This work was supported in part by the US National Institutes of Health (R01 HL 111600) and the American Heart Association (12SDG9010015).

Hayvanları da içeren tüm prosedürler California, Davis Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış ve Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu yapıştırılır bulundu. 1. Hazırlık <ol><li> 4 ° C&#39;de önceden ve mağaza modifiye Tyrode çözeltisi iki konsantre edildi (25X) stokları hazırlayın: (1) Stok I (mM olarak: NaCl 3205, CaCl2 32.5, KCI 117.5, NaH 2 PO 4 29,75, MgCI2 26,25) ve (2) (mM olarak: 500 NaHCO 3) Stok II. <ol><li> (DI) NaCl 128.2, CaCl2 1.3, KCI 4.7, MgCl2 1.05, NaH 2 PO 4 1,19, NaHCO 3 20 ve deiyonize 1840 ml birleştirerek glikoz 11.1: Taze (mM olarak) aşağıdaki bileşime sahip 2 L&#39;lik Tyrode solüsyonu hazırlamak Su, 80 mi Hazır I Stok II 80 mi, ve glukoz, 4 g. Doğrudan Stok I ve II Stok karışmaz; eklemek1840 ml DI m çökmesini önlemek için. </li></ol></li><li> Önceden 10 mg susuz di-metilsülfoksit (DMSO) / ml uyanlma-kasılma uncoupler blebbistatin stok çözeltisi hazırlamak ve 4 ° C &#39;de stok solüsyonu saklayın. </li><li> Floresan boyalar stok çözelti hazırlayın: (1) voltaj duyarlı boya RH237 (DMSO içinde 1 mg / ml) ve (2) Düşük afiniteli kalsiyum göstergesi Fluo-5N AM, üreticinin tavsiyelerine göre (DMSO içinde 2 mg / ml). Yükleme kapasitesi kaybı sonucu ile, bozulmayı önlemek için, hemen hazırlıkları kullanın. </li><li> Prime oksijenli sahip çevrimli Langendorff perfüzyonu sistemi (% 95 O2,% 5 CO2), Tyrode çözeltisi. 7.4 ± 0.05 Tyrode çözümü pH tutmak için O 2 / CO 2 akışını ayarlayın. Sürekli perfüzyon filtre: bir in-line naylon dokuma ağ filtre (11 um gözenek boyutu) kullanın. <ol><li> Sonraki loadi olarak oda sıcaklığında Başbakan perfüzyon sistemi,Fluo-5N AM ng oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Fluo-5N AM yükleme için, çevrimli perfüzat küçük bir hacim (~ 150 ml) kullanın. Boya yüklemesinin ardından, perfüzat daha büyük bir hacim kullanımı (1-2 L, Şekil 1C bakınız). </li></ol></li><li> Veri toplama sistemi açın ve EKG ve perfüzyon basıncının sürekli izlenmesi için hazırlar. Basınç izleme sistemi hazırlayın: perfüzyon hattına bir basınç transdüktörü bağlayın ve bir transbridge amplifikatörü ile perfüzyon basıncını izlemek. Kalp perfüzyon sistemine bağlı değilken 0 mmHg bazal perfüzyon basıncını ayarlayın. </li><li> V m ve SR Ca 2 + sinyalleri arasındaki uzaysal uyum sağlamak için optik haritalama kameraları aynı hizaya getirin. <ol><li> İlk olarak, bir cetvel ya da perfüzyon çanak içine metin ile bir nesne yerleştirerek kameralar odaklanır. Canlı görünüm moduna haritalama kameraları açın ve metin canlı ve net olana kadar odağı ayarlamak. Her bir kamera tek bir kare görüntü elde edin. </li><li> YerleşimiHer iki resim görünür, böylece bu görüntülerin ve üst resmin saydamlığını ayarlamak. Görüntülerdeki metin tam üst üste gelmelidir. Mükemmel hizalanmış değilse iki görüntü aynı hizada kadar, dikroik ayna veya her kameranın konumunun açısını ayarlayın. </li></ol></li></ol> Tavşan Kalbin 2. Hasat, Perfüzyon ve Boya yükleme <ol><li> Onaylanmış bir tavşan süzgeç