This work was supported by EU Marie Curie Fellowship (EU/300686-InfO) to S.B. and a Research Prize from the United European Gastroenterology Foundation to H.C. We would like to thank Harry Begthel, Jeroen Korving and the Hubrecht Imaging Center for technical assistance, Meritxell Huch for help with initial organoid culture and Yana Zavros for discussion.

Mide organoid Kültür 1. kurulması Not: Bu protokol, fare veya insan dokusundan gastrik bezleri izolasyonu için de kullanılabilir. Yaklaşık 1 cm² doku kullanılması tavsiye edilir. İnsan dokusu gastrik rezeksiyonu veya biyopsiler elde edilebilir. <ol><li> Malzemenin Hazırlanması Not: Kullanılan bodrum matris Matrigel olduğunu. Her zaman buz üzerinde bodrum matrisi tutun. -20 ° C &#39;de taban matrisi saklayın ve kullanımdan önce buz üzerinde eritin. Bazal ortam HEPES Gelişmiş DMEM / F12 belirtir; Böyle Glutamax ve 1x Primocin uygun antibiyotikler gibi uygun bir glutamin kaynağıdır. Kullanılan kuluçka standart hücre kültürü kuluçka olan (37 ° C, nemlendirilmiş atmosfer,% 5 CO2) <ol><li> Keskin forseps, makas, neşter ve bir cam mikroskopisi slayt: otoklav veya% 100 izopropil alkol kullanarak hazırlama kapları sterilize edin. </li><li> Izolasyon gün önce, 24 wel yerleştirininkübatör l hücre kültürü plakası. </li><li> Üretici firmaların tavsiyelerine uygun olarak bodrum matrisi hazırlayın. Tekrarlanan donma erime döngülerinden kaçınmak için, 1 ml hacimde hazırlayın. </li><li> Buz üzerinde tampon ve serin kenetleme 500 ml hazırlayın. HPO 4, 8,0 mM KH 2 PO 4, 96.2 mM NaCI, 1.6 mM KCI 5,6 mM Na 2 ile steril damıtılmış su 1x tamponu hazırlayın, 43,4 mM sakaroz, 54,9 mM, D-sorbitol, 0.5 mM DL-ditiyotreitol (DİKKAT), pH 7. Birkaç izolasyonların planlama ise, DL-ditiyotreitol olmaksızın 5x konsantre solüsyon hazırlanır. Steril filtre tamponu. Izolasyon önce, 1x ve sadece izolasyon önce DL-dithiothreitol eklemek için steril su ile 5x tampon sulandırmak. </li><li> Hazırlayın ve üreticinin önerileri doğrultusunda tüm büyüme faktörlerini sulandırmak. Küçük boyutlu alikotları kullanın ve donma-çözülme döngüleri kaçının. Fonksiyonel büyüme faktörleri sonuçlar için çok önemlidir. </li><li> Serin bazal buz üzerinde orta ve 4 santrifüj soğutmak6 ° C. </li><li> 37 ° C&#39;ye kadar bazal ortam ayrı bir bölüntüsünün, ısıtın. </li></ol></li><li> Bezlerin izolasyonu <ol><li> Buz soğukluğunda bazal ortamda dokusunun yaklaşık 1 cm² toplayın. Hazırlık kadar buz üzerinde tutun. O kısa sürede doku işlemek için tercih edilir olsa da, buz üzerinde orta mağaza dokusu gerekirse. </li><li> 10 cm&#39;lik Petri kabındaki doku yerleştirin ve soğuk 1x şelasyon tamponu ile örtün. Yavaşça ileri geri hareket ettirerek yıkayın. </li><li> Kuru bir 10 sm Petri kabındaki doku yerleştirin. Forseps kullanarak, dikkatli bir stereomikroskop altında mukus yanı sıra kas katmanı kaldırmak. Yavaşça ileri geri hareket ettirerek soğuk 1x kıskaç tamponunda doku yıkayın. </li><li> Yeni, kuru bir 10 cm Petri kabı 1 cm2 doku yerleştirin. Kullanımı makas yaklaşık 2-5 mm² boyutu 20-50 küçük parçalar halinde kesilmiş. </li><li> Forseps kullanarak, 50 ml&#39;lik bir tüp içine tüm parçaları yerleştirin. </li><li> Steril 10 ml plastik pipet alın. 1x kıskaç tamponunda pipet ıslatın. Keepişlem boyunca aynı pipet kullanarak. </li><li> 50 ml&#39;lik bir tüpe 10 ml soğuk 1 x kenetleme tamponu ekleyin. Şiddetle yukarı ve aşağı 10 kez pipetleme parçaları yıkayın. Parçalar dinlendiriniz. Süpernatantı. </li><li> Süpernatant yineleyerek yıkama (adım 1.2.7) açıktır. Bu insan dokusunun 1 cm² yaklaşık 50-100 ml 1x kıskaç tampon alır. </li><li> Yumuşak her 2 dakikada tersini, 10 dakika boyunca oda sıcaklığında, 10 mM EDTA ile takviye edilmiş 20 ml 1 x kenetleme tamponu içinde doku parçaları inkübe edin. Not: Bu inkübasyonun zaman ve ısı hızı ve / veya bez mimarisinin korunmasında biri için optimize edilebilir. Bunlar 200 rpm&#39;lik bir çalkalayıcıda olmak üzere 37 ° C &#39;de 5 dakika için haddeleme platformunda 4 ° C&#39;de birkaç saat kuluçkalamadan arasında olabilir. Fare midesinde için iyi bir başlangıç ​​noktası bir yuvarlanma platformun üzerinde 4 ° C de ve insan mide için 30 dakika, oda sıcaklığında 10 dk. </li><li> Pipet kez yavaşça yukarı ve 10 ml pipet kullanarak aşağı. Pi izin vereces yerleşmek. Süpernatantı atın. </li><li> Pipeti kullanarak, temiz bir 10 sm petri diş parçaları aktarın. Sıvı çıkarın. </li><li> Doku parçaları üstüne bir cam mikroskop slayt yerleştirin. 