KO ve AC, Amerikan Kalp Birliği hibe ve bir burs tarafından desteklenmektedir. SIB ve RB NIH hibe ile desteklenmektedir.

<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1435/SOHA_overview.pdf">Yarı otomatik kalp atışı analizi (Soha) prosedürünün bir bakış görmek için buraya tıklayın.</a> Yarı-otomatik optik kalp atışı analizi 1. Önişlem - Bu adım, diyastolik ve sistolik kalp çapları hakkında bilgi sağlar. Kalp kenarları maksimum diyastol ve sistol sırasında tespit ve işaretlenir. Optik kayıtları bile düşük hızlarda ve maksimal kalp kasılma ve gevşeme meydana gelen kare kesin kimlik sağlayan bir zamanda bir kare ileri olabilir. Bir çift, sistolik kenarları tespit diyastolik kenarları ve bir çift tespit işaretleri yapılır. Marks kalp boyunca farklı yatay noktada iki nüsha halinde de yapılabilir. Bu adımda elde edilen kalp çapları aynı zamanda kalp kontraktilite bir tahmin sağlar ek bir ölçüm hesaplamak için kullanılır. Bu tedbir, yüzde fraksiyonel kısalma (FS) ve kalp bir daralma sırasında kenarları birbirine doğru hareket ölçüde temsil eder. % FS hesaplamak için kullanılan formül: (((Diyastolik çapı sistolik çapı) / diyastolik çap) x 100) Not - Bu sette tespit noktaları sadece çap ve fraksiyonel kısalma ölçümleri için kullanılır ve hareket algılama için kullanılmaz. Örnek: (. Cammarato, ve ark 2008) Drosophila olarak nokta mutasyonlarının miyozin ağır zincir en transdüser etki alanı bilinen bir bölgedir motorun enzimatik aktivite, onlar miyozin Kullanıcı ATPaz aktivitesi bastırmak veya geliştirmek olmadığını sırasında bağlı dilate veya kısıtlı olan kalpleri neden modüle için . Bu tür ölçümler bu manikür ve yağ ile kalp tüp tüm uzunluk boyunca kalp kenarları belirlemek için genellikle mümkün değildir. Olarak (wild tip karşılaştırmak, D45 ve Mhc5 &quot;M-mod M-modları, bozulmamış sinekler yapılmış olması değil. normal kalp çevreleyen aşağıdaki Şekil). Sağlam sinekler kalp görselleştirme diğer yaygın istihdam yöntemleri ile yapılan ölçümler genellikle kalbin en ön kısmı, konik odasına bölge sınırlıdır. Bu sabit dokusunda bu dinamik ölçüm elde etmek de mümkün değildir. 2. Hareket Algılama Bu adım, program tarafından otomatik olarak yapılır ve her film hareketini analiz etmek için iki farklı algoritmalar kullanır. Kısaca, ilk algoritma, &quot;Ortalama Kare Darkness&quot; algoritması çerçeve yaklaşımı ile bir çerçeve kullanır. Bu algoritma ortalamaları bütün bir film karesi için karanlık yoğunluğu, 0 ile 1 arasında bir aralık değeri normalleştirir ve araziler zamanla filmdeki her kare için ortalama normalize. İkinci yaklaşım, &quot;Pixel Pixel&quot; algoritması, bir kare diğerine bireysel piksel karanlıkta değişim analiz eder. Önceden ayarlanmış bir eşiğin üzerinde yoğunluk değişiklikleri sergiler Piksel her kare için toplanır ve zamanla film her çerçeve çizilmiştir. 3. Aralıkları-Check Iki hareket algılama algoritmaları çıktı, çıktı penceresinde &quot;piksel piksel&quot; üzerinde bir pencerede görüntülenen &quot;Ortalama Darkness&quot; çıkışı ile bu modül görüntülenir. Algılama aralıkları biz doğrudan algoritması çıkış pencereleri altında analiz edilen karelerden oluşan bir kenar izleme veya M-mod görüntüler gerçek film hareketi ile kabul emin olmak için. M-mod, dijital kalp yoluyla film her çerçeve dilim bir piksel genişliğinde kesme ve zamanla kalp kenar hareketlerin bir anlık sağlamak için yatay hizalama yapılır. Piksel piksel &quot;pencere&quot; olarak tanımlanan diyastolik aralıklarla bu aralık doğrudan yukarıda katkıda kare sayısı ile yatay bir yeşil çizgi ile gösterilir. Sistolik aralıklarla birbirini izleyen iki diastoles arasındaki zaman aralığı olarak tanımlanır. Dikey bir mavi çizgi ile M-mod belirtilen bir sistol başında ve sonunda dikey bir kırmızı çizgi ile gösterilir. Bu ekran sayesinde algoritma çıkışı gerçek kalp hareketleri ile aynı fikirde olmadığını görmek için nispeten kolaydır. Hareket algılama otomatik olarak gerçekleştirilir rağmen çıkış doğruluğu kontrol edilmelidir. Bunun birkaç nedeni vardır; biri, çoğu zaman altta yatan bir kalp hareketi ile ilgili ışık düzeyleri, yavaş dalga dalgalanma olmasıdır. Bu genellikle dahili bir yüksek geçiren filtre kullanımı ile ortadan kaldırılabilir. Ikinci bir nedeni yaklaşım &quot;piksel piksel&quot; hassasiyeti ile ilgisi var. Bu algoritma çıktısı genellikle bir kasılma hareketi için ve gevşeme hareketleri için bir iki hareket izleri. Büyük sinekler ve bazı mutantlar süresini bu iki hareket arasında<html> nispeten uzun olur ve program iki ayrı vuruş olarak iki hareket yorumlamaya çalışır. Bu, &quot;Use karanlığa&quot; kutusunu tıklatarak, Ortalama Kare Darkness algoritması ile Pixel Pixel algoritma ile çıktı karşılaştırmak için program