Avustralya Nükleer Bilimi ve Mühendisliği Enstitüsü destek kabul edilmektedir. TCK AINSE ödül layık görüldü. Epigenomic Tıp Laboratuarı, Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (566.559) Avustralya tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma, Biyomedikal Görüntüleme Development Ltd ÇHS tarafından finanse kurulan ve Avustralya Hükümeti Ortak Araştırma Merkezleri (CRC) programı kapsamında desteklenen. LM Melbourne Araştırma (University of Melbourne) ve Biyomedikal Görüntüleme CRC ek burs tarafından desteklenmektedir. Monash Micro Görüntüleme desteği (Dr Stephen Cody ve Iska Carmichael), bu iş için çok değerli idi.

Hücre hazırlık <ol><li> İnsan erythroleukemic K562 hücreleri 37 nemlendirilmiş bir% 5 CO 2 ortamında% 10 (v / v) fetal sığır serumu ve 20 mg / ml gentamisin ile desteklenmiş RPMI-1640 ortamı ° C yetiştirilen </li><li> Boyamadan önce yaklaşık 18 saat, 37 taze medya ve karşılığında tekrar süspansiyon salin (PBS), tamponlu fosfat ile katlanarak büyüyor hücreleri (5 x 10 5 hücre / ml) optimum yıkama ° C,% 5 CO 2 . </li><li> 5 dakika boyunca yaklaşık 1500 rpm&#39;de santrifüj yoluyla hücreler iki kez PBS ile yıkayın ve taze medya içinde tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Hücre sayımı ve hücre yoğunluğu yaklaşık 5 x 10 5 hücre / ml ayarlayabilirsiniz. </li></ol> Hücreler otomatik bir yöntem (örneğin Sysmex veya 5 ila 20 mikron arasında filtre boyutu ile Coulter sayacı) veya trypan mavisiyle boyama metodu ve bir haemocytometer kullanarak ya sayılabilir. Aşırı hücre sayısı (&gt; 800 hücre / cm 2), homojen olmayan boyama yol açabilir . Işınlama ve immünofloresan boyama <ol><li> Sitospin klipleri, filtre kartları ve slaytlar uygun etiketleme ile birleştirin. </li></ol> Montaj sitospin cihazları filtre kartı delik huni çakışacak şekilde sağlamak. <ol start="2"><li> Γ-radyasyon veya X-ışınları (bu örnekte 2Gy) hücreleri Açığa. </li></ol> Işınlama sırasında odaklarının oluşumunu önlemek için, önce ve radyoterapi sırasında 5 ila 10 dakika buz üzerinde hücrelerin tutun. Irradyasyonu takiben 37 hücreleri inkübe ° C,% 5 CO 2 için gereken zaman (pik γH2AX seviyeleri 30 dakikadan 1 saate kadar kadar; Bu örnekte 1 saat) . <ol start="3"><li> Soğuk PBS ile iki kez, taze PBS içinde santrifüj ve tekrar süspansiyon hücreleri yıkayın. </li><li> 500 rpm&#39;de 5 dakika boyunca her sitospin huni ve spin hücre süspansiyonu 100 ile 150 mcL dağıtın. </li><li> Cytospins slaytlar ayrı ve hücreler yaklaşık 15 dakika orta derecede kuru hava sağlar. </li></ol> Hücresel morfoloji parçalanır, hücreler tamamen kurumasını izin vermeyin. <ol start="6"><li> Hidrofobik bir kalem ile hücrelerin etrafında bir daire çizin. </li><li> Hücreler az 5 dakika oda sıcaklığında (RT) için% 4 paraformaldehid ile sabitleyin. </li></ol> Deneyimlerimiz, paraformaldehid ile tespit etanol veya metanol ile tespit üstündür. Uzun fiksasyon kez (15 ila 20 dakika) yapışık hücrelere Optimum sabitleme için gerekli olan ise süspansiyon hücrelere RT az 5 dakika fiksasyon gerektirir. Biz bu boyama hemen genellikle yüksek eşiğe sonuçları -20 ° C sabit slaytlarını depolamak daha iyi sonuçlar veren bulabilirsiniz. <ol start="8"><li> Her biri için 5 dakika hücreler PBS ile iki kez yıkayın. </li><li> % 0.1 5 dakika RT Triton-X 100 hücreleri Permeabilize. </li></ol> Tween-80 ile karşılaştırıldığında genellikle Triton-X 100 ile permeabilize hücrelerin daha iyi sinyaller gözlemliyoruz. Hücre tipine bağlı olarak permeabilisation saatini değiştirmek için gerekli olabilir. Örneğin 15 dakikalık bir permeabilization yapışık hücrelere gerekli ise, K562 hücrelerinde permeabilization RT az 5 dakika yeterli. <ol start="10"><li> Her biri için 5 dakika hücreler PBS ile üç kez yıkayın. </li><li> RT 30 dakika (3 x 10 dakika)% 1 BSA hücrelerin engelleyin. </li></ol> Biz engelleme verimliliği serum (sekonder antikor olarak aynı türün türetilmiştir) ve PBS sığır serum albumin kullanılarak karşılaştırıldı. BSA serum