tavşan sabitleyin. Derin sodyum pentobarbital (50 mg / kg) ve heparin (1000 IU) bir intravenöz enjeksiyon (marjinal kulak daman) ile anestetize. <ol><li> Tavşan görüntüler nosiseptif reflekslerin eksikliği olduğunda, bir orta hat cilt kesi sternum ve kaburga maruz olun. Manubrium için xiphoid gelen künt uçlu cerrahi makas ile sternum ile kesin. Sternumu açarken kalbi zarar vermemeye özen gösterin. Kalp maruz kaburga yayıldı. </li><li> Hızla hızla tüm damarları ve bağ dokusu kesim tarafından tüm kalp-akciğer bloğu tüketim. Immediately buz gibi soğuk Tyrode çözeltisi içine kalp-akciğer bloğu yerleştirin. </li></ol></li><li> Retrograd perfüzyon için aorta bulun. Aortik arkın üç şubelerine sadece proksimal asendan aort kesin. Perfüzyon sistemine bağlı bir 8 G kanül aort kanüle. Kanül üzerine aorta güvenli USP 0 ipek sütür bir parça kullanın. </li><li> Dikkatle kalp trakea, akciğerler ve epikardiyal yağ teşrih. Keskin forseps ve diseksiyon makas ile, mitral kapak bulun ve dikkatle zarar veya sol ventrikül çözüm sıkışıklığını önlemek için tek broşür kaldırın. </li><li> Görüntüleme için yukarı bakacak şekilde kalbin ön yüzeyi ile yatay cam ceketli perfüzyon odasında kalbi Batmak. Haritalama (Şekil 1D) sırasında kalbin hareket etmesini önlemek için çanağın silikon alt üzerine U-şekilli pimlerle Sylgard parçasına kanül elde edin. İsterseniz, sta için kalbin tepesinde küçük bir böcek pin eklemekbilization. </li><li> Pozisyon elektrokardiyogram (EKG) kalbin sağ ve sol tarafında banyosunda elektrotlar. Tamamen banyosunda elektrotlar daldırın ve onlar Kurşun Ben yapılandırmasına bir hacim yapılan EKG benzer sağlamak için kalp yüzeyi ile temas halinde olmadığından emin olun. Normal Kurşun I EKG morfoloji doğrulayın. 70 mmHg - aort basıncı 60 muhafaza edilmesinin sağlanması için - (35 ml / dakika 25) akışını ayarlayın. </li><li> Oda ışıkları kapatın ve 0.3 eklemek - Perfüzat (- 20 uM son konsantrasyon 10) ile blebbistatin stok solüsyonu (adım 1.2) 0.6 ml. <ol><li> Blebbistatin bir photoinactivation önlemek için oda ışıkları kapatın. Gerekirse küçük bir spot ışığı veya far görevi aydınlatma sağlamak için kullanılabilir. Not: Blebbistatin bir miyozin ATPaz inhibitörü ve bir eksitasyon-kasılma uncoupler olduğunu. , Kardiyak enerji üretimi bozulabilir - Flu-5N yükleme genişletilmiş (60 dk) RT (hipotermi) koşulları gerektirdiğinden (2.10 adımları 2.8 bakınız). Therefore, Perfüzat önce içine blebbistatin eklenmesi enerji talebini azaltmak 16 ve sonraki optik kayıtları 17 sırasında hareket eserler ortadan kaldırabilir yükleme boya. </li></ol></li><li> Kalbin kasılması bittikten sonra (10 - aort basınç kayıt doğrulandı 15 dk), küçük hacimli çevrimli perfüzyon sistemi (adım 1.4.1 bakınız) geçmek. </li><li> Hazırlayın ve Fluo-5N AM yükleme çözüm yük: 0.25 ml ılık% 20 Pluronic F127 için Fluo-5N AM stok solüsyonu (adım 1.3) 0.25 ml ekleyin. , 0,5 ml karışımına sıcak Tyrode çözeltisi ekleyin, iyice karıştırılmakta ve küçük hacimli çevrimli perfüzyon sistemine ekleyin. </li><li> Sürekli perfüzyon basıncı ve EKG izlenmesi ve gerekirse akışını ayarlamak. Boya yükleme RT&#39;de yaklaşık 1 saat