Name: in vitro model of physiological and pathological blood flow with application to investigations of vascular cell remodeling
Uploaded: 2015-11-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling at JoVE.com

Yazarlar (WT HL097246 ve HL119371) AHA (WT 13GRNT16990019) ve NHLBI dahil finansman kaynakları, kabul etmek istiyoruz.

1. Silanizasyon ve Slide biyomoleküler Functionalization veya Polikarbonat Membran Not: Bu protokol kapsamında kimyasalların ve çözümleri çoğu yüksek buharlaşma oranları (etanol (EtOH), aseton, vb) var. Diğer adımlar düşük buharlaşma oranları için uzun inkübasyon süreleri gerektirir. Parafin Film kapları mühür önerilir. Dikkat: (içerir: sülfürik asit, aseton, (3-aminopropil) trietoksisilan, glutaraldehid, EtOH) bulunan kimyasalların bir çoğu tehlikeli ya da uçucu kabul edilir. Kullanmadan önce uygun depolama, taşıma ve bertaraf için her malzemenin malzeme güvenlik bilgi formu (MSDS) başvurun. <ol><li> Tam daldırma sağlanması yönüne bakılmaksızın temiz, cam slayt boyama çanak 1 mm 50 mm 75 mm ölçülerindeki yeni cam slayt, yerleştirin. Adımlarla 1,1-1,12 için kap kullanın. Not: Tüm takip eden ste için, 50 mm 75 mm boyutlarında kesilir 0,4 mikron gözenek boyutu ile ko-kültür için polikarbonat dahil (PC) zarPC işlevsellik ve AK tohumlama için PS. </li><li> Sülfürik asit (% 20), O / N slayt bırakın. Dikkat: Kullanmadan önce sülfürik asit için MSDS danışın. </li><li> , 5 dakikada, üç kez iyonu giderilmiş su içinde (DI) daldırma her DI değiştirerek slayt yıkayın. </li><li> 30 dakika boyunca aseton içinde slayt bırakın. Dikkat: Kullanmadan önce aseton MSDS&#39;ye danışın. </li><li> % 6 (3-aminopropil) trietoksisilan / aseton çözeltisi O / N slayt bırakın. Dikkat: Kullanmadan önce (3-aminopropil) trietoksisilan ve aseton için MSDS danışın. </li><li> Aseton her zaman değişen, 5 dakika, üç kez aseton slayt daldırın. Dikkat: Kullanmadan önce aseton MSDS&#39;ye danışın. </li><li> 5 dakika, üç kez DI daldırma her zaman DI değiştirerek slayt yıkayın. </li><li> 60 dakika boyunca% 1.5 glutaraldehid / DI çözeltide slayt daldırın. Dikkat: Kullanmadan önce glutaraldehit için MSDS danışın. </li><li> 5 dakika, iki kez DI daldırma her zaman DI değiştirerek slayt yıkayın. </li><li> Yer slaytSteril, laminar akış başlığı içinde 30 dakika boyunca% 70 etanol (EtOH) içinde s. </li><li> EtOH çıkarın ve buharlaştırılması için bir tortu geri kalan izin verir. Slaytlar rehydrate amacıyla steril DI ve drenaj slaytlar bırakın. Not: Slaytlar veya PC zar bir haftaya kadar 4 ° C&#39;de cam slayt tutucu mühürlü ve saklanabilir. Hücre kültürü için kullanılması üzerine, tekrar 1.10 ve 1.11 adımları. </li><li> Slayt tutucudan slayt çıkarın ve laminer akış kaputu 100 mm kare petri tarafından 100 mm içine yerleştirin. Not: Bu kap, kalan tüm adımlar için kullanılacaktır. <ol><li> Monokültür deney için endotel hücre tohumlama için slayt veya PC hazırlayın. <ol><li> Coat fonksiyonalize kayar ya da PC, bir tarafta 1 mi fibronektin çözeltisi (25 ug / ml) ile (aşama 1,11), hücre kültür odası maruz yaklaşık alanı kapsayan. </li><li> 1-2 saat boyunca 37 ° C&#39;ye ayarlanmış, steril inkübatör slaytlar veya PC inkübe edin. </li><li> İnkübasyondan sonra, GLA kullanarak kalan çözelti aspireBir vakum bağlı ss aspiratör pipet. Not: Slaytlar hemen ileride kullanılmak üzere 4 ° C sıcaklıkta O / N depolanabilir. </li></ol></li><li> Sadece EC / SMC ko-kültür hazırlanması için 1.12.2 adımları izleyin. Hazırlama ve ortak kültürlenme deney için yumuşak kas hücresi (SMC) kültür tohum. <ol><li> Akış odası, vakum ile uyum 50 mm dış çaplı, 30 mm, 50 mm iç çapı, 0.5 mm kalınlığında 75 mm boyutlarında, ve delikleri olan sürgünün (aşama 1,11) üstünde yer silikon conta. </li><li> % 10 FBS / DMEM süspansiyon içinde 1 mi SMC hazırlayın. 7,% NaHCO 3 ve 7.4 arasında pH 0.1 M NaOH çözeltisi ile 2 mg / ml kolajen tip-I 1 ml solüsyon nötralize ve 2 x 10 6 hücre / ml nihai hücre yoğunluğu ile SMC süspansiyonu ile karıştırılır. </li><li> Conta içindeki SMC çözeltisi yayılır ve 30 dakika boyunca CO2 37 ° C&#39;de inkübe slaytlar ve% 5. </li><li> Kuluçkadan sonra, Modifiye Dulbecco karıştırılır, 25 ml% 0.1 fetal sığır serumu (FBS) ile birlikte slayt kapağı72 saat süre ile Eagle Ortamı (DMEM). </li></ol></li></ol></li><li> Cam slayt / polikarbonat membran üzerine Kültür endotel hücreleri (EC). <ol><li> Tohum cam slayt veya polikarbonat membran fibronektin yüzeylerinde 6,0 x 10 5 hücre / ml başlangıç ​​konsantrasyonunda,% 10 FBS / DMEM içerisinde 1 ml EC. </li><li> 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 &#39;de bir kuluçka hücreleri inkübe ve% 10 FBS 120 dakika karıştırıldı. </li><li> 37 ° C kuluçka makinesi içinde ilave% 10 FBS / DMEM ile hücreleri ve yer ihtiva eden kapak slaytlar, 5% CO2 O / N, 70% -80% konfluent kadar. </li></ol></li></ol> Sıvı Viskozite ve hacimsel Akış Oranının Belirlenmesi 2. Not: Döner viskometreler hassas ekipmanlar ve viskozimetre kullanım kılavuzu, kalibre sıfırlama ya da ölçümler gerçekleştirmeden önce danışılmalıdır. <ol><li> Denemenin hedeflenen damar literatürde istenen sıvı kesme (τ) belirleyin. </li><li> KuvBir döner viskometre kullanılarak e,% 1 FBS / (μ) DMEM viskozitesi. </li><li> Poiseuille denklemi gerekli hacimsel akış hızı (Q) belirleyin: <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/53224/53224eq1.jpg" /> , burada τ = sıvı kayma, μ = viskozite, Q = vol. akış hızı, w = bölme genişliği ve h = odası yükseklik). </li><li> Set pompa adımında 2.3 türetilmiş akış hızı ve sonraki tüm adımlar için kullanın. </li></ol> Pulsatilite İndeksi 3. Belirlenmesi Not: Sistemin içindeki tüm bağlantı portları uygun büyüklükte kilit halkası to-barb veya dişi luer-to-barb bağlantıları ile bağlanmış olması gerekir. Bağlama PVC boru daha sonra diken parçaları bağlanabilir ve devre tamamladı. <ol><li> Doğru akış yönünde bölme (Şekil 3) ve ultrasonik akış ölçer süspansiyon, Şekil 2&#39;de olduğu gibi akım devresine bağlayın. Ultrasonik debimetre ekipman hassas bir parçasıdır ve Not:Kullanım kılavuzu Kullanmadan önce danışılmalıdır. </li><li> Rezervuar hacmi içinde batık (pompa) rezervuar çıkış borusunu sağlayarak, DI su akış devresi ve haznesini doldurun. Bir akış ölçer kullanılarak akış dalga formu gözünüzde canlandırın. </li><li> Sönümleme odasının açık hava tahliye valfi sıvı / hava hacmi oranını değiştirmek için. Kapat farklı sıvı seviyesi aralıklarında hava tahliye vanası ve hesaplamak pulsatilite indeksi (PI = (V Max - V Min) / V Ortalama) akış dalga tepe (V Max), çukur (V Min) kullanarak ve ortalama (V Ortalama). Notebook Tutanak PI değerleri. </li><li> Mark ileride kullanmak üzere uçlu keçeyi, kalıcı mürekkep kalem kullanarak, sönümleme odasının sıvı seviyesini ve PI sonuçlanır. Patoloji literatüründe 11 istenen PI düzeylerinin belirlenmesi. </li><li> Silikon Tüp Formation- İsteğe bağlı, kontrol pulsatilitesini daha gelişmiş bir yöntem <ol><li> Örneğin (a bas değişik oranlarda silikon elastomer tabanı ve kür ajanı karıştırın1 ila 36&#39;dan: 10: e-to-çapraz bağlayıcı oranı. 