Bu çalışma Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Ulusal Enstitüsü İntramural Araştırma Bölümü tarafından desteklenmiştir. Ek destek NIDCD 5R01 DC007613 tarafından sağlandı.

1. Kırbacık Diseksiyon ve Kültür <ol><li> Onaylanmış bir protokol ve başını kestirtmişti kullanarak bir yetişkin (4 yaş hafta veya daha eski) fare Euthanize. </li><li> Kafa her iki tarafında dış kulak snip ve burun doğru ileri cilt çekme. Arka cepheye kafası ikiye bölmek ve kemik labirenti ortaya çıkarmak için her iki tarafın beyin çıkarın. </li><li> Uzaklıkta kemik koklea gelen kafatası kesin ve bir mikroskop ile donatılmış bir doku kültürü kaput kemik labirenti (bül dahil) aktarmak (Not: Adenovirüs çalışma Sınıf II biyolojik güvenlik kabininde yapılmalıdır). </li><li> Kaputu, steril diseksiyon medya içeren bir 35mm doku kültürü çanak (M199, Gibco / Invitrogen # 12350) (Şekil 1A) her koklea aktarın. </li><li> Işitsel bül hala bozulmamış ise (bu bül ve tepe arasındaki küçük takarak brüt diseksiyonu sırasında bül çıkarmak mümkün değildirkoklea), bül (Şekil 1B) kırmak için (bir # 3 ve bir # 5) İki forseps kullanabilir. </li><li> Apeks, taban, kemikçikleri, oval ve yuvarlak pencereler, sekizinci sinir kökü, yarım daire kanalları (Şekil 1 C, D): kemik koklea hazırlık işaretlerini belirleyiniz. </li><li> Oval ve yuvarlak pencereler ve tepe çanağı ve sekizinci sinir kökü alt kısmında olduğu gibi yukarıya, yukarı bakacak medial yüzü çanak iç kulak yerleştirin. Semisirküler kanallar (Şekil 1D) bölgesinde bir # 3 forseps kullanarak hazırlık tutun. </li><li> Bir # 11 bıçak ile donatılmış bir neşter kullanarak, sinir kökü (Şekil 1D) sadece apikal koklea apeks kesti. </li><li> Kesilen kısmın yukarı bakacak şekilde hazırlanması çevirin. Hazırlanması (Şekil 1E) stabilize etmek için bir tutamak olarak ön semisirküler kanal kullanın. </li><li> # 5 forseps kullanarak aşağı modiolus de koklea çıkarıntabanına. Koklea kanca bölgenin aşağı döner noktada, Kesecik açığa kemik spiral lamina (Şekil 1F) son kemik rafa kaldırma (kırık # 55 forseps yarısı) ince bir sonda kullanın. Sadece kesecik altında önemli bir dönüm noktası olduğunu stapes ayak levhasının vardır. Kırbacık stapes ayak levhasının (Şekil 1 G) hemen bitişiğinde, ve kemik ile çevrelenmiştir. Uzağa kırbacık 1/3 &#39;ortaya çıkarmak için yeterli kemik çip için sonda kullanabilir. Dikkatle # 55 forseps (Şekil 1H) kullanarak kırbacık kaldırın. Kırbacık kemik hazırlanması çıkarılmış olarak, bu işlem, genellikle pigmentli çatı epitel çıkarılması ile sonuçlanacaktır. Kırbacık sağlam çatı epitel ile kaldırılır Ancak, çatı # 55 forseps kullanılarak kaldırılabilir. </li><li> Adenovirüs enfeksiyonu için Utricles (veya canlı görüntüleme deneyleri) diseksiyon (enfeksiyon öncesi) sırasında çıkarılan otokonin olmalıdır.Bu durumda, kesme ortam ile doldurulur ve küçük çaplı bir iğnenin (genellikle 26-28 ölçü) ile donatılmış bir döner kilit şırınga kullanabilir. # 55 forseps (Şekil 1I) kullanarak kenarında kırbacık tutun. Aşağı işaret iğne Fasetli kırbacık yakın iğne ucu getir. Medya otokonin (Şekil 1J) kapalı darbe diseksiyon akışı kullanın. Alternatif olarak, otokonin bir kirpik aracı (Ted Pella, Inc # 113) kullanarak onları fırçalama tarafından kaldırılabilir. Adenoviral enfeksiyonu geçirmesi gidiş değildir Utricles bozulmamış otokonin (kolaydır sonrası düzeltme otokonin kaldırılması için aşağıya bakınız) 24-iyi doku kültürü plakaları normalde serbest yüzen bir kültür vardır. </li><li> Tüm utricles disseke sonra, steril kültür ortamına diseksiyon ortamı değiştirmek: DMEM F12 (Gibco # 11320)% 5 FBS ve 50 U / ml penisilin G (Sigma) ile desteklenmiş. </li><li> Utricles 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 de kültüre edilir. Kültürler mainta olduğu yoksa48 saatten fazla için ined, kültür ortamı yarısı her gün değiştirilmesi gerekir. Kültürler bir hafta veya daha uzun süre muhafaza edilebilir. </li></ol> 2. Destekleme Hücre Adenovirüs Enfeksiyonu Önemli: adenovirüs Çalışma Biyolojik Güvenlik Seviye 2 (BSL2) prosedürleri ve sertifikasyon gerektirir. Rehberlik ve BSL2 usulleri hakkında eğitim için Kurumsal Biyogüvenlik görevlisi ile kontrol edin. <ol><li> (Bir serum) yukarıda diseksiyonu medya utricles parçalara ayır. Yukarıdaki gibi otokonin çıkarın. </li><li> Bulaştırmak için hazır olduğunuzda, her kuyuya 1 kesecik (kıl hücreleri kadar) aktarmak Nunc 15 uL serumsuz DMEM F12 (serum virüsü etkisiz hale getirebilir, çünkü bu önemlidir) içeren mini-tepsi (Fisher # 12-565-68) . Bu transfer bir 1.5 mm microcurette (# 10082-15 Güzel Bilim Araçlar) daha kolaydır. </li><li> Bizim Ad-GFP silinmiş viral E1 ve E3 genler ve transgresyon sürüş insan CMV organizatörü ile serotip 5&#39;tirene (GFP). Bu vektör virüsün Biolabs (Philadelphia, Pennsylvania elde edildi <a href="http://www.vectorbiolabs.com/">vectorbiolabs.com</a> ). Stok virüsler 1,0-4,0 x 10 10 PFU / mL titresi olarak verilmektedir. Iyi bir kesecik (Şekil 1L) içeren her stok virüs 0.5-2 ul ekleyin. Kullanılan gerçek miktar virüs ve stok titresi bağlı olarak değişir. Biz genellikle 1.0-4.0 × 10 7 PFU her kırbacık bulaştırabilir. </li><li> Kültür utricles virüs içeren 37 azından ortam ° C /% 5 2 saat boyunca CO 2. 2 saat sonra serum ile kültür ortamı içeren 24 kuyucuklu doku kültürü plakası geri utricles transfer. 37 ° C /% 5 CO2 &#39;de bir gece kültüre utricles. </li><li> Utricles canlı görüntüleme deneyleri için ertesi gün kullanılabilir, ya da (bkz. aşağıda) saç hücresi immünokimya için sabit olabilir. Transgen ekspresyonu 24 saat sonrası enfeksiyon düşük ise zamanla Viral transgen ekspresyonu artar, bu yüzden olabilirserumu içeren ortam içinde ek bir 24 saat kültüre hücreleri için yararlıdır. Eğer saç hücre toksisite görürseniz, kullanılan virüs miktarını azaltmak. </li></ol> 3. Kırbacık Fiksasyon, otokonin Kaldırma ve İmmünokimya <ol><li> Kültürü sürenin sonunda, oda sıcaklığında 3 saat ya için% 4 paraformaldehit in utricles sabitlemek (sallanan bir platform üzerine) ya da 4 ° C de bir gece boyunca 0.1 M (1X) Sorensen fosfat tampon pH 7.4 içinde yıkama utricles (3 defa, 15 dk). Bu adımda, bir 24-kuyucuklu doku kültürü plakası içinde gerçekleştirilir. </li><li> Otokonin kaldırma: Not: otokonin (adım yukarıda 1.11 bakınız) adenovirüs enfeksiyonu önce kaldırılması gerekir. Ancak, enfekte olmayan utricles hala bozulmamış otokonin ile kültüre ve düzeltilebilir. Bu durumda, tespit sonrasında otokonin kaldırmak için burada açıklanan adımları kullanın. Kalan pigmente çatı epiteli için utricles inceleyin. Dikkatle iki # 55 f kullanarak kalan çatı epitel kaldırmakorceps. Otokonin kaldırmak için, 750-1000 ul Cal-Ex decalcifier (Fisher # CS510-1D) ile Sorensen fosfat tamponu değiştirin. 1 dakika ve 40 saniye (2 dakikayı aşmayan) için utricles Cal-Ex bırakın. 0.1 M Sorensen fosfat tampon ve yıkama (5 kez, 5 dk) ile Cal-Ex değiştirin. </li><li> 10 dakika için sodyum borohidrid in utricles (Sigma # 452.882, deiyonize su içinde% 1) inkübe. 0.1 M Sorensen fosfat tamponu (5 kez, 5 dk) olarak utricles yıkayın. </li><li> Çözüm Engelleme yer utricles (PBS +% 2 sığır albümin serum +% 0.8 normal keçi serumu +% 0.4 Triton X-100) Sallanan bir platformda oda sıcaklığında 3 saat. </li><li> Primer antikor ekleyin ve 4 gece inkübe ° C Çözüm etiketleri tüm saç hücreleri bloke 1:100 de Anti-Myosin 7a (Proteus ya Biosciences Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası # 25-6790 veya # MYO7A 138-1). Ayrı striolar ve non-striolar saç hücreleri etiketlemek için, bir çift etiket protoco kullanmışve poliklonal anti-kalbindin (Chemicon # AB1778, Temecula, CA, USA; 1:200); monoklonal anti-kalmodulin (1:150 Sigma # C 3545) l. Sekonder antikor (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA, genellikle Alexa flor konjuge sekonder antikor) solüsyonu engelleme 1:500 seyreltilmiş ve bir sallama platforma oda sıcaklığında karanlık olarak 4 saat süreyle inkübe edilir. </li><li> Fluoromount-G (Güney Biotech, Birmingham, AL, ABD) kullanılarak cam slaytlar Mount utricles. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Bu yöntem kullanılarak tam muhafaza kültüre Utricles saç hücreleri ve destekleyici hücreleri (Şekil 2) her iki tamamlar. Sağlıklı kültürlerde Saç hücreleri 7a-pozitif miyozin olan ince sitoplazmik bölgeler ile çevrili yuvarlak nükleer profilleri gösterir (Şekil 2, üst panel). Yardımcı hücreleri (anti-Sox2 etiketli) daha küçük ve daha yoğun bir saç hücreleri (Şekil 2, alt panelini) &#39;den paketlenir. Adenovirus kırbacık in destek hücrelerin% 25-50 bozar ve herhangi bir saç hücreleri (Şekil 2, Reklam-GFP paneller) enfekte edilmiştir. Bu, viral titrenin çok yüksek ise, saç hücre ölümü mümkün olduğu için, her adenovirüs optimum çalışma titresi, deneysel olarak tespit edilmesi gerektiğini not edilmelidir. Ayrıca, mekanik hasar (diseksiyon sırasında oluşan) bölgelerinde virüs büyük miktarlarda alacak. Mekanik hasar bu bölgelerde GFP ve eksik saç hücrelerinin çok yüksek olan bir hücre sürekli çizgi ile kolayca ayırt edilebilir. Bu, bir hasar görmemiş kültürü hücre (Şekil 2) destek dağınık GFP tanımı aksine bulunmaktadır. <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1.. Diseksiyon kesecik. A:. İşitsel bül (AB) B:. Bül iki sağlam forcepsi bozuldu C: Kemikli koklea (RW = yuvarlak pencere, S =. stapedial arter, C = koklea, ST = stapes) D:.. bir neşter bıçak (SB), sekizinci kranial sinir (8. N) ASC = ön semisirküler kanal E apikal koklea apeks kesmek için kullanılır: hazırlık dıştaki kemik (oklar) ön semisirküler kanalın (ASC) ve diğer takılı bir çatal ile bir # 3 forseps kullanarak sıkıca tutulur. Membranöz labirent forseps kullanılarak kaldırılır F:. Membranöz labirent kaldırıldı ile kemik spiral lamina bazal kıvrımı kanca bölgeye yakın görünür. Ince prob rafa kaldırın ve (ok) kaldırmak için bu kemik raf altına sokulur G:. Kesecik çıkarıldıktan sonra, kesecik (U) stapes ayak levhasının (SF) hemen bitişiğinde görünür H:. Kesecik (U ) bir # 55 pens (ok) kullanılarak kaldırılır SF = stapes ayak levhasının I:.. otokonin ile kesecik (O) kısmen kaldırılmış bird duyusal epitel (SE) görünür altında J:. otokonin (O), 26-gauge iğne ile donatılmış bir şırınga tarafından teslim medya akışı kullanarak kırbacık kaldırılır. Iğne (S) gölge görüntünün altındaki görünür K:.. Adenoviral enfeksiyonu: kırbacık otokonin kaldırılır ve duyusal epitel (SE) görünür L her kesecik (U) bir mini iyi bir birey yerleştirilir tepsisi. Yardımcı hücreler de (P = pipetleyin ucu) içine virüs pipetleme tarafından adenovirüs ile enfekte olmaktadır. <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2. Hücreleri destekleyici Adenovirüs aracılı enfeksiyon. Utricles yeşil floresan protein adenovirüs sürüş ifade (Ad-GFP) ile enfekte edildi. Saç hücre tabakası ve bir kırbacık aynı bölgede destekleyici hücre tabakası konfokal görüntüleri gösterilmektedir vardır. Saç hücreleri Myosin 7a karşı bir antikor ile etiketlenir(Eflatun). Yardımcı hücreler Sox2 (kırmızı) karşı bir antikor ile etiketlenir. Şematik kırbacık duyu epitel ve saç hücrelerinin yerleri (HC) ve destek hücreleri (SC) yapısını göstermektedir. (U) üst ve alt gösterildiği konfokal (optik) bölümler yerleri (L) paneller şematik kesikli çizgiler ile gösterilmiştir. Üst paneller: saç hücre çekirdeklerinin düzeyinde alınan konfokal görüntüleri, Ad-GFP sinyali saç hücreleri arasındaki boşlukları görünür ve saç hücre belirteci Myosin 7a ile örtüşmeyen. Alt paneller: destekleyici hücre çekirdeklerin seviyesinde konfokal bölümleri, AD-GFP sinyali destekleyici hücre işaretleyici Sox-2 ile colocalizes. Sadece hücreleri destekleyici GFP ve hiç saç hücrelerinde Ad-GFP enfeksiyonu sonuçları enfekte olmaktadır. <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3. Adenoviral enfeksiyonu saç hücreleri veya destekleyici hücrelerin ölümüne yol açmaz. Utricles 4 × 10 8 PFU / ml Ad-GFP ile enfekte edildi. Utricles Myosin 7a (saç hücre belirteci) ve Sox2 (hücre belirteci destekleyici) karşı antikorlar ile işaretlendi. Saç hücre ve destekleyici hücre sayımı kontrolü utricles ve Ad-GFP enfekte utricles eşit idi.