göre sekonder antikor non-spesifik bağlanma en aza indirerek daha verimli oldu. Biz bir gecede 4 engelleme, farklı engelleme kez karşılaştırıldığında ° C 3 x 10 dakika ve 3 x 20 dakika oda sıcaklığında engelleme adımları ve 3 x 10 dakika süreyle bloke en uygun olduğu belirlenir. <ol start="12"><li> Her bir slayt: 50 mcL primer antikor (500% 1&#39;lik BSA ile seyreltilmiş 1) ekleyin. </li></ol> Bir gecelik inkübasyon kıyasla azaltılmış arka plan boyama 60 dakika sonuçlar için RT primer antikor ile Kuluçka 4 ° C <ol start="13"><li> Aynı anda farklı türleri (örneğin, bu örnekte, fare ve tavşan anti-γH2AX anti-metil H3K4) yükseltilmiş antikorları farklı belirleyicileri leke kullanın. </li><li> 90 dakika için 250 rpm&#39;de sallanan platform üzerinde RT primer antikorlar ile inkübe edin. </li></ol> Tüm inkubasyon nemlendirilmiş bir boyama çukurda yapılır. <ol start="15"><li> Her biri için 5 dakika hücreler PBS ile üç kez yıkayın. </li><li> 50 mcL ekleyin (1: 1000% 1&#39;lik BSA ile seyreltilmiş) ikincil antikor her slayt. </li></ol> D ile aynı slayt üzerinde farklı belirteçleri leke sekonder antikorlarifferent türlere göre (primer antikor göre) ve floresan emisyon dalga boyu (örneğin anti-fare Alexa 488 (yeşil) ve bu örnekte anti-tavşan Alexa-546 (kırmızı)). <ol start="17"><li> Hücreleri, 250 rpm&#39;de sallanan platform üzerinde RT 60 dakika inkübe edin. </li></ol> Solma ve ikincil antikor kurumasını önlemek için bir karanlık nemli odasında hücreleri inkübe tavsiye edilir. <ol start="18"><li> Her biri için 5 dakika hücreler PBS ile üç kez yıkayın. </li><li> Her bir slayt (PBS içinde seyreltilmesi 1:500) TOPRO-3 50 mcL ekleyin. </li><li> 3X 5 dakika PBS ile slaytlar yıkayın. </li><li> Slaytlar aşırı neme kaldırın ve anti-solmaya çözüm ekleyin. </li></ol> Bu hücreler tamamen anti-solmaya çözüm eklemeden önce kuruması için tavsiye edilir. <ol start="22"><li> Lamel, tırnak cilası mühür ve oda sıcaklığında karanlık bir gecede slayt terk. </li></ol> Konfokal özel lamelleri # 1.5 (0,16-19 mikron kalınlığında) ve net oje kullanmanız tavsiye edilir. Slayt lamel yerleştirerek, bakım, hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için alınmalıdır. Görüntü elde etme <ol><li> A Zeiss LSM510 Meta Konfokal Mikroskop standart GFP (yeşil, 488 nm), PI (kırmızı 543 nm) ve çok kırmızı (mavi 633 nm) lazerler kullanarak görüntüleri elde etmek için kullanılır. </li></ol> Görüntüler mekansal çözünürlükte daha iyi ortaya bir konfokal mikroskop kullanılarak elde etti. ΓH2AX odaklarının boyutu 0.5 μicrons daha düşük olabilir, Z-ekseni boyunca en az bir 0.5 μicron adım boyutu ile görüntüler elde etmek için tavsiye edilir. 63 x immersiyon yağı objektif lens daha yüksek veya daha düşük bir büyütme göre tercih edilir. Sayma odakları için görüntüleme birçok hücre için bir tarama hızı ve 1024 x 1024 piksel görüntü boyutu 8 kullanmak için tercih edilir. 6 kişilik bir tarama hızı 2048 x 2048 piksel görüntü boyutu ile kullanılması tavsiye edilir farklı nükleer proteinler arasındaki mekansal ilişkiyi göstermek için. Birden fazla kanal görüntüleme line-scan satın alma, bir çerçeve tarama göre tavsiye edilir. Bu beyazlatma önler ve daha iyi çözünürlük elde edilir. Sıralı tarama yoluyla kanallar arasında kanama önlemek için kullanılır. Odaklar sayım Görüntü analizi ve odaklar sayma, çeşitli yazılım paketleri (Metamorph, Resim-J ve Imaris inlcuding) kullanılarak yapılabilir. Metamorph kullanarak odakları sayma için prosedürü burada açıklanmıştır. <ol><li> Dosya menüsünde doğrudan veya yapı numarası yığınlarının seçeneğini kullanarak açın γH2AX görüntü yığınları. </li><li> Süreç menüsüne gidin ve yığın aritmetik seçti. </li><li> Maksimum projeksiyon seçti ve dahil edilecek uçakların seçin ve Tamam&#39;ı tıklatın. </li><li> ΓH2AX Tiff olarak ortaya çıkan görüntü kaydetme. TOPRO-3 (mavi), resim dosyası ve açın. </li><li> Bölgelere gidin ve bir bölge çizim aracı seçin ve çekirdekleri etrafında bölgelerde