1) değişik hedef elastik modülünün için, daha önce açıklandığı gibi 2 </li><li> Kısa bir süre önceden tespit edilmiş bir baz ile çapraz bağlayıcı oranına sahip silikon ön-polimer karışımı içine çelikten bir kanül (14 g), daldırma, tekrar daldırma tedavisi işlemi ile silikon tüp imal. </li><li> Sertleştirme işlemi ortasında yön değiştirme, kanül polimer kaplamayı sertleştirmek üzere 4 saat boyunca 60 ° C&#39;ye ayarlanmış bir fırın içine ön-polimer ile kaplanmış bir kanül yerleştirin. </li><li> Aynı silikon elastomer karışımı ile daldırma işlemi tekrarlayın ve 0.3 ~ in mm kalınlığında borular sonuçları ek 4 saat, geri fırında koyun. </li><li> Paslanmaz çelik kanül gelen ultra ince silikon tüp çıkarın. </li><li> 3.3 Her yerine odasına sönümleme devresi ve test PI akış tüpleri bağlayın. </li></ol></li></ol> 4. Pompa Sterilizasyon <ol><li> 1 akış bölmesini (Şekil 2), PVC boru ve contalar daldırın0% hidrojen peroksit (H2O 2). 4. adımda önce steril DI ile yıkayın. </li><li> Yedek inkübatör rafta kan pompasını yerleştirin. Not: Kuluçka raflar paslanmaz çelik olmalı ve tüm akım devresi ağırlığını taşıyabilecek gerekir. </li><li> Rezervuar hacmi içinde batık rezervuar çıkış borusu (pompa) sağlayarak% 10 H 2 O 2 ile akış devresi ve haznesini doldurun. UV ışığı ile laminer akış başlığı içinde 20 dakika boyunca devre üzerinden pompalanarak O 2 H 2 sirküle. </li><li> Aspire Tüm H2O borudan 2 ve akım devresi üzerinden pompalanarak steril PBS ile yıkayın. </li></ol> 5. Akış Odası Meclisi Not: Akış odacıklı vakum portu ve giriş ve çıkış akış bağlantı noktası (Şekil 2 ye bakınız) ile birlikte, bir akrilik, özel yapılmış levha oluşur. Chamber montaj kültür slaytlar üstüne akış odası ve contaları yerleştirme oluşur proPerly, hizalı ve aşağıda tarif edilmiştir. <ol><li> 37 ° C su banyosunda% 1 FBS / DMEM Isınma ve akış odası hazırlayın. <ol><li> Hücre tarafı yukarı üstünde ve yer conta (adım 1.13) medya üzerinden AK slayt atın. </li><li> (İsteğe bağlı) medya üzerinden PC zarı atın hücre tarafı yukarı üstünde ve yer conta (adım 1.13). PC zarının altında seribaşı SMC (adım 1.12.2) ile birlikte kültür slayt yerleştirin. </li></ol></li><li> Conta deliklerden (Şekil 2) ile akış odasının vakum kanalını hizalayın. </li><li> Vakum hiçbir ortam sızıntı sağlanması vakum portu (Şekil 2) Vakum tüp takın. </li><li> Bahar kelepçeler, akış odasının her tarafında (Şekil 2 ve 5) üzerinde biriyle cam slayt ve kelepçe akış odası tertibatının altındaki yerleştirin polikarbonat levha. </li><li> Talep akışı 37 ° C&#39;de inkübatör içinde sistemi ve% 5 CO2 ve düşük pulsatilitesini doldurulur hazneden pompalayarak ortam ile devre doldurun.Hücrelerin önceden hazırlamak için 4 saat boyunca bu akış koruyun. </li><li> İstediğiniz zaman sıvı belirgin PI seviyesine odasına sönümleme hacim ve kültür ayarlayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Scott-Drechsel, D., Su, Z., Hunter, K., Li, M., Shandas, R., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+flow+co-culture+system+for+studying+mechanobiology+effects+of+pulse+flow+waves.">A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves.</a> Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).</li><li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffening-Induced+High+Pulsatility+Flow+Activates+Endothelial+Inflammation+via+a+TLR2/NF-&#954;B+Pathway.">Stiffening-Induced High Pulsatility Flow Activates Endothelial Inflammation via a TLR2/NF-&#954;B Pathway.</a> PLoS ONE. 9 (7), e102195 (2014).</li><li>Wexler, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+Artery+Calcification:+Pathophysiology,+Epidemiology,+Imaging+Methods,+and+Clinical+Implications+A+Statement+for+Health+Professionals+From+the+American+Heart+Association.">Coronary Artery Calcification: Pathophysiology, Epidemiology, Imaging Methods, and Clinical Implications A Statement for Health Professionals From the American Heart Association.</a> Circulation. 94 (5), 1175-1192 (1996).</li><li>Lan, T. -. H., Huang, X. -. Q., Tan, H. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+fibrosis+in+atherosclerosis.">Vascular fibrosis in atherosclerosis.</a> Cardiovasc Pathol. 22 (5), 401-407 (2013).</li><li>Lee, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+endothelial+recovery+and+reducing+neointimal+hyperplasia+using+sequential-like+release+of+acetylsalicylic+acid+and+paclitaxel-loaded+biodegradable+stents.">Promoting endothelial recovery and reducing neointimal hyperplasia using sequential-like release of acetylsalicylic acid and paclitaxel-loaded biodegradable stents.</a> Int J Nanomedicine. 9, 4117-4133 (2014).</li><li>Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Remodeling+in+Hypertension+Roles+of+Apoptosis+Inflammation,+and+Fibrosis.">Vascular Remodeling in Hypertension Roles of Apoptosis Inflammation, and Fibrosis.</a> Hypertension. 38 (3), 581-587 (2001).</li><li>Greil, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+carotid+artery+flow+velocities+after+stent+implantation:+a+fluid+dynamics+study+with+laser+Doppler+anemometry.">Changes in carotid artery flow velocities after stent implantation: a fluid dynamics study with laser Doppler anemometry.</a> J Endovasc Ther. 10 (2), 275-284 (2003).</li><li>Egorova, A. D., van der Heiden, K., Poelmann, R. E., Hierck, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia+as+biomechanical+sensors+in+regulating+endothelial+function.">Primary cilia as biomechanical sensors in regulating endothelial function.</a> Differentiation. 83 (2), S56-S61 (2012).</li><li>Liu, S. Q., Goldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+blood+shear+stress+in+the+regulation+of+vascular+smooth+muscle+cell+migration.">Role of blood shear stress in the regulation of vascular smooth muscle cell migration.</a> IEEE T Bio-Med Eng. 48 (4), 474-483 (2001).</li><li>Scott, D., Tan, Y., Shandas, R., Stenmark, K. R., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+pulsatility+flow+stimulates+smooth+muscle+cell+hypertrophy+and+contractile+protein+expression.">High pulsatility flow stimulates smooth muscle cell hypertrophy and contractile protein expression.</a> AJP: Lung C. 304 (1), L70-L81 (2013).</li><li>Panaritis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsatility+Index+of+Temporal+and+Renal+Arteries+as+an+Early+Finding+of+Arteriopathy+in+Diabetic+Patients..">Pulsatility Index of Temporal and Renal Arteries as an Early Finding of Arteriopathy in Diabetic Patients..</a> Ann Vasc Surg. 19 (1), 80-83 (2005).</li><li>Miao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Flow+Patterns+on+the+Localization+and+Expression+of+VE-Cadherin+at+Vascular+Endothelial+Cell+Junctions:+In+vivo+and+in+vitro+Investigations.">Effects of Flow Patterns on the Localization and Expression of VE-Cadherin at Vascular Endothelial Cell Junctions: In vivo and in vitro Investigations.</a> J Vasc Res. 42 (1), 77-89 (2005).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokol, in vitro pulsatil akışını taklit için bir yöntem tarif etmektedir ve hastalık patolojilerinde akış koşullarının etkilerini belirlenmesinde etkili ilk adım olabilir. Bu protokolü kullanarak önceki çalışmalar, bu protokol deneyimli laboratuarlar için tasarlanmıştır, akış koşullarının Ayrıca vasküler inflamatuar yanıt. 1, 10 katkıda bulunmuştur. Bunun gibi, ne de derinliği akışkanlar mekaniği, ne de biyokimyasal analizi tarif edilmektedir. Daha g...

