Ve Boston Çocuk Hastanesi&#39;nden Kalp İletim Fonu katkılar; Bu çalışma, araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe (HL088206 HL068915) tarafından desteklenmektedir.

Bölüm 1: hazırlayın çözümleri ve izole perfüze kalp sistemi <ol><li> [5, 6] açıklandığı gibi deney sabahı, Krebs-Henseleit çözüm 4.0 L hazırlanmıştır. </li><li> 11 mmol / L 2,3-butanedione monoxime (DGM) 1.0 L adım 1.1 &#39;de hazırlanan perfüzat dekante Krebs-Henseleit çözüm çözülür. </li><li> Krebs-Henseleit ek bir 150 ml, adım 1.1 &#39;de hazırlanan perfüzat kaldırılır ve 5 Mol / L di-8-ANEPPS (dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözünmüş 10 mmol / L stok seyreltilmiş) ile karıştırılır. </li><li> % 5 CO 2 gaz Bu 3 çözümler su-ceketli cam rezervuarlar (Radnoti) 41,0 ° C önceden ısınmış ve% 95 O 2 mikron filtreden 0.2 kullanarak bir batık bubbler (Radnoti) ile oksijenli aktarılır. 3 stok rezervuarları Çözümleri MASTERFLEX ™ L / S peristaltik pompalar ve düşük emme silikon tüp (Cole-Parmer) ile duvara monte Langendorff sistemine pompalanır. </li><li> Montaj öncesinde Langendorff sistem cam (Radnoti) titizlikle E-TOXA TEMİZ reaktif (Sigma-Aldrich) ile yıkanmış ve 0.1 M / L HCl,% 100 etanol ve saf su ile iyice durulanmalıdır. </li><li> Sirkülasyon olmayan Langendorff aparat, 3 ayrı su ceketli ısıtma bobinleri ve kabarcık tuzakları ile kalp ayrılır oksijenli depoları, 70 mmHg sabit basınç sağlamak için inşa edilmiştir (Radnoti) [7] . 3 bağımsız perfüzyon hatları 1.1 - 1.3 için adımları hazırlanan çözümler teslim bize tam kontrol etmeye izin veren, 3-yollu iki stopcocks kalp üzerinde birleşir. Su ceketli cam MASTERFLEX PharMed BPT boru (Cole-Parmer) ile seri olarak bağlı ve 39 ısındı ° C distile su kullanarak iki E100 sirkülatörler (Lauda). Isıtma bobinleri ve kabarcık tuzakları basınç baş rezervuarları bağlayan platin kurutulmuş silikon tüp (Cole-Parmer) yoluyla ısı kaybı, 37 ° C perfüzat kalp ulaşan sonuçlandı. </li></ol> Bölüm 2: Hasat sıçan kalp ve set-up Langendorff perfüzyon <ol><li> 200-250 g Lewis sıçanlarda derin genel anestezi uygulamak için, 100 mg / kg Ketamin ve 10 mg / kg Xylazine intraperitoneal boşluğuna enjekte edilir. Bu karışımı, biz eksplantasyonu işlemi sırasında kan pıhtılaşması ve miyokard iskemisi önlemek için 500 U / kg Heparin ekleyin. </li><li> Kalp ve büyük damarların kolay erişim için, göğüs ön duvarı kaldırılır. Bundan sonra, çevredeki doku dikkatlice disseke ve perikardiyal çuval açıldı. </li><li> Inferior vena kava belirlenmesini takiben, bu gemi, 5-0 ipek (Ethicon) ve tüm kalp-akciğer bloğu eksplante ile bağlandı. Doku hemen buz 50 ml beher bulunan buz Krebs-Henseleit çözüm yerleştirilir. </li><li> Asendan aorta hızla tespit ve çevresindeki doku disseke edilir. Uygun ölçekli bir kanül (Harvard Apparatus), çok ileri aort kökü içine kanül takarak, koroner arter zorunlu perfüzyon kesilmesini önlemek için özen, aort içine yerleştirilir. Kanül 5-0 ipek (Ethicon) ile çıkan aortun güvence altına alınmıştır. </li><li> Sıçan kalp sonra kanül içine hava kabarcıklarının