sürer. Yüklemeden sonra 45 dk 37 ° C perfüzyon sistemi ve perfüzyon ısınma başlamak için dolaşan su banyosu açın başladı. </li><li> Fluo-5N AM yükleme, swi 60 dakika sonraDaha büyük hacimli sirkülasyon perfüzyon sistemine perfüzyon Tch (adım 1.4). </li><li> Sıcak Tyrode çözeltisi 1 ml voltajı duyarlı boya RH237 stok çözeltisinin (adım 1.3) 50 ul seyreltilir ve kanül, bir enjeksiyon noktası proksimal içerisine (5 ~ dakika boyunca) yavaş yavaş ekleyin. </li></ol> 3. Optik Haritalama <ol><li> Boya yükleme son anlarında kalbi konumlandırmak ve deney için görüş uygun alanı sağlamak için optik haritalama kameraları odaklanır. </li><li> Eğer arzu edilirse, kalp atışı düzenleme epikardiyal yüzeyi üzerine yerleştirilen iki kutuplu bir elektrot ilerleme hızı yerleştirin. </li><li> Bağlı perfüzat devridaim mevcut olabilir, sıvı yüzeyi üzerinde hareket paraziti azaltmak perfüzyon odasına yüzeyi üzerinde bir plastik ya da cam kapak kayma yerleştirin. Not: Bir kapak kayma bir alternatif, temiz bir plastik 50 mm Petri kabı kapağı kullanmak gibi. </li><li> Üniform e kalbin yüzeyine aydınlatmak için ışık kılavuzları Odakxcitation ışığı. 495 nm bant geçiren filtre (Şekil 1A) - Mavi ışık yayan diyot (LED) ışık kaynağı kullanın ve daha bir 475 ile ışık filtresi. </li><li> Bir macroscope ve iki tamamlayıcı metal oksit-yarıiletken (CMOS) optik haritalama kameralar ile yayılan floresan toplayın. 545 nm&#39;de dikroik ayna ile yayılan ışığı bölün. <ol><li> Uzun pas 700 nm&#39;de, V m sinyalini içeren, uzun dalga boyu parçasını filtre. 534 nm (Şekil 1A) - Bant geçiren 502 den, SR Ca 2 + sinyalini içeren, kısa dalga boylu parçasını filtre. 1 kHz - 0.5 optik veri toplama sıklığını ayarlayın. </li></ol></li><li> Her optik kayıt için, ilk olarak, istenen düzenlemeyi başlatmak ikaz ışığı açmak ve 1 toplamak - veri 4 sn. İstenirse, ilerleme hızı protokolleri ve veri toplama senkronize. Not: mümkün değildir Fluo-5N AM, bu nedenle sinyal-gürültü oranını (SNR) re-load düflüfl olacakse SR sızıntıyı boya nedeniyle deney boyunca. Yüksek SNR değerleri sağlamak için 2 saat - 1 deneysel protokol sınırlayın. </li><li> Deney sonra, Dİ su ile tekrar DI su,% 70 reaktif alkol sırayla perfüzyon sistemi yıkama ve. </li><li> Üreticinin protokolüne göre ticari yazılım paketleri kullanılarak mekansal Gauss filtre (yarıçap 3 piksel) her veri kümesi Filtre. </li><li> Gerekirse, mekansal V m ve SR Ca 2 + veri setleri aynı hizaya getirin. Adım 1.6 olduğu gibi, her kamera görüntüleri kaplaması ve doğrulayın görünümü (yani, kanül, kalp pili elektrodu) alanında kalbin anatomik yapıları (yani., Koroner damar, kulakçıklar kenarlarına veya ventriküller) ya da diğer öğeleri tam olarak örtüşmektedir. Değilse, veri setlerinin mekânsal uyum gereklidir. </li><li> Piksel sayısı not ederek, tam örtüşme kadar x ve y-yönünde elde edilir üst saydam bir görüntü ShiftResim, her yönünde kaydırılabilir olmalıdır. Üst görüntüde (V m veya SR Ca 2+ ya) karşılık gelen tüm veri kümesi sonra V m ve SR Ca 2 + veri setleri arasındaki hassas hizalama sağlamak için her yönde piksel belirlenen sayısına göre kaydırılır gerekmektedir. </li></ol>