10X büyütme ile hücre kültürü için bir ters mikroskop altında sağlam dokuyu uyun. </li><li> Cam slayt ve Petri kabı basınç uygulayın. Hem (steril eldiven ile), el ve başparmak ile cam presleme tutun. Doku jant bezleri dokusunun dışarı salınır belirten bulutlu görünecektir. </li><li> 10X büyütme ile hücre kültürü için ters bir mikroskop altında yayımlanan bezleri uyun. </li><li> 30 ml soğuk bazal ortamda bezleri ve doku toplayın. Büyük doku parçaları dinlendiriniz. </li><li> İki 15 ml tüpler bezleri içeren süpernatant toplayın. </li><li> 200 xg ve 4 ° C&#39;de santrifüje 5 dak. Atın süpernatant. Pelet izole bezleri içerir. Buz üzerinde tutun. </li></ol></li><li> Bezlerin Tohum <ol&gt; <li> Tohumlama için, bodrum matris buz gibi soğuk her zaman tutmak, bu yüzden sıvı kalır. </li><li> Alternatif 1: Tohum bir seyreltme satır 6 kuyu. <ol><li> Bodrum matris 60 ul pelet Askıya. </li><li> Temel matrisinin her biri 50 ul buz üzerinde 5 steril 1,5 ml tüpler hazırlayın. Transferi ilk 1.5 ml tüp içine bezleri / bodrum matris süspansiyonu 10 ul. Bezleri Askıya ve sonraki bir 1.5 ml&#39;lik tübe Bu çözeltinin 10 ul transfer. Bir sonraki borular için tekrarlayın. </li></ol></li><li> Alternatif 2: kuyu başına bezlerinin bir hesaplanmış miktarda Tohum. 24 plaka bir kuyuya 50 ul bodrum matrisinin başına 100 bezleri ile başlayın. <ol><li> Dikkatle 10 ml bazal ortamda topak haline bezleri askıya. Temiz bir 10 ml Petri kabı 50 ul yerleştirin. 10X büyütme ile hücre kültürü için ters bir mikroskop altında bezlerinin sayısını. </li><li> Çözelti içinde bezlerinin konsantrasyonu hesaplanır. Sesini o conta aktarınins yeni bir 15 ml tüp 400 bezleri. </li><li> 200 xg ve 4 ° C&#39;de santrifüje 5 dak. Süpernatantı atın ve buz üzerinde tüp tutun. 200 ul bodrum matrisi ekleyin ve dikkatlice tekrar süspansiyon. Buz üzerinde tutun. </li></ol></li><li> 37 ° C sıcak bir 24-çukurlu plaka al inkübatör (adım 1.1.2&#39;ye bakınız). Kuyunun merkezinde taban matris içinde 50 ul bezlerinin bir damla yerleştirin. Damla kubbe oluşturacak. </li><li> Dikkatle geri hücre kültürü inkübatör plaka transfer. Bodrum matrisi 10 dk katılaşmaya edelim. </li><li> Tüm büyüme faktörleri ile sıcak ortamı hazırlayın. <ol><li> İnsan bezleri için: İnsan gastrik organoids aşağıdaki büyüme faktörleri ile bazal ortamı Ek: 50 ng / ml EGF,% 10 noggin-koşullandınlmış madde içinde,% 10 R-spondin1-koşullandınlmış madde içinde,% 50, Wnt-koşullandınlmış madde içinde, 200 ng / mi fibroblast büyüme faktörü (FGF), 10, 1 nM gastrin ve 2 uM TGFbeta önleyicisi ve 10 uM rho-birleşik biçim verme sarmal bobin protein serin / treonin kinaz<html> önleyicisi (RHOKi). </li><li> Sıçangil bezleri için: fare gastrik organoids aşağıdaki büyüme faktörleri ile bazal ortamı Ek: 50 ng / ml EGF,% 10 noggin-koşullandınlmış madde içinde, orta R-spondin1 Koşulları 10,% 50,% Wnt-koşullandınlmış madde içinde, 100 ng / FGF10 mi, 10 nM gastrin, 0.5 mM TGFbeta önleyicisi ve 10 uM RHOKi. </li></ol></li><li> Inkübatör plaka almak. Dikkatle iyi bodrum matris bozmadan her bütün büyüme faktörleri (1.3.6) ile 500 ul orta ekleyin. Geri inkübatör yerleştirin. </li><li> Haftada 3 kez orta (2-3 gün) yenileyin. Orta ferahlatıcı için, sağlam bodrum matris damla bırakarak eski orta kaldırmak. Dikkatle tüm büyüme faktörleri ile taze, sıcak orta ekleyin. RHOKi katmayın. Sadece, doğrudan bezlerinin tohumlama sonra veya organoids (aşama 2) arasında bölmeden sonra RHOKi ekleyin. </li></ol></li></ol> Mikroenjeksiyon öncesi Mide organoid Kültür 2. Passage. &quot;ove_content&gt; Not: organoid kültürünün her türünün kendi katlama süresi vardır Fare bağırsak yanı sıra mide kültürler genellikle bölünmüş olarak 1:. 5 Her 5-7 gün İnsan bağırsak kültürler 1 ayrılır.:. 