Kardiyovasküler hastalıklar için morbidite oranları birçok sağlıksız damar sonuçlanan, Amerika&#39;daki en büyük bulunmaktadır. Sağlıklı arterler bir endotel hücre (AK) tek tabaka ile kaplanmış yumuşak lümen yüzeyi ile, elastik doku oluşur. Arter akışı pozitif ortalama debi ile salınan bir dalga fonksiyonu olarak modellenmiştir olabilir. Pulsatilite indeksi (PI) salınım büyüklüğü bölüm ve ortalama debi (.. PI = (Max - Min) / Ortalama) ise, 1 ve değişken damar elastikiyeti ile in vitro modellenmiştir 2 Arter elastikiyet akışının depolanması önemlidir. Kalp kasılmaları enerji, sistolik basınç altında dilate ve kan akımı PI modüle önemli bir rol oynamaktadır. Kalp tutarlı olarak, belirli aralıklarla, hacimsel akışı muhafaza için, arteryel genleşme akım hızı, kesme stresi ve PI azaltarak akış stabilitesinin arttırılması, enine kesit alanını arttırmaktadır. Elastikiyet Sıklıkla sağlıksız arterler mevcut değişikliklerya da uyum vasküler yeniden, skar dokusu veya kireçlenme 3, 4 sertleşme görüntüleniyor. Ek olarak, neointimal hiperplazi (NIH), 5 anevrizma ve hipertansiyon 6 ve vasküler fibrozların 4 gibi diğer damar hastalıkları, damar çapı daraltır olabilir. Ancak, mevcut ilaç tedavisi ve damar hastalıkları cihaz tedavisi genellikle sık sık damar morfolojisi ve özelliklerinde değişiklikler karmaşık bir damar hastalığında damar duvarı uyum veya kan akış dinamikleri önemini ihmal. Ne balon anjiyoplasti stent ne duvar elastisite 7 komplikasyon cevap. Bu nedenle, kan in vitro model arter hastalığı ve işlemlerin sonucu olan akımlarının hastalığı patolojileri ve tedavisinde gelecek etkisini araştıran önemlidir. Burada, damar hastalığı Pathol hücre yanıtını belirlemek için tasarlanmıştır fizyolojik ve patolojik kan akışını kopyalayan bir yöntem tariftakımının kontrolü. Sıvı akışı damar tüm hücreleri etkileyen damar sağlığında önemli bir mekanik sinyal olan damar duvarının kayma strese neden olur. Sıvı kesme için vasküler endotel üzerinde çeşitli mekanik algılayıcılar endotel 8 mechanosensing için son çalışmalarda gösterilmiştir birincil cilium dahil, tespit edilmiştir. Endotel hücre aktivitesi ve morfolojisi akış hızı, yönü ve pulsatilitesini etkilenir. Ek olarak, yumuşak kas hücresi (SMC) göçü interstisyel sıvı ile 9 arasındaki düşük hızlı akış mekano-sinyaller etkilenebilir ve akış ve sitokin ile akış sinyallerinin mekano-transdüksiyon için kendi yanıt verme yoluyla endotel hücrelerinden parakrin sinyali yoluyla olabilir 10 yayınlayacak. Ortalama kesme, PI ve parakrin sinyal iletiminin &quot;dozu&quot; bağımlılık da birbirine olabilir. Tek tabakalı kültürü bu amaçla, çeşitli &quot;doz&quot; ile sıvı kesmeye vasküler hücre yanıtının belirlenmesi içinya da in vitro ko-kültür vasküler yeniden içine mekanistik anlayış sağlamak ve hastalık ve tedavi tahmini artırabilirsiniz. Bu deneyde kullanılan akış sistemi, bir kan pompası, bir yukarı akış sönümleme hava haznesi sadece deney düzeneği, bir alt hücre kültürü, paralel plaka akış odası ve ortam haznesi sırasında kullanılan bir alt-akış ölçer oluşur. Akış hızı anlamına gibi damar akım değişkenlerin kontrol dakikadaki vuruş ve PI kontrol akış hızı, darbe frekans ve basıncının esas olarak söndürme yoluyla elde edilebilir. Pulsatif kan pompalar hacimsel akış hızı ve nabız frekansı ortalama doğrudan ilgili, kontrollü inme frekansında, değişken strok deplasman mevcuttur. Akım devresi içinde bir hava rezervuarının giriş akışı salınım büyüklüğünü azaltarak, basınç sönümleme sağlar. Sönümleme odasının içindeki hava olması akış dalga aşırı basınç sağlayan, sıkıştırılabilir ise medya, sıkışmaz bir sıvıdırHava sıkıştırma tarafından emilir. Medya oranı hava çok damping nasıl oluştuğu üzerinde kontrol sağlar. Genişliğinde 50 mm uzunluğunda 75 mm Özel bir hücre kültürü akış odası akrilik oluşturuldu. Akış giriş deliğinden girer, ve akış odasının tamamen tutarlı akış sağlayan, giriş manifoldu boyunca genişler. Benzer akışı ve yapılar odası çıkışında bulunmaktadır. Hücreler, işlevselleştirilmiş slaytlar üzerine ekilmiş ve daha sonra akış odasına bağlıdır. Bu kolayca çalışma sonrasında alınan büyük nüfus için izin verir. Ortak kültür deneyleri sitokin / akım taşıma izin verirken kültürleri arasında, hücre-hücre teması ortadan kaldırmak için, gözenekli bir polikarbonat membran kullanılabilir. Bu sistem daha önce yüksek PI akışı ve endotel tek tabaka kültürü ve EC / SMC ko-kültür 1, 10 üzerindeki etkisini modellemek için hücre yanıtı için patolojik yüksek PI hastalığı araştırmak için kullanılır olmuştur. Bu akış con modellemek için kullanılan protokol anlataraketkiler cihazın, biz yanıtı hücre akım sinyali katkısını belirlemek başkalarına yardım etmek istiyoruz.