tanıtan Langendorff aparat yerleştirilir. Retrograd koroner arter perfüzyon şimdi adım 1.6 &#39;da açıklanan basınç kafa sıcak, oksijenli Krebs-Henseleit çözümü ile kurulmuştur. </li><li> Ekstra doku, akciğerler dahil olmak üzere şimdi kaldırılır ve kalp fonksiyonu kurtarma izni ve ritmini istikrara kavuşturmak için 20 dakika boyunca perfüze. Bu süre zarfında, çok ince bir termokupl sıcaklık probu (Cole-Parmer) sol ventrikül boşluğuna tanıtıldı ve 5-0 Prolen sütür (Ethicon) ile de sütüre. Prob kalbin sıcaklığını sağlamak için bir termo-denetleyici (Digi-Sense) bağlı 37 muhafaza ° C su dolaşım pompalarının ayarlarını. Kalp ucundan damlayan perfüzat Hareket atık priz bir gazlı bez parçası koyarak en aza indirilmiştir. </li></ol> Bölüm 3: potansiyometrik boya ile Yük kalp ve elektrografik ve optik sinyalleri elde <ol><li> Di-8-ANEPPS (Invitrogen) içeren Krebs-Henseleit karışık bir stopcock kullanarak floresan boya ile perfüzyon hattına geçiş yaparak kalp yüklenir. Buna ek olarak, 18G kanül yeterince koroner arterler yoluyla getirilen boya ile perfüze değildir çünkü yavaş yavaş bu odaların her birine uygulanan boya çözüm sol ve / veya sağ atrium ve ek 50 ml yerleştirilir. </li><li> Yükleme işlemi sırasında, 3 EKG yol açar (Harvard Apparatus) haritalama için kullanılan optik karşı karşıya değiliz kalbin yüzeyine hafifçe yerleştirilir. Elektrot N o 1, arka sol ventrikül apikal kısmının, K sol atrium o 2 ve N tarafta konumlandırılmış <su<html> (Şekil 1) aort kökü bir referans elektrot olarak p&gt; o 3. Atriyal ve ventriküler elektrografik sinyaller, daha sonra amplifiye sayısallaştırılmış ve yazılım (RedShirt Görüntüleme) (Şekil 2) kullanarak optik sinyallerin yanında görüntülenir. Bir osiloskop (Tektronix modeli TDS 1002), aynı zamanda gerçek zamanlı olarak yüzey EKG s görselleştirmek için ve yeterli pacemaker sağlamak için kullanılır. </li><li> EKG amplifikatör (Hugo Sachs Elektronik) ayarları: High Pass Filtre: 0.1 Hz Alçak Geçiren Filtre: 150 Hz </li><li> CMOS kamera (RedShirt Görüntüleme) ve Makroskop&#39;ta kalbin yüzeyine odak ve satın çerçeve merkezli böylece XYZ ayarlamalarını kullanarak konumlandırılmış. Rezonans frekansları en aza indirmek için bir titreşim izolasyonu tablosu (Eksi K Teknolojisi) kamera ve optik üzerine monte edilir. Aynı zamanda, bir koaksiyel pacing elektrod (Harvard Apparatus), izole, S48 elektrik stimülasyon birimi (Çim) ile kontrol sağ atriyuma yerleştirilen ve kalp dakikada 300 vuruş (Şekil 1) tempolu. </li><li> Elektrik stimülasyon (Çim) ayarları: Hızı: saniyede 5 bakliyat Gecikme: 0,2 ms Süresi: 2 ms Volt: 6-12 V Modu: Tekrarla Nabız: Tek </li><li> Daralma hareket eserler eksikliği optik kayıtları, kalp elektromekanik Kuplajsız gerekir. Biz yine 11 mmol / L BDM içeren Krebs-Henseleit çözüm perfüzyon hatları geçiş yaparak bunu. Satın almalar arasında, kalp hazırlık canlılığı korumaya yardımcı olmak için katkısız Krebs-Henseleit ile perfüze. </li><li> Aşağıdaki satın alma ayarları ile yazılım (RedShirt Imaging) kullanarak kayıt parametreleri ayarlanır: Yapılandırma: 