5 her 10-12 gün İnsan Mide kültürler 1 ayrılır: 5 14 günde tek hücre başlatılan ise, insan mide organoids de düzgün oluşturmak için 20 gün sürebilir Bu tomurcuklanan yapıların merkezi boşluğa çevreleyen bu protokolde, organoids içinde bölünür iyi bir işarettir... organoids ve mikroenjeksiyon. Bakım 4 havuzlu plakalar protokol izlenmiş, ancak bu, standart 24 gözlü hücre kültür levhaları gibi başka bir hücre kültürü plakası, kullanabilir. <ol><li> Malzemenin Hazırlanması <ol><li> Otoklav Pastör pipetleri. </li><li> Günlük geçirilmesinden önce, 37 ° C &#39;de inkübatör 4 hücre kültür plakası yerleştirin. 4 kuyu plakalar düşük kenarları ve mikromanipülasyon sağlar. </li><li> Üretici firmaların tavsiyelerine uygun olarak bodrum matrisi hazırlayın. Passagi günündeng, buz üzerinde bodrum matrisi Çözülme. </li><li> Hazırlayın ve üreticinin önerileri doğrultusunda tüm büyüme faktörlerini sulandırmak. </li><li> Serin bazal buz üzerinde, orta ve 4 ° C&#39;ye kadar santrifüj soğutun. </li></ol></li><li> Organoid Kültürlerin Passage <ol><li> Inkübatör organoids ile plaka almak. Tek kuyudan orta çıkarın. </li><li> De bazal matris soğuk bazal maddesi 1 ml ilave edilir. 1 ml mikropipet kullanarak, şiddetle yukarı pipet ve bodrum matris bozuldu kadar aşağı. 15 ml&#39;lik bir tüpe transfer. Buz üzerine yerleştirin. </li><li> Bir cam Pasteur pipeti ve Bunsen beki gibi yangın kaynağını atın. <ol><li> Ucunun açılması yaklaşık 0.5 mm (Şekil 1) 1,5 mm ila daralmış kadar ateşin içine pipet ucu tutun. RT serin pipet edelim. </li><li> Bazal ortamda pipet ıslatın. Optimal daralmış pipet un-daralmış pipet daha gözle görülür yavaş orta alacak, ama yine de olacak tümow iyi pipetlenerek. </li></ol></li><li> Pipet organoids alın ve şiddetle yukarı ve aşağı 10x pipetle. Organoids kırılma gözle gözlemlenebilir. </li><li> 200 x g&#39;de 5 dakika 4 ° C&#39;de soğuk bazal ortam ve santrifüj 9 ml ekleyin. </li><li> Dikkatle tüm süpernatant atın. 250 ul bodrum matris içinde pelet Askıya. Buz üzerinde tutun. </li><li> 37 ° C sıcak 4 kuyu kültür plaka almak ve iyi, her 50 ul organoids / bodrum matris bir damla yerleştirin. </li><li> Dikkatle tekrar inkübatör plaka aktarın. Temel matrisi 10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de katılaşmaya edelim. </li><li> Adım 1.3.6 listelenen fare ya da insan ya organoids için uygun ortamı hazırlayın. </li><li> Kuvöz plaka almak ve 500 ul ortam ile her bodrum matris damla kaplaması. </li><li> Inkübatör plaka aktarın. </li><li> Her 2-3 günde orta haftada 3 kez Yenile (1.3.8 bkz.). </li><li> Organoids dondurulması için mechanBu protokol bölme için anlatıldığı gibi ically organoids bozabilir (Merdivenleri 2.2.1-2.2.5.). Orta donma 500 ml organoid parçaları Askıya ve C kullanarak cryotubes ve dondurma kabının ° -80 dondurma. Uzun süreli saklama için sıvı nitrojen tüpleri aktarın. </li><li> Adımlarla 1.1.2, 1.1.3., 1.1.5., 1.1.6., 1.1.7 de belirtildiği gibi organoids çözülme için, kültür plakası, bodrum matrisi, büyüme faktörleri, soğuk ve sıcak ortam hazırlar. Hemen 10 ml soğuk bazal ortam ile 15 ml tüp çözündükten sonra dondurulmuş bir su banyosu kullanılarak şişe ve aktarım hücreleri ısıtın. 2.2.12 ile 2.2.5 özetlendiği gibi Santrifüj hücreleri plaka ve. Not: organoids Mikroenjeksiyon zahmetli, ama benzersiz olasılık 3D etkileşim çalışma sağlar. </li><li> 3D çalışmalara ihtiyaç değilse, iki boyutta organoids tohum. Adımlarla 2.2.6 2.2.1 ortaya koydu olarak Bunun için, organoids bozabilir. Bodrum ma 250 ul tüm büyüme faktörleri ile 2250 ul soğuk orta ekleorganoid fragmanları ile matrisidir. <ol><li> Oyuk başına 500 ul, 24 gözlü bir levhanın 5 kuyularda tohum. Bozulmamış plakanın altındaki bodrum matris tutmak için, dikkatli bir şekilde sadece üst 400 ul değiştirilmesi ile, orta, haftada 3 kez değiştirin. Not: Organoids hücre kültürü plakasına takmak ve 2D artıracaktır. Elektron mikroskopisi hücrelerinin apikal yan kuyudaki ortam karşı karşıya olduğunu göstermiştir (veriler gösterilmemiştir). </li><li> Enfeksiyon önce bakteri hücreleri takmak için izin, bodrum matrisinin dahil olmak üzere tüm orta alışverişinde. Benzer bir protokol, aynı zamanda H. ile enfeksiyon için tarif edilmiştir pylori 14. 