<ol>
	<li>Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+mouse+utricle+as+an+in+vitro+preparation+for+studies+of+ototoxic-drug-induced+sensory+hair+cell+death.">The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death.</a> Brain Res. , (2006).</li><li>Schmitt, N. C., Rubel, E. W., Nathanson, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-induced+hair+cell+death+requires+STAT1+and+is+attenuated+by+epigallocatechin+gallate.">Cisplatin-induced hair cell death requires STAT1 and is attenuated by epigallocatechin gallate.</a> J. Neurosci. 29, 3843-3851 (2009).</li><li>Ou, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FDA-approved+drugs+and+bioactives+that+protect+hair+cells+in+the+zebrafish+(Danio+rerio)+lateral+line+and+mouse+(Mus+musculus)+utricle.">Identification of FDA-approved drugs and bioactives that protect hair cells in the zebrafish (Danio rerio) lateral line and mouse (Mus musculus) utricle.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 10, 191-203 (2009).</li><li>Chiu, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+zebrafish+lateral+line+to+screen+for+ototoxicity.">Using the zebrafish lateral line to screen for ototoxicity.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 178-190 (2008).</li><li>Sugahara, K., Rubel, E. W., Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JNK+signaling+in+neomycin-induced+vestibular+hair+cell+death.">JNK signaling in neomycin-induced vestibular hair cell death.</a> Hear Res. , 221-221 (2006).</li><li>Matsui, J. I., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+hair+cell+death+and+regeneration:+two+halves+of+the+same+equation.">Sensory hair cell death and regeneration: two halves of the same equation.</a> Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 12, 418-4125 (2004).</li><li>Ryals, B. M., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+regeneration+after+acoustic+trauma+in+adult+Coturnix+quail.">Hair cell regeneration after acoustic trauma in adult Coturnix quail.</a> Science. 240, 1774-176 (1988).</li><li>Corwin, J. T., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+sensory+hair+cells+after+acoustic+trauma.">Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma.</a> Science. 240, 1772-174 (1988).</li><li>Shang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supporting+cell+division+is+not+required+for+regeneration+of+auditory+hair+cells+after+ototoxic+injury+in+vitro.">Supporting cell division is not required for regeneration of auditory hair cells after ototoxic injury in vitro.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11, 203-222 (2010).</li><li>Stone, J. S., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+regeneration+in+the+avian+auditory+epithelium.">Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium.</a> Int. J. Dev. Biol. 51, 6-7 (2007).</li><li>Lahne, M., Gale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damage-induced+activation+of+ERK1/2+in+cochlear+supporting+cells+is+a+hair+cell+death-promoting+signal+that+depends+on+extracellular+ATP+and+calcium.">Damage-induced activation of ERK1/2 in cochlear supporting cells is a hair cell death-promoting signal that depends on extracellular ATP and calcium.</a> J. Neurosci. 28, 4918-4928 (2008).</li><li>Cunningham, L. L., Cheng, A. G., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+Activation+in+Hair+Cells+of+the+Mouse+Utricle+Exposed+to+Neomycin.">Caspase Activation in Hair Cells of the Mouse Utricle Exposed to Neomycin.</a> Journal of Neuroscience. 22, 8532-8540 (2002).</li><li>Matsui, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+inhibitors+promote+vestibular+hair+cell+survival+and+function+after+aminoglycoside+treatment+in+vivo.">Caspase inhibitors promote vestibular hair cell survival and function after aminoglycoside treatment in vivo.</a> J. Neurosci. 23, 6111-6122 (2003).</li><li>Matsui, J. I., Ogilvie, J. M., Warchol, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+caspases+prevents+ototoxic+and+ongoing+hair+cell+death.">Inhibition of caspases prevents ototoxic and ongoing hair cell death.</a> J. Neurosci. 22, 1218-1227 (2002).</li><li>Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+technique+for+inducing+local+inner+ear+damage.">A novel technique for inducing local inner ear damage.</a> Hear Res. 176, 1-2 (2003).</li><li>Forge, A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+death+of+hair+cells+in+mammalian+vestibular+sensory+epithelia.">Apoptotic death of hair cells in mammalian vestibular sensory epithelia.</a> Hear Res. 139, 1-2 (2000).</li><li>Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+inhibitors+prevent+cisplatin-induced+apoptosis+of+auditory+sensory+cells.">Caspase inhibitors prevent cisplatin-induced apoptosis of auditory sensory cells.</a> Neuroreport. 9, 2609-2614 (1998).</li><li>Taleb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+inhibits+aminoglycoside-induced+hearing+loss+and+cochlear+hair+cell+death.">Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hearing loss and cochlear hair cell death.</a> Cell Stress Chaperones. 14, 427-437 (2009).</li><li>Taleb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+inhibits+aminoglycoside-induced+hair+cell+death+and+is+necessary+for+the+protective+effect+of+heat+shock.">Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hair cell death and is necessary for the protective effect of heat shock.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 277-289 (2008).</li><li>Francis, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celastrol+Inhibits+Aminoglycoside-Induced+Ototoxicity+via+Heat+Shock+Protein+32+(HSP32).">Celastrol Inhibits Aminoglycoside-Induced Ototoxicity via Heat Shock Protein 32 (HSP32).</a> Cell Death and Disease. , (2011).</li><li>Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+inhibitors,+but+not+c-Jun+NH2-terminal+kinase+inhibitor+treatment,+prevent+cisplatin-induced+hearing+loss.">Caspase inhibitors, but not c-Jun NH2-terminal kinase inhibitor treatment, prevent cisplatin-induced hearing loss.</a> Cancer Res. 64, 9217-9224 (2004).</li><li>Bird, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supporting+cells+eliminate+dying+sensory+hair+cells+to+maintain+epithelial+integrity+in+the+avian+inner+ear.">Supporting cells eliminate dying sensory hair cells to maintain epithelial integrity in the avian inner ear.</a> J. Neurosci. 30, 12545-12556 (2010).</li><li>Sato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+fractalkine+receptor+CX3CR1+on+cochlear+macrophages+influences+survival+of+hair+cells+following+ototoxic+injury.">Expression of fractalkine receptor CX3CR1 on cochlear macrophages influences survival of hair cells following ototoxic injury.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11, 223-234 (2010).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Duyusal saç hücreleri yaşlanma, gürültü travma ve aminoglikozid antibiyotikler ve antineoplastik sisplatin içeren ototoksik ilaçlar, maruz kalma dahil stresler, çeşitli kaynaklanan ölüm duyarlıdır. Kalıcı işitme kaybı ve / veya denge bozukluğu memeliler saç hücre ölümü sonuçlarında. In vitro model sistemlerde hücresel ve moleküler mekanizmalar yatan saçları hücre ölümü yanı sıra saç hücre ölümü önlemek veya tersine çevirmeyi amaçlayan bu belirlenmesine yönel...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/3734">Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection</a>. There was an error with a figure, the authors middle names were omitted, and the acknowledgements were updated.