<table><tbody><tr><td>Acetone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34850</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Glass Slide (70&amp;#160;mm x 50&amp;#160;mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS294775X50</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonate Membrane</td><td>Millipore Corp.</td><td>HTTP09030</td><td></td></tr><tr><td>Silicone Gasket</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>RD 475464</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin (25 &amp;mu;g/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Collagen Type-I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fluka</td><td>36486</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Damping Chamber</td><td></td><td></td><td>This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of &lt;strong&gt;Figure 3&lt;/strong&gt;.</td></tr><tr><td>Blood Pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>529552</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Vinyl Carbonate Tubing</td><td>US Plastic</td><td>65066, 65063, 65062</td><td>Various sizes may be required</td></tr><tr><td>Luer Connections</td><td>Nordson Medical</td><td>Various</td><td>Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use.</td></tr><tr><td>Culture Chamber</td><td>Machined in-house</td><td>Custom</td><td>Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in &lt;strong&gt;Figure 2&lt;/strong&gt; may be used to recreate this chamber.</td></tr><tr><td>Square Petri Dish</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-14007-10</td><td></td></tr><tr><td>Glass Slide Holder</td><td>Capitol Scientific</td><td>WHE-900303</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Flow Meter</td><td>Sonotec, GmbH</td><td>Sonoflow co.55/060</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard Elastomer Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761036-5EA</td><td></td></tr><tr><td>14 G Steel Cannula</td><td>General Laboratory Supply</td><td>S8365-1</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro model of physiological and pathological blood flow with application to investigations of vascular cell remodeling

