için gereklidir. Son olarak, MSS gösteride iki ERK izoformu (ERK2) birini eksik fareler ERK sinyal gibi ASD olarak nörogelişimsel bozuklukların patogenezinde kritik bir rol oynayabileceğini belirten, bilişsel, duygusal ve sosyal davranışlar 17 anomalileri kutladı. Nöro hastalıklar açısından bir model olarak farenin (- / - En2) Biz Engrailed 2 nakavt kullanılır. En2 - / - fareler ön beyin internöronlar 18 kaybı dahil anatomik ve davranışsal &quot;ASD gibi&quot; özellikleri, ASD-ilişkili genlerin 19 azaltılmış ifade göstermek, sosyallik azaldığı ve bozulmuş bilişsel esneklik 6,7,20. Mekansal Learning ve MWM tespit edilenler gibi hafıza kusurları, EN2 ​​özellikle sağlam - / - fareler 6,7 ve ASD hastalarında 21 gözlenen bilişsel bozukluklar ile ilgili olabilir. - / - Yetişkin farelerde 7 Ayrıca, MWM bozulmuş normal süreçlerde indirgenmiş nörofibromin ekspresyonu ile bağlantılı ve EN2 arasında hilusunda pERK düzeylerinde artış olduğunu göstermiştir. İşte biz bu ASD fare modelinde MWm aşağıdaki pERK immunohistokimyasal karakterizasyonu için ayrıntılı bir protokol mevcut.

<table><tbody><tr><td>EthoVision XT 8</td><td>Noldus Information Technology</td><td></td><td>This software platform is not a requirement &amp;ndash; there are many other behavioral softwares on the market.</td></tr><tr><td>Tempera Paint</td><td>Giotto - Fila Group Company</td><td></td><td>White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze.</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200</td><td>Equivalent models from other companies can be used.</td></tr><tr><td>24 well plate</td><td>Sigma</td><td>CLS3524</td><td></td></tr><tr><td>100% ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A406-20</td><td>Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting.</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>VWR</td><td>66004-950</td><td>Toxic - to be used under hood. Change xylene every month depending on use.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;S2002</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>Sigma</td><td>H1009-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Abcam</td><td>G9023-10ML</td><td></td></tr><tr><td>ABC kit Vectastain&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td>Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix.</td></tr><tr><td>DAB peroxidase substrate</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>Add in a volume of 5 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; and mix.</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>pERK antibody</td><td>Cell Signaling Technologies&amp;nbsp;</td><td>4370</td><td>Dilution 1:500</td></tr><tr><td>Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-1000&amp;nbsp;</td><td>Dilution 1:250</td></tr><tr><td>SuperFrost Slides&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>1879</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher</td><td>12-548-B</td><td></td></tr><tr><td>DPX</td><td>Sigma</td><td>317616</td><td>Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used.</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>&amp;nbsp;Zeiss&amp;nbsp;</td><td>Axio Imager.M2</td><td>Equivalent microscope can be used.</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe Systems, San Jose, CA</td><td></td><td>To assemble images.</td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td>Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>SigmaPlot 11.0</td><td>Systat Software Inc. (USA)</td><td></td><td>Equivalent softwares for statistical analysis can be used.</td></tr><tr><td>Prism 6</td><td>GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA)</td><td></td><td>Equivalent softwares for statistical analysis can be used.</td></tr></tbody></table>

immunohistochemical visualization of hippocampal neuron activity after spatial learning in a mouse model of neurodevelopmental disorders