çizin. </li><li> ΓH2AX Tiff resmin üzerine tıklayın ve süreç menüsüne gidin ve morfolojik filtreler seçin. </li><li> Top-Hat seçti ve kaynak görüntü olarak γH2AX görüntü seçin. </li><li> Uygula Top-Hat filtresi ve sonuçta elde edilen görüntü odakları yoğunluğu daha az gürültü ve daha az varyasyon ile ikili bir görüntü olacak. </li></ol> Top-Hat değerleri seçerken dikkatli olmalıdır. Optimal değerler filtreler uygulayarak önce ve sonra görüntüleri görsel karşılaştırılması ile elde edilebilir. <ol start="9"><li> Süreci menüsüne gidin ve eşik görüntü seçin. </li><li> Dahil eşiği seçin ve alt ve üst eşik değerleri seçin. </li></ol> Genellikle odakları sayısını etkiler eşik değerleri. Bu nedenle, eşik değerleri seçerken çok dikkat gereklidir. Bu en iyi 2 Gy γ-radyasyon daha düşük maruz kalan hücrelerde farklı eşik değerleri kullanarak sayma odaklar numarası elde etti ve daha sonra manuel sayma (göz) ile odaklar sayıları karşılaştırmak olabilir. Optimal eşik değeri, arka plan dahil en aza indirir ve odaklar dahil en üst düzeye çıkarır biridir. <ol start="11"><li> TOPRO-3 görüntü seçin ve bölgeler menüsüne gidin ve transfer bölgelerde seçeneğini seçin. TOPRPO-3 kaynağı olarak görüntü ve Top-Hat gibi bir hedef seçin ve Tamam düğmesini tıklatın. </li><li> Bir kere nükleer bölgelerde önlem menüsüne gidin ve Entegre morfometrisi Analizi seçin Top-Hat görüntü aktarılır. </li><li> Alana göre pop-up pencere seçeneğini seçin kaynak görüntü-Top-Hat ve ölçü. </li><li> Bütün bölgeler ölçmek seçin ve önlem Top-Hat görüntü ilgili çekirdeğinin tüm odakları numarası almak için tıklayın. </li><li> Her bölgede odaklar numaraları günlük veri seçeneğini kullanarak bir MS-Excel dosyası içine ihraç edilebilir. </li></ol> 3Dgörüntüleri yeniden Metamorph kullanarak yığından bir 3D görüntü oluşturmak için: <ol><li> Yığını menüsüne gidin ve 3 boyutlu rekonstrüksiyon seçin. </li><li> Dönme açısı (örneğin 160 °, 320 °) seçin. </li><li> 3D rekonstrüksiyon tip maksimum seçin. </li><li> Dönme düzlemi (yatay veya dikey) seçti. </li><li> Z-kalibrasyon mesafe seçti. </li></ol> (Optimal 0,5 μicrons) Z mesafe belirtilen kullanıcı için tercih edilir. <ol start="6"><li> 3D yeniden oluşturmak için Tamam&#39;ı seçin. </li></ol> Hat tarama analizi Metamorph kullanarak hat tarama analizi için: <ol><li> Tek bir düzlemde görüntü veya yığılmış bir dosya açın. </li><li> Ölçmek araç çubukları komutu gidin ve line-scan analizi seçin. </li><li> Hücre arasında bir çizgi çizin ve bu hattı, yol boyunca otomatik olarak her marker floresan ve mesafe ortaya koyacaktır. </li></ol> Çeşitli kromatin belirteçlerin mekansal ilişki aydınlatmak için, örneğin, γH2AX odakları ve histon metilasyonu, bu belirteçler yoğun ve yoksul bölgelerde yayılan çizgiler çizmek için tercih edilir. Temsilci Veri Bu gösteri amaçla aktif ökromatin transkripsiyonu epigenetik belirleyici DSBs mekansal dağılımını değerlendirmek, γH2AX odakları ve H3K4me antikorlar kullanılır. 2Gy ile ışınlama aşağıdaki Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi, γH2AX odakları H3K4me hem boyama ve TOPRO-3 leke DNA (parlak boyanan DNA bölgeleri heterokromatin göstergesi) donuk olan bölgelerde ağırlıklı olarak kurdu. <img src="/files/ftp_upload/2203/2203fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Iyonlaştırıcı radyasyon yanıt ökromatin ağırlıklı olarak Şekil 1. γH2AX odakları formu. Insan erythroleukemic K562 hücrelerinde γH2AX odakları (yeşil) (A) İmmünofloresan görselleştirme, γ-ışınlama 1 saat sonra (2 Gy). γH2AX odakları aktif ökromatin (kırmızı) transkripsiyonu temsil eden, H3K4me ilgili gösterilmiştir. DNA TOPRO-3 (mavi) olarak etiketlenir. Birleştirilen görüntünün (mavi, kırmızı ve yeşil) heterokromatik bölgelerden dışlama γH2AX odakları göstermektedir. Line-scan analizi (floresan vs mesafe), tek bir düzlemde belirteçlerin göreceli bir dağılım gösterir. (B) Birleştirilen görüntünün 3 boyutlu rekonstrüksiyon farklı düzlemlerde Dilimleri yukarıda anlatılan.