2B hücre tabakaları 3 boyutlu organoids içinde mevcut olan tüm hücre tipleri içerebilir. </li></ol></li></ol></li></ol> Organoid Kültür 3. mikroenjeksiyonu. Not: Bu protokol organoids bakterileri Microinject için kullanılabilir. Bu organoids ile enjeksiyon başlamak yararlı olabilirMikroenjeksiyon daha hoşgörülü olduklarını. Örneğin, fare gastrik organoids hedef kolay çok büyük kistik organoids dönüşebilir. <ol><li> Malzemenin Hazırlanması <ol><li> Üretici firmaların tavsiyelerine uygun olarak, bir mikropipet çektirmenin kullanarak iki enjeksiyon iğne içine cam kılcal çekin. Mikropipet çektirmenin ortada cam kılcal ısı ve böylece iki cam iğneler üreten, iki bölüme kılcal çeker. Birkaç iğneler çekin ve temiz bir petri bunları saklamak için pratiktir. </li><li> Bakteriyel enfeksiyon izin en az 3 orta değişiklikler (= bir hafta) tüm medya antibiyotik kaldırmak için. Bu bodrum matris antibiyotik sulandırmak. Belirli bir antibiyotiğe dirençli bakteri suşu kullanılarak, kirlilik için şansı en aza indirmek için bu özel antibiyotik ekleyin. </li><li> Microinjections için çalışma tezgahı hazırlayın. Farklı biyogüvenlik seviyelerinde çalışma için bir stereo yerleştirmek gerekebilirsteril bir tezgah içinde mikroskop. Bu protokolde, H. enjekte 2 koşullar steril tezgah içinde bir stereomikroskop altında biyogüvenlik düzeyi altında pylori. </li><li> Kültür standart protokollere göre 13,23 bakteriler. </li><li> Bakteri sayısını ve organoid başına hücre sayısını aşağıda özetlenen: enfeksiyon (İB) çokluğu tahmin etmek için, iki parametre tahmin ediyoruz. MOI ana, IL-8 mRNA ekspresyonu 13, örneğin, sonuçlar ile ilişkili olabilir. <ol><li> Enfeksiyon çözeltisi bakteriyel yoğunluğunu hesaplamak için, ilk olarak, standart protokollere göre, 24 optik yoğunluk ve koloni oluşturan birimlerin standart bir eğrisi (CFU) oluşturmaktadır. 550 nm&#39;de 0.1&#39;lik bir optik yoğunluğu yaklaşık 10 7 cfu / ml elde edilmelidir. </li><li> Organoid başına hücre sayısını tahmin etmek, iyi 1&#39;de organoids sayısını. Adımlarda tarif edilen organoids bozabilir 2.2.1-2.2.4. Santrifüj 5 dakika 200 x g&#39;de sonra ve 4 ° C&#39;de,enzimatik ayrışma çözüm ve tekrar süspansiyon 1 ml ekleyin. <ol><li> Tekrar 5-10 dakika boyunca çalkalama ile 37 ° C&#39;de inkübe edin. Hücreler (10 X büyütme gibi Leica DMIL olarak ters mikroskop) bir mikroskop altında, bir hücre içine ayrışmış olup olmadığını belirler. Gerekirse inkübasyon uzatır. </li><li> Hemasitometre kullanarak organoid başına hücre sayımı ve organoid başına hücre sayısını hesaplamak. Yaklaşık 200 um bir çapa sahip insan gastrik organoids yaklaşık 4000 hücreleri vardır. 50 yaklaşık MOI&#39;de ml sonuçları başına 1 x 10 9 bakterilerle bakteriyel çözelti 0,2 ul enjeksiyonu. </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> Organoids enjeksiyonu. Not: Mikroenjeksiyon için, cam iğne bir micromanipulator tarafından 3 boyutlu manevra edilebilen bir tutucu, stabilize edilir. Organoids oyuk içindeki temel matris içinde kalır. Nedeniyle kuyudaki boyutu ve konumlandırma, tüm organoids eşit bir vardırenjeksiyon menable. Genellikle, tek bir kuyuda 30 büyük organoids 5 dakika içinde hedeflenebilir. <ol><li> Hasat bakteri ve standart protokoller 24&#39;e göre bazal ortamda yıkayın. </li><li> Optik yoğunluğuna göre, ml başına bakteri sayısını hesaplayın (adım 3.1.5.1 bakınız). Bazal ortam içinde, ml başına 1 x 10 9, bakteride bakteriye seyreltilir. </li><li> Bir cam iğne atın. Açılış yaklaşık 10 mikron genişliğinde olacak şekilde kullanılması forseps ucu bölünürler. </li><li> Enjeksiyon tutucu içine iğne takın ve mikromanipülatör düzeltmek. </li><li> Iğne içine yaklaşık 10 ul bakteri çözümü alın. </li><li> Stereomicroscope altında organoid kültürleri içeren düşük kenarlı 4 plaka koyun. </li><li> Mikromanipülatör ile gezinme, iğne ile tek organoids hedef. Organoid yakın iğne yerleştirin ve sonra bir hızlı hareketi ile organoid içine iğne takın. Approximatel enjekteher birine y 0,2 ul bakteri solüsyonu mikroenjektör kullanılarak organoid. </li></ol></li><li> Herhangi Analiz Hasat Organoids. <ol><li> Örnek olarak, 4 saat sonra organoids düzeltin. Süpernatantı ve 1 ml% 2 formaldehid ilave edildi ve 4 ° C&#39;de, oda sıcaklığında ya da O / N 20 dakika inkübe edilir. Organoids, standart prosedürlere uygun olarak 25 immünohistokimya için işlenebilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Aiuto, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Models+to+Investigate+Human+Cytomegalovirus+Infection+in+Neural+Cells.">Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Models to Investigate Human Cytomegalovirus Infection in Neural Cells.