Fosforile ekstraselüler regüle kinaz (pERK) uyarılması öğrenme bağımlı nöronal aktivasyon güvenilir bir moleküler okuma olduğunu. Burada, biz nörogelişimsel kökenli bilişsel bozuklukların ile karakterize bir fare modelinde bir mekansal öğrenme göreve maruz kaldıktan sonra hipokampal nöron aktivasyonu profilini incelemek için pERK immünhistokimya protokol açıklar. Fareler, otizm spektrum bozuklukları modeli (ASD) Özellikle, Morris su labirenti Engrailed-2 nakavt (MWM, klasik hipokampus bağımlı öğrenme görev) - (- / En2) aşağıdaki nöronal aktivasyon incelemek için pERK immün kullanılır. Vahşi tip (WT) kontrol ile karşılaştırıldığında, En2 - / - fareler MWM önemli uzamsal öğrenme yetersizlik göstermiştir. WT hayvanlara kıyasla, farelerin - / - MWM sonra, pERK pozitif nöronların sayısında anlamlı bir fark, belirli hipokampal EN2 bölgesinin alt alanlarında tespit edilmiştir. Böylece, bizim protokol sağlam farklılıkları tespit edebilirASD bir fare modelinde hipokampus bağımlı öğrenme bozukluğu ile ilişkili pERK-pozitif nöronlar. Daha genel olarak, protokol bilişsel bozukluklar ile karakterize edici özelliği, her iki genetik ya da farmakolojik fare modellerinde hipokampal nöron aktivasyon profilini araştırmak için uygulanabilir.

Burada açıklanan protokol imünohistokimya ile, görselleştirmek için tasarlanmıştır, nöro bozuklukların bir fare modelinde MWM sonra hipokampal nöron aktivitesi belirli bir markör ifade. Burada gösterilen tüm deneysel veriler bizim son işten 7 alınmıştır. Erkek ve kadın WT ve En2 - / - (3-5 aylık; ağırlık = 25-35 gr) yaştaki erişkin litermatlarının heterozigot çiftleşmelerin elde kullanılmıştır. Yirmi iki fareleri (genotip için 11) MWM kullanılmıştır. Sekiz fa...

Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders at JoVE.com

Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

Biz nörogelişimsel kökenli bilişsel bozuklukların ile karakterize bir fare modelinde bir mekansal öğrenme göreve maruz kaldıktan sonra hipokampal nöron aktivasyonu profilini incelemek için bir immünohistokimya protokol açıklar. Bu protokol bilişsel karakterize hem genetik ya da farmakolojik fare modellerine uygulanabilir.

Nörogelişimsel Bozukluklar Fare Modeli Mekansal Öğrenme ardından Hipokampal Nöron Faaliyet immünohistokimyasal Görselleştirme

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

immunohistochemical-visualization-hippocampal-neuron-activity-after

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.2K Görüntüleme.  University of Trento.  Biz nörogelişimsel kökenli bilişsel bozuklukların ile karakterize bir fare modelinde bir mekansal öğrenme göreve maruz kaldıktan sonra hipokampal nöron aktivasyonu profilini incelemek için bir immünohistokimya protokol açıklar. Bu protokol bilişsel karakterize hem genetik ya da farmakolojik fare modellerine uygulanabilir. 

Video: Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from subcellular to network levels and at temporal scales from milliseconds to weeks. In addition, two-photon imaging can be combined with a variety of behavioral tasks to explore the causal relationships between brain function and behavior. However, in mammals, limited penetration and scattering of light have limited two-photon intravital imaging mostly to superficial brain regions, thus precluding longitudinal investigation of deep-brain areas such as the hippocampus. The hippocampus is involved in spatial navigation and episodic memory and is a long-standing model used to study cellular as well as cognitive processes important for learning and recall, both in health and disease. Here, a preparation that enables chronic optical access to the dorsal hippocampus in living mice is detailed. This preparation can be combined with two-photon optical imaging at cellular and subcellular resolution in head fixed, anesthetized live mice over several weeks. These techniques enable repeated imaging of neuronal structure or activity-evoked plasticity in tens to hundreds of neurons in the dorsal hippocampal CA1. Furthermore, this chronic preparation can be used in combination with other techniques such as micro-endoscopy, head-mounted wide field microscopy or three-photon microscopy, thus greatly expanding the toolbox to study cellular and network processes involved in learning and memory.

This method describes a chronic preparation that allows optical access to the hippocampus of living mice. This preparation can be used to perform longitudinal optical imaging of neuronal structural plasticity and activity-evoked cellular plasticity over a period of several weeks.