Erratum: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Reaktif</strong</td&gt;<td<strong&gt; Şirket</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalog numarası</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Orta 199</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 12350</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM/F12</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11320</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Güzel forseps (# 55)</td&gt;<td&gt; Güzel Bilim Araçları</td&gt;<td&gt; 11.255-20</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Güzel forseps (# 5)</td&gt;<td&gt; Güzel Bilim Araçları</td&gt;<td&gt; 11.252-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Forseps (# 3)</td&gt;<td&gt; Güzel Bilim Araçları</td&gt;<td&gt; 11.231-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Penisilin G</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P3032</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fetal sığır serumu</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 10082-139</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nunc mini tepsisi</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; 12-565-68</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Adenovirüs-GFP</td&gt;<td&gt; Vector Biolabs</td&gt;<td&gt; 1060 *</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cal-Ex decalcifier</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; CS510-1D</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sodyum borohidrid</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; 452.882</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-Myosin 7a (poliklonal)</td&gt;<td&gt; Proteus Biosciences</td&gt;<td&gt; 25-6790</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-Myosin 7a (monoklonal)</td&gt;<td&gt; Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası</td&gt;<td&gt; MYO7A 138-1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-Kalmodulin</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; C 3545</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-Calbindin</td&gt;<td&gt; Chemicon</td&gt;<td&gt; AB1778</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fluoromount G</td&gt;<td&gt; Güney Biyoteknoloji Associates</td&gt;<td&gt; 0100-01</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; Tablo 1</strong&gt;. Kırbacık kültür ve adenovirüs enfeksiyonu kullanılan reaktifler ve araçlar.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; * Not: Ad-GFP normalde 1x10 bir stok titrede vektör Biolabs tarafından sağlanmaktadır<sup&gt; 10</sup&gt; PFU / ml. Biz, 1.2 x 10 bir titrede stok virüsü sağlamak amacıyla, özel bir amplifikasyon talep<sup&gt; 11</sup&gt; PFU / ml.</p&gt;