sorarak düzeltilebilir. Örnek (Video bakınız): 5 ila 7 hafta içinde sistolik aralıklarla genellikle genç sinekler daha uzun uçar. Bu uzun aralıklarla başlangıçta kısa bir diyastol tarafından ayrılmış iki ayrı kasılmaları olarak algılanır. Bu &quot;Kullanım karanlık&quot; onay kutusunu seçerek düzeltilebilir. Bu durumda program Ortalama Kare Darkness çıkışı ile Pixel Pixel algoritma ile belirlenen diyastolik aralığı karşılaştırmak gerekecektir. Ortalama Kare Darkness çıkış, pozitif bir değer varsa, daha sonra diyastolik aralığı Pixel Pixel algoritma ile belirlenen herhangi bir ihmal ve aralıklarla doğru belirtilmiş olacaktır. Tüm film, 10 saniyelik segmentlerinde taranır ve kabul edilen (&quot;Tamam Verileri&quot; tıklayın) veya (&quot;Veri Çıkart&quot; tıklayın) reddedilmiş olabilir. Hi ve Lo pass filtre hassasiyetleri Darkness algoritması istihdam daralma aralıkları tanımlamak daha doğru bir şekilde yardımcı olmak için elle ayarlanabilir. 4. Çıkış İstatistikleri Belirli bir film için çıkış kabul edildikten sonra program otomatik olarak bir parametre sayısını hesaplamak için bu bilgileri kullanacağız. Bunlar sistolik ve diyastolik aralığı, kalp süresi ve kalp hızı, yönü ve daralma dalgası, kalp çapları ve% FS hızı. Buna ek olarak, program, üniform olmayan daralma ve gevşeme döngüsü (Fink ve ark, 2009) yansıtan arrhythmicity ölçülmesi için birden çok yöntem vardır. Istatistik çıktı ve ayrı ayrı her film için ve Microsoft Excel gibi elektronik tablo programları açılabilir virgülle ayrılmış değer (csv) dosyası şeklinde tüm veri sağlanmaktadır. Tablo 1 - <img src="/files/ftp_upload/1435/1435table1.jpg" alt="tablo1" /> Yarı-otomatik Optik Kalp Analizi programı tarafından oluşturulan çıktı bir örnek. 5. Güncelleme Histogramlar- Programın bu bölümü histogram formatında bir veri kümesi için kalp aralıklarla tüm verileri görüntüler. Kalp hızları değişken olduğundan histogram çıkış verileri normalize. Ancak, dağıtım aralıkları etrafında simetrik değildir çünkü normalleşmesi için ortanca aralık değeri kullanmak demek. Örnek (Video bakınız): KCNQ potasyum kanal için mutant Sinekler, son derece düzensiz diyastolik ve sistolik aralıklarla göstermektedir . Genellikle sistolik aralıkları çok daha uzun ve yaş eşleştirilmiş wild tip sinekler daha düzensiz. Bu açıkça (Ocorr ve ark ayrıca bkz 2007) histogram formatında verileri görüntülemek tarafından görülebilir. 6. M-mod- Bu modül, M-modları film çerçeve içinde kalp boyunca herhangi bir pozisyonda yapılabilir üretir. M-mod uzunluğu da belirtilebilir. M-mod da kalbinde bir film yaptığını niteliksel olarak göstermek için yararlıdır. Örnek (Video bakınız): 3 günlük eski bir M-mod oluşturmak için kullanılan ön ventrikül gösteren bir Zebra balığı larva kalp Film. Elektronik, her bir film karesinden eksize olacak piksel dikey dilim kırmızı bir çizgi ile gösterilir. M-mod Şekil: Drosophila ve zebrafish M modları örnekleri. Hızlı kalp kısıtlama enzim kinetiği ve bazen bir iletim bloğu ile bir moleküler motor Süreç Öncesi adım sonuçları tartışılmıştır miyozin mutasyonlar biri. Her iki parametre de niteliksel M-modları kullanılarak gösterilebilir. <img src="/files/ftp_upload/1435/1435fig1.jpg" alt="M-modları örnekleri" /> Wild tip ve mutant sinekler hem de kalbin aynı kısmında yapılan M-modları açıkça MHC 5 mutant ve dilate çap ve (depresif enzim kinetiği ile miyozin ifade) D45 mutant aritmik daralma çevrimleri kısıtlı fenotip gösterebilir (modifiye Cammarato ve arkadaşları, 2008). Ön ventrikül (aynı kalp film, gösteri, Fink ve diğerleri 2009 gösterildiği gibi) gösteren bir Zebra balığı larva kalp yapılan M-mod. 7. Red Dot Film Bu modül, otomatik kırmızı değişen olarak tanımlanan tüm pikselleri gösteren bir analiz film yavaşlamış bir (1:4), 20 ikinci versiyonu üretir. Bu özellik, esas gösterim amaçlı kullanılır. Film 1 - kırmızı program algoritmaları ile karanlık yoğunluğunu değiştirir olarak tanımlanır piksel gösteren bir &quot;kırmızı nokta film&quot;. 4 faktör orijinal film hızı yavaşlamıştır. w.jove.com/files/ftp_upload/1435/redmove.avi &quot;&gt; Movie 1 indirmek için buraya tıklayın. 8. Ek Uygulamalar Biz genellikle geleneksel metodoloji kullanılarak analiz etmek zor küçük kalpleri ile diğer modelleri yüksek hızlı filmler için bu analitik sistemi uygulamaya başladı. Biz başarıyla Zebra balığı larva kalpleri ve embriyonik fare kalpleri (Fink ve ark, 2009) hem de bu analizi uyguladık. Film 2 - Fare kalbi film artı veri çıkışı ile kontrol aralıkları ile rakam. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1435/Mouse%20heart%20clip%201.avi">Movie 2 indirmek için buraya tıklayın.</a> <img src="/files/ftp_upload/1435/1435fig2.jpg" alt="Fare Kalp Aralıkları kontrol edin" />