Canlı fareler içinde dorsal hipokampal CA1 uzunlamasına Iki foton görüntüleme

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from ...

Davranış

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

Farelerde Hipokampal Bölgesi Dentate Gyrus dendritik arborization Değerlendirilmesi

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

Nörobilim

Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit functions in systems neuroscience. However, high absorbance and scattering of light in mammalian tissue limit intravital imaging mostly to superficial brain regions, leaving deep-brain areas, such as the hippocampus, out of reach for optical microscopy. In this video, we show the preparation and implantation of the custom-made imaging window to enable chronic in vivo imaging of the dorsal hippocampal CA1 region in head-fixed behaving mice. The custom-made window is supplemented with an infusion cannula that allows targeted delivery of viral vectors and drugs to the imaging area. By combining this preparation with wide-field imaging, we performed a long-term recording of neuronal activity using a fluorescent calcium indicator from large subsets of neurons in behaving mice over several weeks. We also demonstrated the applicability of this preparation for voltage imaging with single-spike resolution. High-performance genetically encoded indicators of neuronal activity and scientific CMOS cameras allowed the recurrent visualization of subcellular morphological details of single neurons at high temporal resolution. We also discuss the advantages and potential limitations of the described method and its compatibility with other imaging techniques.

This article demonstrates the preparation of a custom-made imaging window supplemented with infusion cannula and its implantation onto the CA1 region of the hippocampus in mice.

Behaving Farelerinin Hipokampusunda Nöronal Aktiviteleri Görselleştirmek için Kraniyotomi Prosedürü

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit ...

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal excitability. Recent studies have revealed the differential gene expression and functional heterogeneity of microglia in different brain regions. The unique functions of the hippocampal neural network in learning and memory may be associated with the active roles of microglia in synapse remodeling. However, inflammatory responses induced by surgical procedures have been problematic in the two-photon microscopic analysis of hippocampal microglia. Here, a method is presented that enables the chronic observation of microglia in all layers of the hippocampal CA1 through an imaging window. This method allows the analysis of morphological changes in microglial processes for more than 1 month. Long-term and high-resolution imaging of the resting microglia requires minimally invasive surgical procedures, appropriate objective lens selection, and optimized imaging techniques. The transient inflammatory response of hippocampal microglia may prevent imaging immediately after surgery, but the microglia restore their quiescent morphology within a few weeks. Furthermore, imaging neurons simultaneously with microglia allows us to analyze the interactions of multiple cell types in the hippocampus. This technique may provide essential information about microglial function in the hippocampus.

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

This paper describes a method for chronic in vivo observation of the resting microglia in the mouse hippocampal CA1 using precisely controlled surgery and two-photon microscopy.

İn Vivo Fare Hipokampüsünde Mikroglia'nın Kronik İki Foton Görüntülemesi

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal ...

Transplantation of Human Stem Cell-Derived GABAergic Neurons into the Early Postnatal Mouse Hippocampus to Mitigate Neurodevelopmental Disorders

A reduced number or dysfunction of inhibitory interneurons is a common contributor to neurodevelopmental disorders. Therefore, cell therapy using interneurons to replace or mitigate the effects of altered neuronal circuits is an attractive therapeutic avenue. To this end, more knowledge is needed about how human stem cell-derived GABAergic interneuron-like cells (hdINs) mature, integrate, and function over time in the host circuitry. Of particular importance in neurodevelopmental disorders is a better understanding of whether these processes in transplanted cells are affected by an evolving and maturing host brain. The present protocol describes a fast and highly efficient generation of hdINs from human embryonic stem cells based on the transgenic expression of the transcription factors Ascl1 and Dlx2. These neuronal precursors are transplanted unilaterally, after 7 days in vitro, to the hippocampus of neonatal 2-day-old mice. The transplanted neurons disperse in the ipsi- and contralateral hippocampus of a mouse model of cortical dysplasia-focal epilepsy syndrome and survive for up to 9 months after transplantation. This approach allows for investigating the cellular identity, integration, functionality, and therapeutic potential of transplanted interneurons over an extended time in developing healthy and diseased brains.