2.000 Hz, 128x128 piksel Kare Aralığı: 0.5 ms Kamera Amplifikatör Kazanç: 5x On-Chip Kazanç: 8x-12Me-kuyu Perde Hızı: 500 ms gecikme Çerçeveler sayısı: 4000 Süre: 2000 ms </li><li> Tüm oda ve ekipman ışıkları kapalı ya da kayıt sırasında arka plan gürültüsünü ortadan kaldırmak için korumalı. LED ışık fotoğraf ağartma ve boya toksisite azaltmak için optik kayıt sırasında sadece kalp yanar. Işık kaynağı, perde, kontrol paneli üzerinden bilgisayara D-A kurulu (RedShirt Görüntüleme) yolu ile teslim bir 5 V darbesi ile kontrol edilir. </li></ol> Bölüm 4: RedShirt Görüntüleme Yazılımı kullanarak satın alma bilgileri analiz <ol><li> Satın alınmasının ardından, veri, farklı filtre ayarları kullanarak işlenir. Biz genellikle Band / Durdur, 44.0 sol sınır ve sağ sınır 98,0 az filtre, pas ayarlarken dışında varsayılan ayarları kullanabilirsiniz. Daha sonra kaydedilen bilgiler işlenir ve bir film (RedShirt Görüntüleme) oluşturulur. </li><li> Bir satın alma elde edilen veriler, 2 saniyelik bir süre içinde kalp yüzeyinde 16.384 siteleri yerel elektrik aktivasyonu için karşılık gelir. Yazılım, bu yerel sinyaller doğrudan birbirleri ile ve atriyal ve ventriküler elektrografik kayıtları ile karşılaştırılmasına olanak tanır. Veri sonra renk yerel elektrik aktivasyon haritalama ve kalp yüzeyinde uzaysal elektrik aktivasyonu gösteren bir animasyon olarak bu bilgileri işleme ile görünür. Böyle bir animasyon oluşturmak için, biz için yazılım kullanabilirsiniz: <ul><li> zamansal ve / veya mekansal verilere filtre </li><li> animasyon için bir başlangıç ​​ve bitiş zamanı seçin </li><li> her pikselin dinlenme ışık yoğunluğuna göre renk haritası optik sinyalleri </li><li> kalp resmi ile ortaya çıkan renk veri bindirme </li><li> animasyon oluşturmak </li></ul></li></ol> Bölüm 5: Temsilci sonuçları Perfüze kalp hazırlanması kayıt sırasında hareketsiz ise, optik sinyalleri di-8-ANEPPS emisyon yoğunluğu değişikliği dahil her piksel için ayrı zirve göstermektedir. Ilgili filmleri (Şekil 3 ve 4), kalp gibi aynı anda alınan elektrografik kayıtları (Şekil 2) epikardiyal yüzeyi boyunca yayılan bir eksitasyon dalga ön göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/1138/Figure3.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Langendorff-perfüze kalp hazırlık bir fotoğraf, sağ atrium pacing elektrot pozisyonları resmeden ve EKG adım 3.2 &#39;de açıklandığı gibi açar . <img src="/files/ftp_upload/1138/Figure4thumb.jpg" alt="Şekil 2" border="0" /> Şekil 2, perfüze Lewis sıçan kalbinde Temsilcisi optik sinyalleri ve elektrografik kayıtları . Panel A epikardiyal yüzeyi optik görüntüleme için kullanılan bir görüntü gösterir. B Paneli zamanla floresans emisyon değişiklik göstermek üzere seçilen piksel konumunu renkli oklarla gösterilir. Panel C Elektrografik sinyalleri belirten atriyal aktivasyon ve ventriküler sinyale karşılık gelen açık mavi çizgi kırmızı çizgi ile gösterilmiştir. Lütfenve.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg &quot;&gt;, bu rakamın büyük bir halini görmek için buraya tıklayın .