</a> PLoS ONE. 7 (11), e49700 (2012).</li><li>Penkert, R. R., Kalejta, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Embryonic+Stem+Cell+Lines+Model+Experimental+Human+Cytomegalovirus+Latency.">Human Embryonic Stem Cell Lines Model Experimental Human Cytomegalovirus Latency.</a> mBio. 4 (3), e00298-13-e00298-13 (2013).</li><li>Roelandt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes+support+complete+replication+of+hepatitis+C+virus.">Human pluripotent stem cell-derived hepatocytes support complete replication of hepatitis C virus.</a> J Hepatol. 57 (2), 246-251 (2012).</li><li>Schwartz, R. E., Trehan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+hepatitis+C+virus+infection+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling hepatitis C virus infection using human induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (7), 2544-2548 (2012).</li><li>Shlomai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+host+interactions+with+hepatitis+B+virus+using+primary+and+induced+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocellular+systems.">Modeling host interactions with hepatitis B virus using primary and induced pluripotent stem cell-derived hepatocellular systems.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 111 (33), 12193-12198 (2014).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Productive+Hepatitis+C+Virus+Infection+of+Stem+Cell-Derived+Hepatocytes+Reveals+a+Critical+Transition+to+Viral+Permissiveness+during+Differentiation.">Productive Hepatitis C Virus Infection of Stem Cell-Derived Hepatocytes Reveals a Critical Transition to Viral Permissiveness during Differentiation.</a> PLoS Pathogens. 8 (4), e1002617 (2012).</li><li>Yoshida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+hepatocyte-like+cells+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+hepatocytes+in+hepatitis+C+virus+infection.">Use of human hepatocyte-like cells derived from induced pluripotent stem cells as a model for hepatocytes in hepatitis C virus infection.</a> Biochem Biophys Res Commun. 416 (1-2), 119-124 (2011).</li><li>Ng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-Derived+Hepatocyte-like+Cells+Support+Plasmodium+Liver-Stage+Infection+In+Vitro.">Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Support Plasmodium Liver-Stage Infection In Vitro.</a> Stem Cell Report. 4 (2), (2015).</li><li>Klotz, C., Aebischer, T., Seeber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+cell+cultures+and+organoids+for+protozoan+parasite+propagation+and+studying+host-parasite+interaction.">Stem cell-derived cell cultures and organoids for protozoan parasite propagation and studying host-parasite interaction.</a> Int J Med Microbiol. 302 (4-5), 203-209 (2012).</li><li>Engevik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+NHE3+alters+gut+microbiota+composition+and+influences+Bacteroides+thetaiotaomicron+growth.">Loss of NHE3 alters gut microbiota composition and influences Bacteroides thetaiotaomicron growth.</a> AJP: GI. 305 (10), G697-G711 (2013).</li><li>Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+intestinal+organoid+model+of+non-invasive+enteric+pathogen-epithelial+cell+interactions.">A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions.</a> Mucosal Immunol. 8 (2), 352-361 (2015).</li><li>McCracken, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+human+development+and+disease+in+pluripotent+stem-cell-derived+gastric+organoids.">Modelling human development and disease in pluripotent stem-cell-derived gastric organoids.</a> Nature. 516 (7531), 400-404 (2014).</li><li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Expansion+of+Human+Gastric+Epithelial+Stem+Cells+and+Their+Responses+to+Bacterial+Infection.">In Vitro Expansion of Human Gastric Epithelial Stem Cells and Their Responses to Bacterial Infection.</a> Gastroenterology. 148 (1), (2014).</li><li>Schlaermann, P., Toelle, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+gastric+primary+cell+culture+system+for+modelling+Helicobacter+pylori+infection+in+vitro.">A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro.</a> Gut. , (2014).</li><li>Bertaux-Skeirik, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+Plays+a+Functional+Role+in+Helicobacter+pylori-induced+Epithelial+Cell+Proliferation.">CD44 Plays a Functional Role in Helicobacter pylori-induced Epithelial Cell Proliferation.</a> PLOS Pathogens. 11 (2), e1004663 (2015).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt+villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+Expansion+of+Epithelial+Organoids+From+Human+Colon,+Adenoma,+Adenocarcinoma,+and+Barrett's+Epithelium.">Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5+ve+Stem+Cells+Drive+Self-Renewal+in+the+Stomach+and+Build+Long-Lived+Gastric+Units+In+Vitro.">Lgr5+ve Stem Cells Drive Self-Renewal in the Stomach and Build Long-Lived Gastric Units In Vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Culture+of+Genome-Stable+Bipotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Liver.">Long-Term Culture of Genome-Stable Bipotent Stem Cells from Adult Human Liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Models+of+Human+and+Mouse+Ductal+Pancreatic+Cancer.">Organoid Models of Human and Mouse Ductal Pancreatic Cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li><li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+single-cell+imaging+of+NF-kappaB+oscillations+using+monoclonal+cell+lines.">High-throughput and single-cell imaging of NF-kappaB oscillations using monoclonal cell lines.</a> BMC cell. 11, 21 (2010).</li><li>Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+Maintenance+of+Helicobacter+Species.">Laboratory Maintenance of Helicobacter Species.</a> Curr Protoc Microbiol. , (2006).</li><li>Van Es, J. H., de Geest, N., van de Born, M., Clevers, H., Hassan, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+stem+cells+lacking+the+Math1+tumour+suppressor+are+refractory+to+Notch+inhibitors.">Intestinal stem cells lacking the Math1 tumour suppressor are refractory to Notch inhibitors.</a> Nat Commun. 1 (2), 1-5 (2010).</li><li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Video+Protocol+of+Retroviral+Infection+in+Primary+Intestinal+Organoid+Culture.">A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture.</a> J Vis Exp. (90), (2014).</li><li>Stange, D. E., Koo, B. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+Troy++Chief+Cells+Act+as+Reserve+Stem+Cells+to+Generate+All+Lineages+of+the+Stomach+Epithelium.">Differentiated Troy+ Chief Cells Act as Reserve Stem Cells to Generate All Lineages of the Stomach Epithelium.</a> Cell. 155 (2), 357-368 (2013).</li><li>Van de Wetering, M., Sancho, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta-catenin/TCF-4+complex+imposes+a+crypt+progenitor+phenotype+on+colorectal+cancer+cells.">The beta-catenin/TCF-4 complex imposes a crypt progenitor phenotype on colorectal cancer cells.</a> Cell. 111 (2), 241-250 (2002).</li><li>Schumacher, M. A., Aihara, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+murine-derived+fundic+organoids+in+studies+of+gastric+physiology.">The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology.</a> Journal Physiol. 593 (8), 1809-1827 (2015).</li><li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. -. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+BAC+Transgenic+Epithelial+Organoids.">Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids.</a> PLoS ONE. 8 (10), e76871 (2013).</li><li>Koo, B. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nat Meth. 9 (1), 81-83 (2012).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li><li>Li, V. S. W., Ng, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Signaling+through+Inhibition+of+&#946;-Catenin+Degradation+in+an+Intact+Axin1+Complex.">Wnt Signaling through Inhibition of &#946;-Catenin Degradation in an Intact Axin1 Complex.</a> Cell. 149 (6), 1245-1256 (2012).</li><li>Van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+derivation+of+a+'Living+Organoid+Biobank'+of+colorectal+cancer+patients.">Prospective derivation of a 'Living Organoid Biobank' of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li></ol>