dissection of adult mouse utricle and adenovirus-mediated supporting-cell infection

İşitme kaybı ve denge bozuklukları genellikle iç kulağın reseptör hücreler mechanosensory saç hücrelerinin ölümüne neden olur. Tatmin edici bir memeli saç hücrelerinin temsil hiçbir hücre hattı olmadığı için, saç hücreleri üzerinde araştırma birincil organ kültürleri dayanır. Yetişkin fareleri (Şekil 1) 1-6 arası utricles organ kültürü kullanan saç olgun memeli hücrelerine in vitro model sisteminde en karakterize edilmektedir. Kırbacık bir vestibuler organ ve kırbacık bir saç hücreleri işitsel organ, Corti organda saç hücreleri için yapıyı ve işlevi iki benzerdir. Yetişkin fare kırbacık hazırlık yaşam, homeostasis, ve bu hücrelerin ölümüne düzenleyen moleküler sinyallerin çalışmaları için olgun bir duyu epiteli temsil eder. Memeli koklear saçlı hücreler ölümcül farklılaştığı ve kayboldukları zaman yeniden değildir. Non-mam olarakmemeli omurgalılar, işitsel ve vestibüler saç hücre ölümü işitme ve denge fonksiyonları 7, 8 geri sağlam rejenerasyon tarafından takip edilir. Saç hücre rejenerasyon duyu epitel 9, 10, saç hücrelerinin bazolateral yüzeylerine temas glia benzeri destekleyici hücreleri, aracılık eder. Yardımcı hücreler de saç hücre yaşam ve ölüm 11 önemli moleküllerdir. Yakın zamanda adenovirüs kullanılarak kültüre utricles hücreleri destekleme enfeksiyonu için bir teknik geliştirilmiştir. CMV arttırıcının kontrolü altında GFP içeren bir transgen sağlamak için adenovirüs tip 5 (dE1/E3) kullanılarak, özel olarak bu adenovirüs bulur ve verimli bir şekilde desteklemek hücreleri enfekte. Hücre enfeksiyonu verim destekleyici yaklaşık% 25-50 olduğu, ve saç hücreleri (Şekil 2) enfekte değildir. Daha da önemlisi, biz hücreleri destekleyici adenoviral enfeksiyonu saç hücreleri veya destekleyici hücrelere toksisite yol açmaz bulmak gibi Ad-GFP inf hücre sayılarıSeniyye utricles non-enfekte utricles (Şekil 3) bu eşdeğerdir. Böylece kültür utricles hücreleri desteklemek adenovirüs aracılı gen saç hücre yaşam, ölüm ve yenilenme arabulucular olarak hücreleri destekleyici rollerini incelemek için güçlü bir araç sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection at JoVE.com

Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

Mechanosensory saç hücreleri iç kulak reseptör hücrelerdir. En-karakterize<em&gt; In vitro</emOlgun memeli saç hücrelerinin&gt; model sistem yetişkin farelerin utricles organ kültürleri kullanır. Biz yetişkin fare kırbacık diseksiyonu mevcut ve biz kültürlü utricles hücreleri destekleyici adenovirüs aracılı enfeksiyonu gösterir.

Yetişkin Fare kesecik ve Adenovirüs aracılı Yardımcı hücre Enfeksiyon Diseksiyonu

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear.  Since there ...

dissection-adult-mouse-utricle-adenovirus-mediated-supporting-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.6K Görüntüleme.  Medical University of South Carolina. Mechanosensory saç hücreleri iç kulak reseptör hücrelerdir. En-karakterize In vitro model sistem yetişkin farelerin utricles organ kültürleri kullanır. Biz yetişkin fare kırbacık diseksiyonu mevcut ve biz kültürlü utricles hücreleri destekleyici adenovirüs aracılı enfeksiyonu gösterir.

Video: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Retina pigment epiteli Tüm Mount Fare Göz Diseksiyon

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Nörobilim

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). Animal models are necessary for studying the etiopathology and potential therapies of cerebrovascular diseases. Imaging the vasculature in large animals is relatively easy. However, developing vessel imaging methods of murine brain disease models is desirable due to the cost and availability of genetically-modified mouse lines. Imaging the murine cerebral vascular tree is a challenge. In humans and larger animals, the gold standard for assessing the angioarchitecture at the macrovascular (conductance) level is x-ray catheter contrast-based angiography, a method not suited for small rodents.
In this article, we present a method of cerebrovascular casting that produces a durable skeleton of the entire vascular bed, including arteries, veins, and capillaries that may be analyzed using many different modalities. Complete casting of the microvessels of the mouse cerebrovasculature can be difficult; however, these challenges are addressed in this step-by-step protocol. Through intracardial perfusion of the vascular casting material, all vessels of the body are casted. The brain can then be removed and clarified using the organic solvent methyl salicylate. Three dimensional imaging of the brain blood vessels can be visualized simply and inexpensively with any conventional brightfield microscope or dissecting microscope. The casted cerebrovasculature can also be imaged and quantified using micro-computed tomography (micro-CT)1. In addition, after being imaged, the casted brain can be embedded in paraffin for histological analysis.
The benefit of this vascular casting method as compared to other techniques is its broad adaptation to various analytic tools, including brightfield microscopic analysis, CT scanning due to the radiopaque characteristic of the material, as well as histological and immunohistochemical analysis. This efficient use of tissue can save animal usage and reduce costs. We have recently demonstrated application of this method to visualize the irregular blood vessels in a mouse model of adult BAVM at a microscopic level2, and provide additional images of the malformed vessels imaged by micro-CT scan. Although this method has drawbacks and may not be ideal for all types of analyses, it is a simple, practical technique that can be easily learned and widely applied to vascular casting of blood vessels throughout the body.

In this article, we present a simple, practical technique for cerebrovascular casting that is easy to perform and can be utilized to image the vascular tree of the adult mouse brain.

3D Görüntüleme ve Morfolojik Analizi Yetişkin Mouse Serebrovasküler Döküm

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

Fare Dopaminerjik ve Üç Boyutlu Collagen Matrix Tahliller striatal Eksplantlarından diseksiyonu ve Kültür

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

Larva, Pupa ve Erişkin diseksiyonu ve İmmünohistokimya<em&gt; Drosophila</em&gt; Retinaları

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Tüm Dağı Diseksiyon ve Yetişkin Fare Kohlea immünofloresan

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Basit Bir adım Yetişkin Tüm montaj Hazırlama Diseksiyon Protokolü<em&gt; Drosophila</em&gt; Brain

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Adult Mouse DRG Explant and Dissociated Cell Models to Investigate Neuroplasticity and Responses to Environmental Insults Including Viral Infection