<ol>
	<li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+the+heart.">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).</li><li>Hucker, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Images+in+cardiovascular+medicine.+Optical+mapping+of+the+human+atrioventricular+junction.">Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction.</a> Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).</li><li>Entcheva, E., Bien, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macroscopic+optical+mapping+of+excitation+in+cardiac+cell+networks+with+ultra-high+spatiotemporal+resolution.">Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution.</a> Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).</li><li>Entcheva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+of+electrical+activity+in+cardiac+cells+using+an+all-solid-state+system.">Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).</li><li>Stamm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+endotoxin-induced+alterations+in+myocardial+calcium+handling:+obligatory+role+of+cardiac+TNF-alpha.">Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha.</a> Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).</li><li>Choi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+conduction+through+engineered+tissue.">Cardiac conduction through engineered tissue.</a> Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).</li><li>Skrzypiec-Spring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+heart+perfusion+according+to+Langendorff---still+viable+in+the+new+millennium.">Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).</li><li>Fedorov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+blebbistatin+as+an+excitation-contraction+uncoupler+for+electrophysiologic+study+of+rat+and+rabbit+hearts.">Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts.</a> Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).</li></ol>

Boston Çocuk Hastanesi&#39;nden Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.

Miyokard iskemisi önlemek için anestezi uygulanmış sıçanlarda kalp kaldırılması hızla yapılmalıdır. Iskemi veya yetersiz koroner perfüzyon oluşursa, kalp büyük olasılıkla aritmiler geliştirmek ve enfarkte olabilir. Ayrıca, bu kalpleri bilgilendirici kayıtları ve daha sonraki analizler için yeterli floresan emisyon gösterecektir. Boya yüklemeden önce, miyokard hücrelerinin elektriksel impulsları istikrar için bir fizyolojik elektrolit ortam kurmak ve sürdürmek için yeterli Krebs-Henseleit...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CardioCMOS-SM128f</td>
<td>Equipment</td>
<td>RedShirt Imaging, Decatur, GA 30030 USA </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CardioPlex Software</td>
<td>Equipment</td>
<td>RedShirt Imaging, Decatur, GA 30030 USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LUXEON LED Light Source 460-490 nm </td>
<td>Equipment</td>
<td>Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA</td>
<td>LXHL-PB02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ECG Amplifier Type 689 Hugo Sachs Elektronik</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>730149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dichroic Mirror 505 nm</td>
<td>Equipment</td>
<td>Semrock, Rochester, NY 14624 USA</td>
<td>FF505-SDi01-25x36</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Emission Filter 605 nm Long Pass</td>
<td>Equipment</td>
<td>SciMedia, Costa Mesa, CA 92626 USA </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>THT Sideways</td>
<td>Equipment</td>
<td>SciMedia, Costa Mesa, CA 92626 USA</td>
<td>25 BM-8</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini Ball Joint Holder</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>BS4 73-0177</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Small Stimulation Electrode Set</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>BS4 73-0160</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BM-6 Benchtop Vibration Isolation Platform</td>
<td>Equipment</td>
<td>Technology Inc., Inglewood, CA 90301</td>
<td>25 BM-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Monopolar ECG Electrode</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>BS4 73-0200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Roller Pump SCI 400</td>
<td>Equipment</td>
<td>Watson-Marlow Bredel Inc., Wilmington, MA 01887 USA</td>
<td>401U/D1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Roller Pump MasterFlex Easy Load II</td>
<td>Equipment</td>
<td>Cole Parmer, Vernon Hills, Illinois 60061 USA</td>
<td>Model 77201-60</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubing Marprene #14</td>
<td>Equipment</td>
<td>Watson-Marlow Bredel Inc., Wilmington, MA 01887 USA</td>
<td>902.0016.016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MasterFlex Tubing</td>
<td>Equipment</td>
<td>PharMed, Westlake, OH 44145 USA</td>
<td>06485-25</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>S48 Square Pulse Stimulator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Grass Technologies, West Warwick, RI 02893 USA</td>
<td>Model S48</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SIU5 RF TRANSFORMER ISOLATION UNIT</td>
<td>Equipment</td>
<td>Grass Technologies, West Warwick, RI 02893 USA</td>
<td>Model SIU5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5 Liter Water Jacketed Reservoir</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA</td>
<td>120142-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2 Liter Water Jacketed Reservoir</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA</td>
<td>120142-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5 Liter Water Jacketed Reservoir</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA</td>
<td>120142-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.25 Liter Water Jacketed Reservoir</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA </td>
<td>120142-025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 ml Heating Coil</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA</td>
<td>158822</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Compliance Bubble Trap</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA</td>
<td>130149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luer Disconnect Cannula</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>72-1444</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3-Way stopcock, FLL to MLT, No Port Covers</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>BS4 72-2630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thermocouple Thermometer</td>
<td>Equipment</td>
<td>Cole Parmer, Vernon Hills, Illinois 60061 USA</td>
<td>WU-91100-40</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultra Fine IT-Series Flexible Microprobe </td>
<td>Equipment</td>
<td>PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA</td>
<td>IT-24P</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oscilloscope Tektronix TDS 1002</td>
<td>Equipment</td>
<td>Tektronix Inc., Beaverton, OR 97005 USA</td>
<td>TDS 1002B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2,3-Butanedione monoxime </td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma, St. Louis, MO 63132 USA</td>
<td>B0753</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ketamine HCl</td>
<td>Reagent</td>
<td>Hospira Inc., Lake Forest, IL 60045 USA</td>
<td>RL-0065</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xylazine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Lloyd Inc., Iowa 51601 USA</td>
<td>LB15705A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>E-TOXA-CLEAN&reg;</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma, St. Louis, MO 63132 USA </td>
<td>E9029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Di-8-ANEPPS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen, Carlsbad, CA 92008 USA</td>
<td>D-3167</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