<ol>
	<li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo.">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).</li><li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139.">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li><li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Rev Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li><li>Dickey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX:+functional+roles+and+potential+applications.">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li><li>Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+is+refractory+to+gamma-H2AX+modification+in+yeast+and+mammals.">Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals.</a> J Cell Biol. 178 (2), 209-218 (2007).</li><li>Cowell, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gammaH2AX+foci+form+preferentially+in+euchromatin+after+ionising-radiation.">gammaH2AX foci form preferentially in euchromatin after ionising-radiation.</a> PLoS One. 2 (10), e1057-e1057 (2007).</li><li>Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., &amp;amp, I. l. i. a. k. i. s., G, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-H2AX+in+recognition+and+signaling+of+DNA+double-strand+breaks+in+the+context+of+chromatin.">Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin.</a> Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).</li><li>Vasireddy, R. S., Karagiannis, T. C., El-Osta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gamma-radiation-induced+gammaH2AX+formation+occurs+preferentially+in+actively+transcribing+euchromatic+loci.">gamma-radiation-induced gammaH2AX formation occurs preferentially in actively transcribing euchromatic loci.</a> Cell Mol Life Sci. 67 (2), 291-294 (2010).</li><li>Goodarzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+signaling+facilitates+repair+of+DNA+double-strand+breaks+associated+with+heterochromatin.">ATM signaling facilitates repair of DNA double-strand breaks associated with heterochromatin.</a> Mol Cell. 31 (2), 167-177 (2008).</li></ol>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640)</td>
<td>Growth medium</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>22400071</td>
<td>RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20&#x03BC;g/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N&#x2019;-2-Ethanesulfonic Acid</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F2442</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A7906</td>
<td>BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS (without Ca2+ and Mg2+)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17-517Q</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypan blue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>T6146</td>
<td>Used to distinguish between live and dead cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T8787</td>
<td>Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>158127</td>
<td>Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody</td>
<td>Primary Antibody</td>
<td>Millipore, USA</td>
<td>16193</td>
<td>Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>HistoneH3 (Mono-methyl K4) </td>
<td>Primary Antibody</td>
<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
<td>AB8895</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
<td>Secondary Antibody</td>
<td>Invitrogen, USA</td>
<td>11029</td>
<td>Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
<td>Secondary Antibody</td>
<td>Invitrogen, USA</td>
<td>11035</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TOPRO3</td>
<td>DNA Stain</td>
<td>Invitrogen, USA</td>
<td>T3605</td>
<td>TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser. </td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold </td>
<td>Anti-fade solution</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index.</td>
</tr>
<tr>
<td>Polylysine slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Menzel-Gl&#228;ser, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslips (22x50mm)</td>
<td>Coverslips</td>
<td>Menzel-Gl&#228;ser, Germany</td>
<td>CS2250100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue Culture Flask, Vented Cap</td>
<td>Culture Flask</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353112</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Shandon Cytospin 4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ThermoElectron Corp</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytofunnels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Shandon, Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Filter Cards </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Shandon, Inc</td>
<td>353025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coplin Jar, glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>1771-OG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining Trough</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>V1991.99</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PAP Pen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zymed Laboratories, Invitrogen</td>
<td> 008877</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gammacell 1000 Elite Irradiator</td>
<td>Gamma Irradiator</td>
<td>Nordion International Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zeiss LSM 510 Meta Confocal</td>
<td>Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm.</td>
</tr>
<tr>
<td>Metamorph</td>
<td>Software for Imaging analysis</td>
<td>Molecular Devices, USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