Vasküler hastalık Amerika Birleşik Devletleri içinde ölüm yaygın bir nedenidir. Bu yazıda, damar hastalığı patolojileri doğru akış dinamikleri katkısını incelemek için bir yöntem mevcut. Duvar sertleşme, yara izi veya tüm sıvı akış oranlarını etkileyebilir kısmi stenoz ve pulsatil akım büyüklüğü, ya da pulsatilite indeksi ile sıklıkla Sağlıksız arterler. Çeşitli akış koşullarının çoğaltma kan pompasının alt bölmeyi sönümleme akış basıncını ayarlama sonucudur. Sıkıştırılabilir ortamı pompasından pulsatil basıncı emmek ve bu nedenle pulsatilite indeksi değişir için kapalı bir akış sistemi içinde hava giriş sağlar. Burada açıklanan yöntemi sadece çok kontrollü giriş ve kolayca ölçülebilir sonuçlar, yeniden üretilir. Bazı sınırlamalar ancak sistem tarafından yaklaşılır karmaşık fizyolojik nabız dalga, rekreasyon vardır. Endotel hücreleri, düz kas hücreleri, fibroblastlar, kan akışı ve thr etkilenirarteri ough. Kan akımının dinamik bileşen kalp debisi ve arter duvarı uyumu ile belirlenir. Akış dinamikleri vasküler hücre mekano-transdüksiyon sitokin salınmasını ve arter içinde hücre tipleri arasında çapraz-tetikleyebilir. Vasküler hücrelerde ko-kültür damar duvarında ve mekanik sinyal vasküler tepkisi üzerinde daha doğru bir resim yansıtan hücre-hücre etkileşim. Akışın dinamik ve ortalama (ya da sabit) bileşenlerine hücre tepkisinin de dahil olmak üzere akış dinamikleri, katkısı, bu nedenle hastalığın patoloji ve tedavi etkinliğini belirleyen önemli bir ölçümdür. Bir in vitro ko-kültür yerine getirilmiştir ve basınç simüle kardiyak çıktı üretir kan pompası alt süspansiyon ile, çeşitli patolojiler arter hastalığı araştırılabilir.