optical mapping of langendorff-perfused rat hearts

Voltaj duyarlı floresan boya ile kalp yüzey Optik haritalama deneysel modellerde elektrik uyarım araştırmak için önemli bir araç haline geldiğini hücre kültürleri bütün organları ölçek aralığı<sup&gt; [1, 2]</sup&gt;. Normal kalp ritmi sırasında veya aritmi başlaması ve bakım boyunca state-of-the-art optik görüntüleme sistemleri, üretim ve aksiyon potansiyelleri yayılmasını neredeyse anında görüntülenmiştir.<sup&gt; [1]</sup&gt;. Piyasada bulunan en son sistemleri, son derece yüksek uzaysal çözünürlüklerde bilgi sağlayabilir ve daha geleneksel elektrofizyolojik yöntemler dayattığı engelleri aşmak için başlangıçta geliştirilmiş özel tasarlanmis ekipmanlar dayalı<sup&gt; [1]</sup&gt;. Yüksek çözünürlüklü ve yüksek hızda tamamlayıcı metal oksit yarı iletkeni (CMOS) kameralar ve yoğun bir şekilde parlak ışık yayan diyot (LED) yanı sıra voltaj duyarlı boyalar, optik, ve filtreler Gelişmeleri elektrik sinyal alımı yapmaya başladı mikroskopları ile çalışmak için daha alışkın kardiyovasküler hücre biyologlar için pratik. CMOS kameraların en yeni nesil numune hazırlama türüne bağlı olarak 16.384 piksel saniyede 10.000 kare, edinebilirler rağmen, fotodiyot diziler, lazer tarama sistemleri ve soğutmalı olarak köklü floresan satın alma teknolojileri şarj çiftli aygıt (CCD dinamik aralık saygı, sinyal-gürültü oranı) kameralar hala bazı belirgin avantajları vardır ve kuantum verimliliği<sup&gt; [1, 3]</sup&gt;. Bu çalışmada, Lewis sıçan kalpleri perfüze edildi<em&gt; Ex vivo</em&gt; 37 kristalloid perfüzat (Krebs-Henseleit çözüm) ° C değiştirilmiş bir Langendorff aparat. 20 dakikalık bir istikrar döneminden sonra, kalpler aralıklı görüntü alımı sırasında kasılması ile ilişkili hareket ortadan kaldırmak için 11 mmol / L 2,3-butanedione monoxime ile perfüze edildi. Optik haritalama için, hızlı tepki potansiyometrik prob di-8-ANEPPS kalpleri yüklenir<sup&gt; [4]</sup&gt; (5 mmol / L) ve kısa bir süre 475 ± 15 nm uyarma ışığı ile hazırlık aydınlattı. &gt; Kalp hazırlık yayılan 605 nm ışık, aydınlatma tipik bir 2 ikinci dönemde yatay bir Makroskop&#39;ta bağlı bir yüksek hızda CMOS kamera ile görüntülendi. Bu gösteri için, kupa, izole edilmiş bir elektrik stimülasyonu ünitesine bağlı bir koaksiyel elektrot ile dakikada 300 atım tempolu. Eşzamanlı bipolar elektrografik kayıtları kolay kullanılabilen yazılım kullanarak gerilim sinyalleri ile birlikte satın alındı ​​ve analiz edildi. Bu şekilde, Langendorff perfüze sıçan kalpleri yüzeyinde aksiyon potansiyelleri görüntülenebilmekte ve elektrografik sinyalleri ile kayıtlı olabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts at JoVE.com