<ol>
	<li>Cammarato, A., Dambacher, C. M., Reedy, M. C., Knowles, A. F., Kronert, W. A., Bodmer, R., Ocorr, K., Bernstein, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Transducer+mutations+differentially+affect+motor+function,+myofibril+structure,+and+the+performance+of+skeletal+and+cardiac+muscles.">Myosin Transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles.</a> Mol Biol Cell. 19 (2), 553-562 (2008).</li><li>Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -. S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KCNQ+potassium+channel+mutations+cause+cardiac+arrhythmias+in+Drosophila+that+mimic+the+effects+of+aging.">KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).</li><li>Fink, M., Callol-Massot, C., Chu, A., Ruiz-Lozano, P., Izpisua Belmonte, J. C., Giles, W., Bodmer, R., Ocorr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+detection+and+quantification+of+heartbeat+parameters+in+Drosophila,+zebrafish+and+embryonic+mouse+hearts.">A new method for the detection and quantification of heartbeat parameters in Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts.</a> Biotechniques. 46, 101-113 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Drosophila modeli embriyolojik gelişim öğrenme ve hafıza arasında değişen çeşitli bilimsel soruları gidermek için kullanılan güçlü bir genetik bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Son zamanlarda bu çok yönlü bir model organizmanın genetik kalp fonksiyonlarının araştırmak için kullanılmaktadır. Yetişkin Drosophila kalp fizyolojisi ölçmek için bir dizi girişimi sağlam sineklerin karın manikür yoluyla yapılan gözlemlere dayanıyordu. Bu yaklaşımların çoğu, tek bir parametre, kalp h...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>MatLab software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Math Works, Inc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Required environment for the analysis software.</td>
</tr>
<tr>
<td>EM-CCD digital camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu Corp.</td>
<td>9100 or 9300</td>
<td>Other high speed digital cameras will also work.</td>
</tr>
<tr>
<td>HC image data capture software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu Corp.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Other image capture software that produces movies in avi format will also work.</td>
</tr>
<tr>
<td>Light Microscope with 10x objective </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A dipping lens that eliminates the air water interface greatly improves resolution</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