evaluation of the spatial distribution of &gamma;h2ax following ionizing radiation

Histon H2AX 1,2 terminal SQEY motifi içinde Ser-139 kalıntı DNA çift iplikli sonları (DSBs) bir erken moleküler yanıt fosforilasyon. H2AX Bu fosforilasyon fosfatidil-inosito 3-kinaz (PI3K) proteinleri aile, ataksi telenjiektazi mutasyona uğramış (ATM), DNA-protein kinaz katalitik subunit ve ATM ve RAD3 ilgili (ATR) 3 aracılı. ΓH2AX olarak anılacaktır H2AX fosforile formu, immunofluorecence mikroskopi 3 kolayca görselleştirildiği ayrık odaklar, şekillendirme, DSB sitesinden kromatin komşu bölgelere yayılıyor. ΓH2AX odakları Analizi ve kantitatif DSB oluşumu ve onarım, özellikle iyonlaştırıcı radyasyon yanıt ve bileşikleri ve sitotoksik bileşikler 4 değiştirerek çeşitli radyasyon etkinliğini değerlendirmek için yaygın olarak değerlendirmek için kullanılır olmuştur. DSBs bu de novo marker zarif özgüllük ve duyarlılık göz önüne alındığında, kromatin bağlamında DNA hasarı ve onarım süreçleri içine yeni anlayışlar sağladı. Örneğin, radyasyon biyolojisi merkezi paradigma nükleer DNA radyasyon hassasiyeti açısından kritik bir hedef olmasıdır. Gerçekten de, bu alanda genel bir fikir birliği, homojen bir şablon olarak DNA hasarı ve onarımı için kromatin görünüm için büyük ölçüde olmuştur. Ancak, DSBs moleküler marker ökromatin ve heterokromatin γ-ışınlama indüklenen γH2AX odaklarının oluşumu bir eşitsizlik olarak γH2AX kullanımı ile 5-7 görülmüştür. Son zamanlarda, biz antikorların bir panel ya da mono-, di-kurucu heterokromatin ve transkripsiyonel susturulması ve lizin 4 epigenetik diziniz (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3 veya lisin 9 tri-metil histon H3 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) ), sıkıca iyonlaştırıcı radyasyon 8 γH2AX uzamsal dağılımını araştırmak euchromatic bölgelerde aktif transkripsiyon ilişkili olduğu. Kromatin biyolojisi ile ilgili hakim fikirleri doğrultusunda, bizim bulgular γH2AX oluşumu ve aktif transkripsiyon 9 arasında yakın bir ilişki göstermiştir. Burada diğer epigenetik belirteçler, görüntü analizi ve 3D modelleme ile co-lokalizasyon belirli bir odak, yapışmaz hücreleri γH2AX odaklarının tespiti ve kantitatif için immünofloresan yöntemi göstermek.