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory neurons and glial satellite cells. These are useful and versatile models to investigate a variety of biological responses associated with physiological and pathological conditions of the peripheral nervous system (PNS) ranging from neuron-glial interaction, neuroplasticity, neuroinflammation, and viral infection. The usage of DRG explant is scientifically advantageous compared to simplistic single cells models for multiple reasons. For instance, as an organotypic culture, the DRG explant allows ex vivo transfer of an entire neuronal network including the extracellular microenvironment that play a significant role in all the neuronal and glial functions. Further, DRG explants can also be maintained ex vivo for several days and the culture conditions can be perturbed as desired. In addition, the harvested DRG can be further dissociated into an in vitro co-culture of primary sensory neurons and satellite glial cells to investigate neuronal-glial interaction, neuritogenesis, axonal cone interaction with the extracellular microenvironment, and more general, any aspect associated with the neuronal metabolism. Therefore, the DRG-explant system offers a great deal of flexibility to study a wide array of events related to biological, physiological, and pathological conditions in a cost-effective manner.

In this report, the advantages of organotypic cultures and dissociated primary cultures of mouse-derived dorsal root ganglia are highlighted to investigate a wide range of mechanisms associated with neuron-glial interaction, neuroplasticity, neuroinflammation, and response to viral infection.

Yetişkin fare DRG Explant ve nöroplastisite ve Viral enfeksiyon da dahil olmak üzere çevre hakaret yanıtlar araştırmak için hücre modelleri ayrışmış

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

Yetişkin Farede Koklear Yüzey Hazırlama

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Cryo-section Dissection of the Adult Subependymal Zone for Accurate and Deep Quantitative Proteome Analysis

The subependymal neurogenic niche consists of a paraventricular ribbon of the lateral ventricular wall of the lateral ventricle. The subependymal zone (SEZ) is a thin and distinct region exposed to the ventricles and cerebrospinal fluid. The isolation of this niche allows the analysis of a neurogenic stem cell microenvironment. However, extraction of small tissues for proteome analysis&#160;is challenging, especially for the maintenance of considerable measurement depth and the achievement of reliable robustness. A new method termed cryo-section-dissection (CSD), combining high precision with minimal tissue perturbation, was developed to address these challenges. The method is compatible with state-of-the-art mass spectrometry (MS) methods that allow the detection of low-abundant niche regulators. This study compared the CSD and its proteome data to the method and data obtained by laser-capture-microdissection (LCM) and a standard wholemount dissection. The CSD method resulted in twice the quantification depth in less than half the preparation time compared to the LCM and simultaneously clearly outperformed the dissection precision of the wholemount dissection. Hence, CSD is a superior method for collecting the SEZ for proteome analysis.

Cryo-section-dissection allows fresh, frozen preparation of the largest neurogenic niche in the murine brain for deep quantitative proteome analysis. The method is precise, efficient, and causes minimal tissue perturbation. Therefore, it is ideally suited for studying the molecular microenvironment of this niche, as well as other organs, regions, and species.

Doğru ve Derin Nicel Proteom Analizi için Yetişkin Subependymal Bölgesinin Kriyo-kesit Diseksiyonu

The subependymal neurogenic niche consists of a paraventricular ribbon of the lateral ventricular wall of the lateral ventricle. The subependymal zone ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as well as various other cell types. Published culture protocols often refer to whole dissociated DRG cultures as being neuronal, despite the presence of fibroblasts, Schwann cells, macrophages, and lymphocytes. While these whole DRG cultures are sufficient for imaging applications where neurons can be discerned based on morphology or staining, protein or RNA homogenates collected from these cultures are not primarily neuronal in origin. Here, we describe an immunopanning sequence for cultured mouse DRGs. The goal of this method is to enrich DRG cultures for neurons by removing other cell types. Immunopanning refers to a method of removing cell types by adhering antibodies to cell culture dishes. Using these dishes, we can negatively select against and reduce the number of fibroblasts, immune cells, and Schwann cells in culture. This method allows us to increase the percentage of neurons in cultures.

This paper describes an immunopanning protocol for adult mouse dorsal root ganglia. By adhering antibodies to culture plates, we can negatively select and remove non-neuronal cells. We show that the cultures are enriched for neurons using this protocol, allowing for an in-depth study of neuronal responses to manipulation.

Yetişkin Fare Dorsal Kök Ganglia Nöron Kültürlerinin İmmünupanjör ile Zenginleştirilmesi

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...