semi-automated optical heartbeat analysis of small hearts

Biz yüksek hızlı optik kayıtları analiz etmek için bir yöntem geliştirdi.<em&gt; Drosophila</em&gt; Zebrafish ve embriyonik fare kalpleri (Fink, et al, 2009). Yarı-otomatik Optik Heartbeat Analizi (Soha), bireysel kasılma ve gevşeme olayları ile ilişkili kalp hareketleri algılamak için bir roman hareket algılama algoritması kullanır. Program bir dizi fizyolojik sistolik ve diyastolik aralıklarla, kalp hızı, kalp atışı arrhythmicity yanı sıra kalitatif ve kantitatif tedbirler de dahil olmak üzere ilgili okuma sağlar. Program ayrıca, fraksiyonel kısalma ve fraksiyonel alan değişiklikleri hesaplanır diyastol ve sistol sırasında kalp çap ölçümleri hesaplar. Çıkış, çoğu elektronik tablo programları ile uyumlu bir dijital dosya olarak verilmiştir. Ölçümler, her kalp atışı için rekor bir istatistik çıktı gücünün artırılması yapılır. Biz her kullanıcı girişi için gerekli olan adımları göstermek ve her üç genetik olarak izlenebilir kalp modelleri kalp fonksiyonlarının analizi metodolojisi uygulama göstermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts at JoVE.com

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

Biz yüksek hızlı optik kayıtları analiz etmek için geliştirilen bir Yarı-otomatik Optik Heartbeat Analiz yöntemi (Soha)<em&gt; Drosophila</em&gt; Zebrafish ve embriyonik fare kalpleri. Biz meyve sineği ve embriyonik fare kalpleri kalp fonksiyonu analizi metodolojisi uygulama göstermektedir.