Hans Clevers is an inventor on several patents for organoid culture. Otherwise the authors have nothing to disclose.

This protocol describes the use of ever-expanding, untransformed primary organoids from adult stem cells for infection biology. Critical steps are i) the isolation of viable glands, ii) expansion of organoids and iii) the microinjection. Below are some suggestions for modifications, troubleshooting and technical considerations. 
Compared to other isolation methods, which use vigorous shaking or pipetting to release glands and can be equally successful, the technique presented here has the adva...

Patojenlerin çalışma, in vivo enfeksiyon taklit etmek için yeterli bir model sistemler kullanır. Kullanılan sistemlerin bazı optimum uzak iken bazı enfektif ajanlar için yeterli model sistemler eksiktir. Bir örnek nedensel mide kanseri gelişimi ile ilgilidir mide bakterisi Helicobacter pylori (H. pylori) &#39;dir. Yine daha uygun bir hücre kültürü sisteminde yokluğunda amacı birçok çalışma, kanserli kaskadının son nokta temsil kanser gelişimi kullanımı kanser hücre çizgisi altında yatan moleküler mekanizmaların, analiz etmek. Primer, dönüştürülmemiş hücreler bu çalışmalar için daha iyi bir model olabilir. Bununla birlikte, birincil hücreler donör az sayıda kullanılabilir ve daha uzun süreler boyunca kültüre olamaz. Son yıllarda, kök hücre araştırmaları enfeksiyon biyoloji çalışma için primer hücre kültürleri için yeni kaynaklar sağlamak için önemli bir ilerleme kaydetmiştir. Dan KültürlerÜç kök hücre kaynağı kullanılmıştır: Embriyonik kök hücreler (ESC), uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSC) ya da erişkin kök hücreler. Bunlar, Sitomegalovirüs, 1,2 veya Hepatit C virüsü gibi virüsler, enfeksiyonlar modellemek için kullanılmıştır 3-7, örneğin Bacterioides thetaiotaomicron 10 veya Salmonella enterica 11 olarak Plasmodium falciparum 8 veya 9, Toxoplasma gondii ve bakteriler gibi parazitler. En son, çeşitli yaklaşımlar H. enfeksiyonu modellemek için yayınlanmıştır 15 - ESC veya iPS hücrelerinin 12, fare yetişkin kök hücrelerin 21,22 ya da insan erişkin kök hücreleri 13 türetilen organoids ile pylori. Yetişkin kök hücrelerinden organoid kültürlerinin gelişmesi sıçangil bağırsak epiteli izole tek kök hücre, bir 3-boyutlu bir matris içine ekildi bir çalışmada, gelen veKemik morfojenik protein (BMP) 16 sinyalizasyon inhibe Wnt sinyalizasyon ve Noggin geliştirmek için mitojendir, R-spondin olarak EGF içeren bağırsak kök hücrelerin çevreye taklit ortamda gömülü. Özellikle, bu kültürler mezenkimal hücreler ile birlikte kültür gerektirmez. Bu koşullar altında, kök hücreler çoğalmaya ve etki bağırsak kript hücreleri barındıran küçük yapılar oluşturur, ve bağırsak villuslarının hücreleri içeren alan. Organoids böylece in vivo durumu taklit etmek kendini düzenliyoruz. Bugün birçok fare ve insani dokulardan yetişkin kök hücrelerin in vitro ve yetiştirilebilir gibi ince bağırsak ve kolon 17, mide 13,18, karaciğer 19,20 olarak in vivo meslektaşı benzeyen organoids içine kendini organize pankreas 21 ve Prostat 22. Burada yetişkin kök cel kültür fare veya insan mide organoids bir video protokol sağlarls H. ile Microinject ve pylori. Bu protokol daha önceki raporlarda 13,18 dayanmaktadır. Bu yöntem, kültürlenmesi ve intestinal organoids gibi diğer organoid kültürleri enfekte edilmesi için adapte edilebilir.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, GFR, phenol free</td>
			<td>BD</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-079</td>
			<td>Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Stock concentration 50 x, final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td>Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine recombinant EGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PMG8043</td>
			<td>Stock concentration 500 &#181;g/mL, final concentration 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/mL, final concentration 200 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#946;i A-83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>Stock concentration 500 &#181;M, final concentration 2 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;M, final concentration 1 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RHOKi Y-27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt3A conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 50%. Cells can be obtained from Hans Clevers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin1 conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable cell line generated in the Kuo Lab. Final concentration 10%. Cell line can be obtained from Calvin Kuo, Stanford.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 10%. Cells can be obtained from Hans Clevers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin3</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3500-RS/CF</td>
			<td>Alternative source for R-spondin. This has been tested on human intestine organoids (1 &#181;g/mL), but not yet on gastric organoids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10</td>
			<td>Alternative source for noggin. This has been tested on human intestine organoids (100 ng/mL), but not yet on gastric organoids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Enzymatic dissociation solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell&#174; Alcohol-Free Cell Freezing Containers</td>
			<td>biocision</td>
			<td>BCS-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12648-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>An antibiotics composition agains bacteria and fungi. It is helpful after initiation of a culture. For long term culture you can switch to other antibiotics or none.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stock concentration 10000/10000 U/mL, final concentration 100/100 U/mL. Can be used alternatively to Primocin in long term culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Neolabs</td>
			<td>2-1033</td>
			<td>Tweezers with fine tips are helpful for the removal of muscle layer from the tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 Well Multidishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>144444</td>
			<td>You can use other Multidishes. These were particularly helpful for microinjections because they have a low outer rim and allow more mobility for the manipulator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-5B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Workbench</td>
			<td>Clean Air</td>
			<td></td>
			<td>Custom made to fit the stereomicroscope in ML2 condition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cappillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC100T-10</td>
			<td>1 mm outer diameter, 0,78 mm inner diameter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Flaming Brown Micropipette Puller</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti Cag A antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-25766</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of helicobacter pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