Akış koşullarında Bakım akım devresi (Şekil 1) doğru montaj güvenmek durumundadır. Çapı Boru önce ve kültür odası sonra akış direncini ve sonraki basınç düşüşünü azaltarak büyük çaplarda mecliste önemli bir seçim vardır. Amaçlanan basınç ve akış hızı sağlamak için, amaçlanan boru ile deney öncesi akış ölçer ile sisteme monte edin. Silikon conta (resim mevcut değil) üzerinde delikli kültür odacıklı vakum kanalı (Şekil 2), hizalama, a...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling at JoVE.com

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Bu protokol, hastalık patolojilerinde hücre yanıtını belirlenmesinde yardımcı olmak için, in vitro olarak fizyolojik veya patolojik kan akışını çoğaltır. Kan pompası alt bölmeyi sönümleme bir basınç katılmasıyla, damar boyunca kan akımı değinmeyecek edilebilir ve vasküler endotelyum, ya da taklit eden ko-kültür, bir tek tabaka üzerine koydu.

Vasküler Hücre Remodeling Soruşturma Fizyolojik in vitro Modeli ve Uygulaması ile Patolojik Kan Akış

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

in-vitro-model-physiological-pathological-blood-flow-with-application

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

9.6K Görüntüleme.  University of Colorado at Boulder.  Bu protokol, hastalık patolojilerinde hücre yanıtını belirlenmesinde yardımcı olmak için, in vitro olarak fizyolojik veya patolojik kan akışını çoğaltır. Kan pompası alt bölmeyi sönümleme bir basınç katılmasıyla, damar boyunca kan akımı değinmeyecek edilebilir ve vasküler endotelyum, ya da taklit eden ko-kültür, bir tek tabaka üzerine koydu. 

Video: In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

Hematolojik Hastalıklarında Mikrovasküler Etkileşimleri Öğrenmenin Endothelialized Mikroakiskan

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Biyomühendislik

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent endothelial progenitors (EPs), which can differentiate into the cell types necessary to assemble mature, functional vasculature, have been derived from both embryonic and induced pluripotent stem cells. However, these cells have not been rigorously evaluated in three-dimensional environments, and a quantitative measure of their vasculogenic potential remains elusive. Here, the generation and isolation of iPSC-EPs via fluorescent-activated cell sorting are first outlined, followed by a description of the encapsulation and culture of iPSC-EPs in collagen hydrogels. This extracellular matrix (ECM)-mimicking microenvironment encourages a robust vasculogenic response; vascular networks form after a week of culture. The creation of a computational pipeline that utilizes open-source software to quantify this vasculogenic response is delineated. This pipeline is specifically designed to preserve the 3D architecture of the capillary plexus to robustly identify the number of branches, branching points, and the total network length with minimal user input.