Küçük Kalpler Yarı-otomatik Optik Heartbeat Analizi

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

semi-automated-optical-heartbeat-analysis-of-small-hearts

Research

JoVE Journal

Biology

12.1K Görüntüleme.  The Sanford Burnham Institute for Medical Research. Biz yüksek hızlı optik kayıtları analiz etmek için geliştirilen bir Yarı-otomatik Optik Heartbeat Analiz yöntemi (Soha) Drosophila Zebrafish ve embriyonik fare kalpleri. Biz meyve sineği ve embriyonik fare kalpleri kalp fonksiyonu analizi metodolojisi uygulama göstermektedir.

Video: Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Mikroskop Uygun Bakım ve Temizlik

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Biyoloji

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

Işık Mikroskobu Binbaşı Bileşenleri

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Faz Kontrast ve Diferansiyel Girişim Kontrast (DIC) Mikroskopi

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Langendorff perfüze sıçan Kalpler Optik Haritalama

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

CRISPR/Cas systems mediate adaptive immunity in Bacteria and Archaea. Many Cas proteins are proposed to act as endoribonucleases acting on crRNA precursors of varying length. Here we illustrate three different approaches to generate pre-crRNA substrates for the biochemical analysis of Cas endonuclease activity.

CRISPR / Cas Sistemleri Endonükleazlar için Substrat Üretimi

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the primary photosynthetic organ, and their size and shape vary developmentally and environmentally within a plant. For these reasons studies on leaf morphology require measurement of multiple parameters from numerous leaves, which is best done by semi-automated phenomics tools5,6. Canopy shade is an important environmental cue that affects plant architecture and life history; the suite of responses is collectively called the shade avoidance syndrome (SAS)7. Among SAS responses, shade induced leaf petiole elongation and changes in blade area are particularly useful as indices8. To date, leaf shape programs (e.g. SHAPE9, LAMINA10, LeafAnalyzer11, LEAFPROCESSOR12) can measure leaf outlines and categorize leaf shapes, but can not output petiole length. Lack of large-scale measurement systems of leaf petioles has inhibited phenomics approaches to SAS research. In this paper, we describe a newly developed ImageJ plugin, called LeafJ, which can rapidly measure petiole length and leaf blade parameters of the model plant Arabidopsis thaliana. For the occasional leaf that required manual correction of the petiole/leaf blade boundary we used a touch-screen tablet. Further, leaf cell shape and leaf cell numbers are important determinants of leaf size13. Separate from LeafJ we also present a protocol for using a touch-screen tablet for measuring cell shape, area, and size. Our leaf trait measurement system is not limited to shade-avoidance research and will accelerate leaf phenotyping of many mutants and screening plants by leaf phenotyping.

Demonstration of key methods for high throughput leaf measurements. These methods can be used to accelerate leaf phenotyping when studying many plant mutants or otherwise screening plants by leaf phenotype.

LeafJ: Yarı otomatik Yaprak Shape Ölçüm için bir ImageJ Plugin

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Zebra balığı Embriyolar Doku spesifik Floresans yarı otomatik Görüntüleme

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Isolation of Cardiomyocytes from Fixed Hearts for Immunocytochemistry and Ploidy Analysis