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of the Spatial Distribution of Î³H2AX following Ionizing Radiation at JoVE.com

Evaluation of the Spatial Distribution of &amp;#947;H2AX following Ionizing Radiation

DNA çift iplikli tatili yanıt Ser-139 H2AX fosforilasyon aşağıdaki formu γH2AX odakları, mikroskobik analiz radyasyon biyoloji paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Burada çekirdeğin içinde radyasyona bağlı γH2AX oluşumu uzamsal dağılımını değerlendirmek için, aktif transkripsiyonu ökromatin bir epigenetik işaretleyici olarak mono-metil histon H3 lizin 4 antikor kullanılır.

Radyasyondan aşağıdaki γH2AX Mekansal Dağılımı Değerlendirilmesi

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

evaluation-spatial-distribution-h2ax-following-ionizing

Research

JoVE Journal

Biology

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

12.6K Görüntüleme.  The Alfred Medical Research and Education Precinct. DNA çift iplikli tatili yanıt Ser-139 H2AX fosforilasyon aşağıdaki formu γH2AX odakları, mikroskobik analiz radyasyon biyoloji paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Burada çekirdeğin içinde radyasyona bağlı γH2AX oluşumu uzamsal dağılımını değerlendirmek için, aktif transkripsiyonu ökromatin bir epigenetik işaretleyici olarak mono-metil histon H3 lizin 4 antikor kullanılır.

Video: Evaluation of the Spatial Distribution of &#947;H2AX following Ionizing Radiation

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

İyonlaştırıcı Radyasyon Cevabı γH2AX Foci Kantitasyonu

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Biyoloji

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

Üretimi C. elegans Recombineering yoluyla transgenlerin GalK Seçilebilir Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.

Eksplantasyon Kültüründe Diş mikropların Geliştirme takiben için Dilim Kültür Yöntemi

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Ününüz Aşağıdaki Tek Hücre Düzeyinde Küresel RNA Sentezi Analizi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

Tütün Geçici İfade Sisteminin Kullanılması bir MAPK sinyal yolu Mekansal Reorganizasyon Görüntüleme

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

We describe a modified method for membrane fraction isolation from human cells and sample preparation for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further introduce a GFP-labeling method to monitor SCAP trafficking using confocal microscopy. This protocol can be used in regular biology laboratories.