Endothelial progenitors derived from induced pluripotent stem cells (iPSC-EPs) have the potential to revolutionize cardiovascular disease treatments and to enable the creation of more faithful cardiovascular disease models. Herein, the encapsulation of iPSC-EPs in three-dimensional (3D) collagen microenvironments and a quantitative analysis of these cells&#8217; vasculogenic potential are described.

Bir In vitro 3D model ve hesaplamalı boru hattı PSC-türetilen endotel progenitors Vazculogenik potansiyelini ölçmek için

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...

Gelişim Biyolojisi

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning ve 3D mikrodamarlar Meclisi

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

The Arteriovenous (AV) Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in pathological situations such as cancer, vascularization plays a leading role in disease progression. Consequently, there is a strong need for a standardized and well-characterized in vivo model in order to elucidate the mechanisms of neovascularization and develop different vascularization approaches for tissue engineering and regenerative medicine.
We describe a microsurgical approach for a small animal model for induction of a vascular axis consisting of a vein and artery that are anastomosed to an arteriovenous (AV) loop. The AV loop is transferred to an enclosed implantation chamber to create an isolated microenvironment in vivo, which is connected to the living organism only by means of the vascular axis. Using 3D imaging (MRI, micro-CT) and immunohistology, the growing vasculature can be visualized over time. By implanting different cells, growth factors and matrices, their function in blood vessel network formation can be analyzed without any disturbing influences from the surroundings in a well controllable environment. 
In addition to angiogenesis and antiangiogenesis studies, the AV loop model is also perfectly suited for engineering vascularized tissues. After a certain prevascularization time, the generated tissues can be transplanted into the defect site and microsurgically connected to the local vessels, thereby ensuring immediate blood supply and integration of the engineered tissue. By varying the matrices, cells, growth factors and chamber architecture, it is possible to generate various tissues, which can then be tailored to the individual patient's needs.

The Arteriovenous AV Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering

We describe a microsurgical approach for the generation of an arteriovenous (AV) loop as a model for analyzing vascularization in vivo in an isolated and well-characterized environment. This model is not only useful for the investigation of angiogenesis, but is also optimally suited for engineering axially vascularized and transplantable tissues.

Bir Küçük Hayvan Modelinde Arteriovenöz (AV) Döngü Anjiogenez ve Vaskülarize Doku Mühendisliği Eğitim için

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the spheroid cultures, a perfusable vascular network in the spheroids remains a critical challenge for long-term culture required to maintain and develop their functions, such as protein expressions and morphogenesis. The protocol presents a novel method to integrate a perfusable vascular network within the spheroid in a microfluidic device. To induce a perfusable vascular network in the spheroid, angiogenic sprouts connected to microchannels were guided to the spheroid by utilizing angiogenic factors from human lung fibroblasts cultured in the spheroid. The angiogenic sprouts reached the spheroid, merged with the endothelial cells co-cultured in the spheroid, and formed a continuous vascular network. The vascular network could perfuse the interior of the spheroid without any leakage. The constructed vascular network may be further used as a route for supply of nutrients and removal of waste products, mimicking blood circulation in vivo. The method provides a new platform in spheroid culture toward better recapitulation of living tissues.

The protocol describes how to engineer a perfusable vascular network in a spheroid. The spheroid's surrounding microenvironment is devised to induce angiogenesis and connect the spheroid to the microchannels in a microfluidic device. The method allows the perfusion of the spheroid, which is a long-awaited technique in three-dimensional cultures.

Perfusable vasküler ağ özellikli bir doku içinde bir mikrosıvısal aygıt

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

hiPSC kaynaklı endotel hücrelerinin farklılaşması ve mekanik stimülasyonu

In Vitro Model of Fetal Human Vessel On-chip to Study Developmental Mechanobiology

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides transporting oxygen and nutrients to ensure fetal growth, fetal circulation controls many crucial developmental events taking place within the endothelial layer through mechanical cues. Biomechanical signals induce blood vessel structural changes, establish arteriovenous specification, and control the development of hematopoietic stem cells. The inaccessibility of the developing tissues limits the understanding of the role of circulation in early human development; therefore, in vitro models are pivotal tools for the study of vessel mechanobiology. This paper describes a protocol to differentiate endothelial cells from human induced pluripotent stem cells and their subsequent seeding into a fluidic device to study their response to mechanical cues. This approach allows for long-term culture of endothelial cells under mechanical stimulation followed by&#160;retrieval of the endothelial cells for phenotypical and functional characterization. The in vitro model established here will be instrumental to elucidate&#160;the intracellular molecular mechanisms that transduce the signaling mediated by mechanical cues, which ultimately orchestrate vessel development during human fetal life.