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably identify nuclei of cardiomyocytes on histological sections, many groups rely on isolating viable cardiomyocytes prior to fixation to perform immunostaining. However, these live cardiomyocyte isolation techniques require optimization to maximize the yield, viability and quality of the samples, with inherent fluctuations from sample to sample despite maximum optimization. Here, we report a reproducible protocol, involving fixation prior to enzymatic digestion of the heart, which leads to maximum yield while preserving the in vivo morphology of individual cardiomyocytes. We further developed an automated analysis platform to determine the number of nuclei and DNA content per nucleus for individual cardiomyocytes. After exposing the chest cavity, the heart was arrested in diastole by perfusion with 60 mM KCl in PBS. Next, the heart was fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) solution, and then digested with 60 mg/mL collagenase solution. After digestions, cells were singularized by trituration, and the cardiomyocyte fraction was enriched via differential centrifugation. Isolated cardiomyocytes were stained for Troponin T and &#945;-actinin to assess purity of the obtained population. Furthermore, we developed an image analysis platform to determine cardiomyocyte nucleation and ploidy status following DAPI staining. Image based ploidy assessments led to consistent and reproducible results. Thus, with this protocol, it is possible to preserve native morphology of individual cardiomyocytes to allow immunocytochemistry and DNA content analysis while achieving maximum yield.

The goal of this work is to develop a method to reproducibly isolate cardiomyocytes from the adult heart and measure DNA content and nucleation.

İmmünsitokimya ve Ploidi Analizi için Sabit Kalplerden Kardiyomiyositlerin İzolasyon

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably ...

Quantitative Analysis of Viscoelastic Properties of Red Blood Cells Using Optical Tweezers and Defocusing Microscopy

The viscoelastic properties of erythrocytes have been investigated by a range of techniques. However, the reported experimental data vary. This is not only attributed to the normal variability of cells, but also to the differences in methods and models of cell response. Here, an integrated protocol using optical tweezers and defocusing microscopy is employed to obtain the rheological features of red blood cells in the frequency range of 1 Hz to 35 Hz. While optical tweezers are utilized to measure the erythrocyte-complex elastic constant, defocusing microscopy is able to obtain the cell height profile, volume, and its form factor a parameter that allows conversion of complex elastic constant into complex shear modulus. Moreover, applying a soft glassy rheology model, the scaling exponent for both moduli can be obtained. The developed methodology allows to explore the mechanical behavior of red blood cells, characterizing their viscoelastic parameters, obtained under well-defined experimental conditions, for several physiological and pathological conditions.

Here, an integrated protocol based on optical tweezers and defocusing microscopy is described to measure the rheological properties of cells. This protocol has wide applicability in studying the viscoelastic properties of erythrocytes under variable physio-pathological conditions.

Kırmızı Kan Hücrelerinin Viskoelastik Özelliklerinin Optik Cımbız ve Bulanıklaştırma Mikroskobu Kullanılarak Kantitatif Analizi

The viscoelastic properties of erythrocytes have been investigated by a range of techniques. However, the reported experimental data vary. This is not ...

Murin Beyaz Yağ Dokusunun Yarı Otomatik İzolasyonu

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their mechanisms. Immortalized white preadipocyte cell lines are publicly available and widely used. However, the emergence of beige adipocytes in white adipose tissue in response to external cues is difficult to recapitulate to the full extent using publicly available white adipocyte cell lines. Isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue is commonly executed to obtain primary preadipocytes and perform adipocyte differentiation. However, mincing and collagenase digestion of adipose tissue by hand can result in experimental variation and is prone to contamination. Here, we present a modified semi-automated protocol that utilizes a tissue dissociator for collagenase digestion to achieve easier isolation of the SVF, with the aim of reducing experimental variation, reducing contamination, and increasing reproducibility. The obtained preadipocytes and differentiated adipocytes can be used for functional and mechanistic analyses.

Yazar Spotlight: Murin Beyaz Yağ Dokusundan Stromal Vasküler Fraksiyonun Bir Doku Ayrıştırıcı Kullanılarak Yarı Otomatik İzolasyonu  

This protocol describes the semi-automated isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue to obtain preadipocytes and achieve adipocyte differentiation in vitro. Using a tissue dissociator for collagenase digestion reduces experimental variation and increases reproducibility.

Bir Doku Dissosiyatör Kullanarak Stromal Vasküler Fraksiyonun Murin Beyaz Yağ Dokusundan Yarı Otomatik İzolasyonu

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...