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Bu makale, potansiyometrik boya kullanarak (di-8-ANEPPS) Langendorff perfüze sıçan kalpleri yüzeyinde optik görüntü aksiyon potansiyeli hareketi yüksek bir zamansal ve mekansal çözünürlükte tekniği açıklar.

Langendorff perfüze sıçan Kalpler Optik Haritalama

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

optical-mapping-of-langendorff-perfused-rat-hearts

Research

JoVE Journal

Biology

20.7K Görüntüleme.  Children's Hospital Boston and Harvard Medical School. Bu makale, potansiyometrik boya kullanarak (di-8-ANEPPS) Langendorff perfüze sıçan kalpleri yüzeyinde optik görüntü aksiyon potansiyeli hareketi yüksek bir zamansal ve mekansal çözünürlükte tekniği açıklar.

Video: Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Mikroskop Uygun Bakım ve Temizlik

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Biyoloji

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

Işık Mikroskobu Binbaşı Bileşenleri

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Faz Kontrast ve Diferansiyel Girişim Kontrast (DIC) Mikroskopi

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

Küçük Kalpler Yarı-otomatik Optik Heartbeat Analizi

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Zebra balığı Tek Hücre Kader Haritalama

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

Embriyonik Fare Kalpler Gelişmekte Hücre Etiketleme ve Enjeksiyon

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Yüksek verim Uygulamaları Yetişkin Zebra Hearts Kurtarma

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

Kültürlü HL-1 Atriyal miyositlerdeki Monolayer Gerilim ve Kalsiyum Çift Kanal Optik Haritalama

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

Intra-Sarkoplazmik Retikulum Ca Optik Haritalama<sup&gt; 2+</sup&gt; Ve Langendorff-perfüze Tavşan Heart Transmembran Potansiyeli

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The development of novel pharmacological therapies to cure these patients relies on the thorough understanding of both normal physiology and pathophysiology of the SAN. Among the studies of cardiac pacemaking, the mouse SAN is widely used due to its feasibility for modifications in the expression of different genes that encode SAN ion channels or calcium handling proteins. Emerging evidence from electrophysiological and histological studies has also proved the representativeness and similarity of the mouse SAN structure and functions to larger mammals, including the presence of specialized conduction pathways from the SAN to the atrium and a complex pacemakers' hierarchy within the SAN. Recently, the technique of optical mapping has greatly facilitated the exploration and investigation of the origin of excitation and conduction within and from the mouse SAN, which in turn has extended the understanding of the SAN and benefited clinical treatments of SAN dysfunction associated diseases. In this manuscript, we have described in detail how to perform the optical mapping of the mouse SAN from the intact, Langendorff-perfused heart and from the isolated atrial preparation. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of mouse SAN physiology and pathophysiology.

Here, we present a protocol for optical mapping of electrical activity from the mouse right atrium and especially the sino-atrial node, at a high spatial and temporal resolution.