Transplantation of human pluripotent stem cell-derived GABAergic neurons generated by neuronal programming could be a potential treatment approach for neurodevelopmental disorders. This protocol describes the generation and transplantation of human stem cell-derived GABAergic neuronal precursors into the brains of neonatal mice, allowing long-term investigation of grafted neurons and evaluation of their therapeutic potential.

İnsan Kök Hücre Kaynaklı GABAerjik Nöronların Nörogelişimsel Bozuklukları Hafifletmek İçin Erken Postnatal Fare Hipokampüsüne Transplantasyonu

A reduced number or dysfunction of inhibitory interneurons is a common contributor to neurodevelopmental disorders. Therefore, cell therapy using ...

Imaging Hippocampal Neuronal Activation In Mouse Brain Sections

<a href='https://app.jove.com/v/52919/immunohistochemical-visualization-hippocampal-neuron-activity-after'>Source: Provenzano, G., et al.&#160;Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders. J. Vis. Exp.&#160;(2015)</a>This video demonstrates immunohistochemical imaging to visualize hippocampal neuronal activation. Stained brain sections reveal darker regions under a bright-field microscope, indicating activated neurons.

Source: Provenzano, G., et al.&#160;Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroimaging

Structural & Functional Brain Imaging

Fluorescence Immunostaining of Rat Hippocampal Neurons within a Microfluidic Chip

Source: Nagendran, T., et al., <a href="https://app.jove.com/v/58421">Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates immunofluorescence staining of rat hippocampal neurons cultured within a microfluidic chip to analyze neuronal maturation and connectivity.

Bir Mikroakışkan Çip İçinde Sıçan Hipokampal Nöronlarının Floresan İmmün Boyanması

1. Fluorescence Immunostaining within the Chip

	Prepare 4% formaldehyde fixation solution in PBS (4% formaldehyde, 1 &#181;M MgCl2, 0.1 &#181;m CaCl2, ...

Neuropathology

Trauma

Immunofluorescence Staining for Visualizing Proliferated Neural Stem Cells in Mouse Brain Sections

Source: Quintanilla, L. J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/59237">Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates the procedure for staining newly proliferated neural stem cells in brain tissue sections using EdU incorporation, followed by immunofluorescence to visualize specific proteins, enhancing the understanding of cell dynamics and proliferation.

Fare Beyin Bölümlerinde Prolifere Nöral Kök Hücreleri Görselleştirmek için İmmünofloresan Boyama

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Immunohistochemistry

	...

Developmental and Pediatric Disorders

Microscopic Analysis of Synapses in Mouse Hippocampal Slices Using Immunofluorescence

<a href='https://app.jove.com/v/56153/evaluation-of-synapse-density-in-hippocampal-rodent-brain-slices'>Source: McLeod, F., et al. Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices. J. Vis. Exp. (2017).</a>This video demonstrates a method for visualizing synaptic markers in hippocampal brain slices using confocal immunofluorescence analysis. The slices are immunostained with primary antibodies targeting presynaptic and postsynaptic markers, followed by fluorophore-conjugated secondary antibodies. The labeled markers are then visualized using confocal microscopy to evaluate the synaptic architecture through their colocalization.

Source: McLeod, F., et al. Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates a method for ...

Synaptic & Cellular Imaging

An Immunofluorescence Staining Technique to Detect Adult Hippocampal Neurogenesis

Source: Ansorg, A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52551">Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis.</a> J. Vis. Exp. (2015)
The video illustrates an immunofluorescence staining method used to examine neurogenesis in the adult hippocampus. Initially, a mouse brain section undergoes treatment with primary antibodies directed at marker proteins associated with neurogenesis in neuronal progenitor cells. Next, it is labeled with secondary antibodies tagged with fluorophores. The brain section is then observed under a confocal microscope to distinguish various subtypes of progenitor cells, based on the expression patterns of distinct combinations of marker proteins.

Erişkin Hipokampal Nörojenezi Tespit Etmek için Bir İmmünofloresan Boyama Tekniği

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. Tissue ...