Scap analizi<em&gt; K</em&gt; İnsan Hücreleri -glycosylation ve Ticareti

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro and in vivo. Fluorescent probes are particularly useful in determining the bio-distribution of administered large molecules, where the addition of a small-molecule fluorescent label is unlikely to affect the kinetics or bio-distribution of the compound. A variety of methods exist to examine bio-distribution that vary significantly in the amount of effort required and whether the resulting measurements are fully quantitative, but using multiple methods in conjunction can provide a rapid and effective system for analyzing bio-distributions.
Ex vivo whole-organ imaging is a method that can be used to quickly compare the relative concentrations of fluorescent molecules within tissues and between multiple types of tissues or treatment groups. Using an imaging platform designed for live-animal or whole-organ imaging, fluorescence within intact tissues can be determined without further processing, saving time and labor while providing an accurate picture of the overall bio-distribution. This process is ideal in experiments attempting to determine the tissue specificity of a compound or for the comparison of multiple different compounds. Quantitative tissue histology on the other hand requires extensive further processing of tissues in order to create a quantitative measure of the labeled compounds. To accurately assess bio-distribution, all tissues of interest must be sliced, scanned, and analyzed relative to standard curves in order to make comparisons between tissues or groups. Quantitative tissue histology is the gold standard for determining absolute compound concentrations within tissues.
Here, we describe how both methods can be used together effectively to assess the ability of different administration methods and compound modifications to target and deliver fluorescently labeled molecules to the central nervous system1.

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex vivo whole-organ imaging is a rapid method for determining the relative concentrations of fluorescently labeled compounds within and between tissues or treatment groups. Conversely, quantitative fluorescence histology, while more labor intensive, allows for the quantification of the absolute tissue levels of labeled molecules.

Kullanımı<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tüm organ Görüntüleme ve Kantitatif Doku Histoloji floresan etiketli Moleküllerin Biyo-dağılımını belirlemek için

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved in humans and are associated with metabolic syndrome or other diseases. Examination of lipid accumulation in this organism can be carried out by fixative dyes or label-free methods. Fixative stains like Nile red and oil red O are inexpensive, reliable ways to quantitatively measure lipid levels and to qualitatively observe lipid distribution across tissues, respectively. Moreover, these stains allow for high-throughput screening of various lipid metabolism genes and pathways. Additionally, their hydrophobic nature facilitates lipid solubility, reduces interaction with surrounding tissues, and prevents dissociation into the solvent. Though these methods are effective at examining general lipid content, they do not provide detailed information about the chemical composition and diversity of lipid deposits. For these purposes, label-free methods such as GC-MS and CARS microscopy are better suited, their costs notwithstanding.

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Nile red staining of fixed Caenorhabditis elegans is a method for quantitative measurement of neutral lipid deposits, while oil red O staining facilitates qualitative assessment of lipid distribution among tissues.

Lipid bolluk ve değerlendirme Lipid dağılımı Nil kırmızı ve O kırmızı petrol boyama tarafından Caenorhabditis elegans miktar

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.

Ortovoltage (40-300 kV) X-Ray İmkanları Kullanılarak Hücre Işıtması için Dozimetri

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose ...

Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) human corneal epithelial cell cultures. Cells were exposed to UV radiation and toxic doses of benzalkonium chloride (BAK), hydrogen peroxide (H2O2), and sodium dodecyl sulfate (SDS). Metabolic activity was measured using a metabolic assay. The release of inflammatory cytokines was measured using a multi-plex interleukin (IL)-1&#946;, IL-6, IL-8, and tumor necrosis factor-alpha (TNF-&#945;) assay, and cells were evaluated for viability using fluorescent dyes. 
The damaging effects of UV on cell metabolic activity and cytokine release occurred at 5 min of UV exposure for iHCEC and 20 min for pHCEC. Similar percent drops in metabolic activity of the iHCEC and pHCEC occurred after exposure to BAK, H2O2, or SDS, and the most significant changes in cytokine release occurred for IL-6 and IL-8. Microscopy of fluorescently stained iHCEC and pHCEC BAK-exposed cells showed cell death at 0.005% BAK exposure, although the degree of ethidium staining was greater in the iHCECs than pHCECs. Utilizing multiple methods of assessing toxic effects using microscopy, assessments of metabolic activity, and cytokine production, the toxicity of UV radiation and chemical toxins could be determined for both primary and immortalized cell lines.

This article describes the procedures used to evaluate the toxicity of UV radiation and chemical toxins on a primary and immortalized cell line.

UV Radyasyonu ve Kimyasallarının Primer ve Ölümsüzleştirilmiş İnsan Kornea Epitel Hücreleri Üzerindeki Toksisitesinin Belirlenmesi

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...