<ol>
	<li>Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+voltage+and+calcium+in+cardiac+cells.">Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells.</a> tissues. Circulation research. 110, 609-623 (2012).</li><li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+the+heart.">Optical imaging of the heart.</a> Circulation research. 95, 21-33 (2004).</li><li>Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+optical+mapping+of+the+Langendorff-perfused+rabbit+heart.">Multiparametric optical mapping of the Langendorff-perfused rabbit heart.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).</li><li>Choi, B. R., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+maps+of+optical+action+potentials+and+calcium+transients+in+guinea-pig+hearts:+mechanisms+underlying+concordant+alternans.">Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans.</a> The Journal of physiology. 529 (Pt 1), 171-188 (2000).</li><li>Kong, W., Fast, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dye+affinity+in+optical+measurements+of+Cai(2+)+transients+in+cardiac+muscle.+American+journal+of+physiology.">The role of dye affinity in optical measurements of Cai(2+) transients in cardiac muscle. American journal of physiology.</a> Heart and circulatory physiology. 307, H73-H79 (2014).</li><li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Excitation-Contraction Coupling and Cardiac Contractile Force. , (2001).</li><li>Bers, D. M., Shannon, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+movements+inside+the+sarcoplasmic+reticulum+of+cardiac+myocytes.">Calcium movements inside the sarcoplasmic reticulum of cardiac myocytes.</a> Journal of molecular and cellular cardiology. , (2013).</li><li>Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+roles+of+calsequestrin+and+triadin+in+cardiac+muscle.">New roles of calsequestrin and triadin in cardiac muscle.</a> The Journal of physiology. 587, 3081-3087 (2009).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+calsequestrin+regulation+of+single+cardiac+ryanodine+receptor+in+normal+and+pathological+conditions.">Mechanism of calsequestrin regulation of single cardiac ryanodine receptor in normal and pathological conditions.</a> The Journal of general physiology. 142, 127-136 (2013).</li><li>Diaz, M. E., O'Neill, S. C., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sarcoplasmic+reticulum+calcium+content+fluctuation+is+the+key+to+cardiac+alternans.">Sarcoplasmic reticulum calcium content fluctuation is the key to cardiac alternans.</a> Circulation research. 94, 650-656 (2004).</li><li>Shannon, T. R., Guo, T., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++scraps:+local+depletions+of+free+[Ca2+]+in+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+during+contractions+leave+substantial+Ca2++reserve.">Ca2+ scraps: local depletions of free [Ca2+] in cardiac sarcoplasmic reticulum during contractions leave substantial Ca2+ reserve.</a> Circulation research. 93, 40-45 (2003).</li><li>Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+Ca(2+)+content+regulates+intracellular+Ca(2+)+release+in+subepicardial+myocytes+of+intact+beating+mouse+hearts:+effect+of+exogenous+buffers.">Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 298, H2138-H2153 (2010).</li><li>Picht, E., DeSantiago, J., Blatter, L. A., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+alternans+do+not+rely+on+diastolic+sarcoplasmic+reticulum+calcium+content+fluctuations.">Cardiac alternans do not rely on diastolic sarcoplasmic reticulum calcium content fluctuations.</a> Circulation research. 99, 740-748 (2006).</li><li>Shkryl, V. M., Maxwell, J. T., Domeier, T. L., Blatter, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractoriness+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++release+determines+Ca2++alternans+in+atrial+myocytes.+American+journal+of+physiology.">Refractoriness of sarcoplasmic reticulum Ca2+ release determines Ca2+ alternans in atrial myocytes. American journal of physiology.</a> Heart and circulatory physiology. 302, H2310-H2320 (2012).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++in+the+intact+heart:+ryanodine+receptor+refractoriness+during+alternans+and+fibrillation.">Optical mapping of sarcoplasmic reticulum Ca2+ in the intact heart: ryanodine receptor refractoriness during alternans and fibrillation.</a> Circulation research. 114, 1410-1421 (2014).</li><li>Wengrowski, A. M., Kuzmiak-Glancy, S., Jaimes, R., Kay, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADH+Changes+During+Hypoxia,+Ischemia,+and+Increased+Work+Differ+Between+Isolated+Heart+Preparations.">NADH Changes During Hypoxia, Ischemia, and Increased Work Differ Between Isolated Heart Preparations.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. , (2013).</li><li>Fedorov, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+blebbistatin+as+an+excitation-contraction+uncoupler+for+electrophysiologic+study+of+rat+and+rabbit+hearts.">Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts.</a> Heart rhythm : the official journal of the Heart Rhythm Society. 4, 619-626 (2007).</li><li>Myles, R. C., Wang, L., Kang, C., Bers, D. M., Ripplinger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+beta-adrenergic+stimulation+overcomes+source-sink+mismatch+to+generate+focal+arrhythmia.">Local beta-adrenergic stimulation overcomes source-sink mismatch to generate focal arrhythmia.</a> Circulation research. 110, 1454-1464 (2012).</li><li>Marks, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+cycling+proteins+and+heart+failure:+mechanisms+and+therapeutics.">Calcium cycling proteins and heart failure: mechanisms and therapeutics.</a> The Journal of clinical investigation. 123, 46-52 (2013).</li><li>Cutler, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++ATPase+2a+gene+delivery+to+restore+electrical+stability+in+the+failing+heart.">Targeted sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase 2a gene delivery to restore electrical stability in the failing heart.</a> Circulation. 126, 2095-2104 (2012).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Başarılı Fluo-5N boya yükleme anahtarları boyanın büyük miktarda yükleme süresi (1 saat) uzunluğu gerek kalmadan yüksek Fluo-5N konsantrasyonu sağlar küçük hacimli çevrimli perfüzyon kurulum vardır ve yükleme gerçekleştirme oda sıcaklığında karıştırıldı. Yükleme hızla fizyolojik sıcaklıklarda, hücresel enzimatik aktivite böler boya sitozolde boya moleküllerini yakalama ve onları SR zarı geçmeye izin vermiyor, hücre zarı haçlar -AM etiketi gerçekleştirilir edin. Oda sıcaklı...