Yazar Spot Işığı: Akışkan Aracılı Mekanik Stimülasyon Altında Kültürlenen hiPSC'den Türetilmiş Endotel Hücrelerinin İncelenmesi 

Described here is a simple workflow to differentiate endothelial cells from human pluripotent stem cells followed by a detailed protocol for their mechanical stimulation. This allows for the study of the developmental mechanobiology of endothelial cells. This approach is compatible with downstream assays of live cells collected from the culture chip after mechanical stimulation.

In Vitro Gelişimsel Mekanobiyolojiyi İncelemek için Çip Üzerinde Fetal İnsan Gemisi Modeli

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides ...

Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization

Neovascularization is usually initialized from an existing normal vasculature and the biomechanical microenvironment of endothelial cells (ECs) in the initial stage varies dramatically from the following process of neovascularization. Although there are plenty of models to simulate different stages of neovascularization, an in vitro 3D model that capitulates the initial process of neovascularization under the corresponding stimulations of normal vasculature microenvironments is still lacking. Here, we reconstructed an in vitro 3D model that mimics the initial event of neovascularization (MIEN). The MIEN model contains a microfluidic sprouting chip and an automatic control, highly efficient circulation system. A functional, perfusable microchannel coated with endothelium was formed and the process of sprouting was simulated in the microfluidic sprouting chip. The initially physiological microenvironment of neovascularization was recapitulated with the microfluidic control system, by which ECs would be exposed to high luminal shear stress, physiological transendothelial flow, and various vascular endothelial growth factor (VEGF) distributions simultaneously. The MIEN model can be readily applied to the study of neovascularization mechanism and holds a potential promise as a low-cost platform for drug screening and toxicology applications.

Here, we provide a microfluidic chip and an automatically controlled, highly efficient circulation microfluidic system that recapitulates the initial microenvironment of neovascularization, allowing endothelial cells (ECs) to be stimulated by high luminal shear stress, physiological level of transendothelial flow, and various vascular endothelial growth factor (VEGF) distribution simultaneously.

Neovaskülarizasyonun İlk Olayını Taklit Etmek için Mikroakışkan Model

Neovascularization is usually initialized from an existing normal vasculature and the biomechanical microenvironment of endothelial cells (ECs) in the ...

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of various important processes in the cardiovascular system. Recently, although several biological studies have been performed using such 3D models of human arteries, they have not been applied to study vascular targeting. This paper presents a new method to fabricate real-sized, reconstructed human arterial models using a 3D printing technique, line them with human endothelial cells (ECs), and study particle targeting under physiological flow. These models have the advantage of replicating the physiological size and conditions of blood vessels in the human body using low-cost components. This technique may serve as a new platform for studying and understanding drug targeting in the cardiovascular system and may improve the design of new injectable nanomedicines. Moreover, the presented approach may provide significant tools for the study of targeted delivery of different agents for cardiovascular diseases under patient-specific flow and physiological conditions.

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

Here, we present a new protocol to study and map the targeted deposition of drug carriers to endothelial cells in fabricated, real-sized, three-dimensional human artery models under physiological flow. The presented method may serve as a new platform for targeting drug carriers within the vascular system.

Akış Altında Damar İlacı Hedeflemesi Üzerinde Çalışmak için In Vitro 3D Hücre Kültürlü Arteriyel Modeller

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...

Vasküler Hücre Remodeling Soruşturma Fizyolojik in vitro Modeli ve Uygulaması ile Patolojik Kan Akış

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Hematolojik Hastalıklarında Mikrovasküler Etkileşimleri Öğrenmenin Endothelialized Mikroakiskan

Bir In vitro 3D model ve hesaplamalı boru hattı PSC-türetilen endotel progenitors Vazculogenik potansiyelini ölçmek için

Micropatterning ve 3D mikrodamarlar Meclisi

Bir Küçük Hayvan Modelinde Arteriovenöz (AV) Döngü Anjiogenez ve Vaskülarize Doku Mühendisliği Eğitim için

Perfusable vasküler ağ özellikli bir doku içinde bir mikrosıvısal aygıt

In Vitro Gelişimsel Mekanobiyolojiyi İncelemek için Çip Üzerinde Fetal İnsan Gemisi Modeli

In Vitro Gelişimsel Mekanobiyolojiyi İncelemek için Çip Üzerinde Fetal İnsan Gemisi Modeli

In Vitro Gelişimsel Mekanobiyolojiyi İncelemek için Çip Üzerinde Fetal İnsan Gemisi Modeli

Neovaskülarizasyonun İlk Olayını Taklit Etmek için Mikroakışkan Model

Akış Altında Damar İlacı Hedeflemesi Üzerinde Çalışmak için In Vitro 3D Hücre Kültürlü Arteriyel Modeller