Dual optical mapping of intracellular Ca2+ and transmembrane potential (Vm) in the intact Langendorff-perfused heart has become a mainstay of investigations in cardiac electrophysiology, including mechanisms of arrhythmia and excitation-contraction coupling1-4. This approach has provided unprecedented knowledge into normal and abnormal electrophysiology and, importantly, into the bidirectional relationship between Vm and intracellular Ca2+. However, optical mapping of intracellular Ca2+ with high-affinity fluorescent indicators (such as Rhod-2 and Fluo-4) only reports on bulk changes in intracellular Ca2+ and is unable to distinguish whether these changes are due to transmembrane Ca2+ flux, release and reuptake into intracellular stores, or in most instances, some combination of both. Furthermore, high-affinity Ca2+ indicators have slow on-off kinetics and may not accurately report rapid changes in Ca2+ concentration5.
Each action potential triggers a rise in intracellular Ca2+, known as the intracellular Ca2+ transient (CaT). In the mammalian heart, approximately 70 &#8211; 90% of the total CaT is due to release of Ca2+ from the sarcoplasmic reticulum (SR) via opening of ryanodine receptors (RyRs)6. Within the SR, approximately half of the total Ca2+ is bound to calsequestrin (CSQ) and other intra-SR buffers7, which play an important role in SR Ca2+ homeostasis8,9. The amount of free SR Ca2+ dictates the driving force for SR Ca2+ release as well as gating of RyR, and therefore has a significant impact on the intracellular CaT. Furthermore, alterations in SR Ca2+ release or reuptake can, in turn, impact Vm via the electrogenic Na+-Ca2+ exchange, which may have arrhythmogenic consequences. Therefore, in addition to the CaT, monitoring of free SR Ca2+ can provide important insights into contractile and electrophysiological dysfunction.
Over the past several years, investigators have made significant advances in the monitoring of SR Ca2+ in isolated cardiac myocytes and from a single location on the intact heart. One such method requires rapid pulses of caffeine to open RyRs and the SR Ca2+ content is then inferred or calculated from the immediate rise in intracellular Ca2+10. Another intriguing approach uses low-affinity Ca2+ indicators, such as Fluo-5N11 or Mag-Fluo412, which bind to free SR Ca2+. These indicators have dissociation constants (Kd) in the range of 10 &#8211; 400 &#956;M and therefore exhibit minimal fluorescence in the cytosol compared to the SR lumen, where the Ca2+ concentration ([Ca2+]SR) is in the millimolar range. Using low-affinity Ca2+ indicators, several aspects of SR Ca2+ cycling have been investigated at the level of the isolated myocyte, including fractional SR Ca2+ release and the mechanisms of Ca2+ alternans13,14. However, in order to fully understand the heterogeneous nature of SR Ca2+ cycling in the intact heart and the role of SR Ca2+ in spatially distinct arrhythmic phenomena, methods for imaging SR Ca2+ across the epicardial surface of the intact heart are required15.
This article describes methodology for dual optical mapping of free SR Ca2+ and Vm in the intact Langendorff-perfused rabbit heart with the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="956">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">S271-1</td>
			<td style="width:423px;">Component of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">CaCl2 (2H2O)</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">C79-500</td>
			<td style="width:423px;">Component of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">S217-500</td>
			<td style="width:423px;">Component of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">MgCl2 (6H2O)</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">M33-500</td>
			<td style="width:423px;">Component of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">NaH2PO4 (H2O)</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">S369-500</td>
			<td style="width:423px;">Component of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">S233-3</td>
			<td style="width:423px;">Component of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">D16-1</td>
			<td style="width:423px;">Component of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">95% O2 5% CO2</td>
			<td style="width:167px;">AirGas</td>
			<td style="width:151px;">carbogen</td>
			<td style="width:423px;">For oxygenation and pH of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Blebbistatin</td>
			<td style="width:167px;">Tocris Bioscience</td>
			<td style="width:151px;">1760</td>
			<td style="width:423px;">Excitation-contraction uncoupler</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">RH237</td>
			<td style="width:167px;">Biotium</td>
			<td style="width:151px;">61018</td>
			<td style="width:423px;">Voltage-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Fluo-5N AM</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">F-26915</td>
			<td style="width:423px;">Low-affinity Ca2+ indicator; Alternative: Invitrogen F-14204; Loading must be performed at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Pluronic F127</td>
			<td style="width:167px;">Biotium</td>
			<td style="width:151px;">59004</td>
			<td style="width:423px;">For Ca2+ indicator loading; Warm until the solutiion is clear before use</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Dimethyl sulphoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">D2650</td>
			<td style="width:423px;">For dissolving blebbistatin and dyes</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Filter</td>
			<td style="width:167px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:151px;">NY1104700</td>
			<td style="width:423px;">11um in-line filter</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Pressure Transducer</td>
			<td style="width:167px;">WPI</td>
			<td style="width:151px;">BLPR2</td>
			<td style="width:423px;">For measuring perfusion pressure</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Transbridge Transducer Amplifier</td>
			<td style="width:167px;">WPI</td>
			<td style="width:151px;">SYS-TBM4M</td>
			<td style="width:423px;">For transducing/amplifing pressure signal; PowerLab may also be used with appropriate BioAmp</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">PowerLab 26T</td>
			<td style="width:167px;">ADInstruments</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:423px;">For continuous recording of pressure and ECG signals</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">THT Macroscope</td>
			<td style="width:167px;">SciMedia</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:423px;">Macroscopic optical setup. Details: 0.63x objective (NA=0.31), 2x condensing objective, resultant field of view = 3.1x3.1 cm, depth of focus = ~1.5mm</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">MiCam Ultima-L CMOS</td>
			<td style="width:167px;">SciMedia</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:423px;">Optical mapping cameras</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Precision LED Spot Light</td>
			<td style="width:167px;">Mightex</td>
			<td style="width:151px;">PLS-0470-030-15-S</td>
			<td style="width:423px;">LED light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical mapping of intra-sarcoplasmic reticulum ca2+ and transmembrane potential in the langendorff-perfused rabbit heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Şekil 1A, çift V m ve SR Ca2 + eşleme için optik konfigürasyonunda şematik bir diyagramını göstermektedir. Bu ayar ile, V m ve SR Ca 2 + sinyalleri (Şekil 1B) tam spektral ayrılık yoktur. Fluo-5N boya yüklemesinin için kullanılan çift döngü perfüzyon sistemin bir şeması Şekil 1C &#39;de gösterilmiştir. Şekil 1 D perfüzyon çanak kalp yatay yönünü gösterir. Örnek V m ve...

Watch this Scientific Journal Video about Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart at JoVE.com

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Bu makalede, Langendorff-perfüze tavşan kalbinde ayrıntılı protokol ve transmembran potansiyeli (V m) ikili optik haritalama ve ücretsiz içi sarkoplazmik retikulum (SR) için gerekli donanımın Ca 2+ açıklanır. Bu yöntem, sağlam kalbinde, doğrudan gözlem ve V m ölçümü ve SR Ca 2 + dinamikleri sağlar.

Intra-Sarkoplazmik Retikulum Ca Optik Haritalama<sup&gt; 2+</sup&gt; Ve Langendorff-perfüze Tavşan Heart Transmembran Potansiyeli

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

optical-mapping-intra-sarcoplasmic-reticulum-ca2-transmembrane

Research

JoVE Journal

Biology

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

9.1K Görüntüleme.  University of California Davis.  Bu makalede, Langendorff-perfüze tavşan kalbinde ayrıntılı protokol ve transmembran potansiyeli (V m) ikili optik haritalama ve ücretsiz içi sarkoplazmik retikulum (SR) için gerekli donanımın Ca 2+ açıklanır. Bu yöntem, sağlam kalbinde, doğrudan gözlem ve V m ölçümü ve SR Ca 2 + dinamikleri sağlar. 