Bu protokol, gastrik bezleri (Şekil 2) ayrılmasına izin verir. Bezler organoids içine bezleri büyümeye izin laminin ve kolajen bakımından zengin bir 3 boyutlu bir çerçeve (Şekil 3) sağlanması, bir kuyu içinde damla olarak katılaşan temel matris içine ekilir. Organoids tipik haliyle küçük kistler başlar ve 12-16 gün içinde, bunlar 50-300 um (Şekil 4) bir çapa sahip olan küreler genişletmek. Bazı organoids bazı küçük buddings geliştirecek,...

Watch this Scientific Journal Video about Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori at JoVE.com

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

Enfeksiyon Hastalıkları Modeli Olarak Organoids: Helicobacter Pylori ve İnsan Kültür ve kemirgen Mide Organoids ve Mikroenjeksiyon

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

organoids-as-model-for-infectious-diseases-culture-human-murine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

35.1K Görüntüleme.  University Medical Centre Utrecht. Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

Video: Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Vero Hücre Kültür Testi ile Alan toplanan Sivrisinekler Enfeksiyon Virüs Algılama

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

MALDI-TOF kütle spektrometrisi kullanılarak kan kültür besi yerinden, Gram negatif bakterilerin hızlı belirlenmesi

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2. H. pylori is the primary cause of gastric cancer, the second leading cause of cancer-related deaths worldwide3. One virulence factor that has been associated with increased risk of gastric disease is the Cag-pathogenicity island, a 40-kb region within the chromosome of H. pylori that encodes a type IV secretion system and the cognate effector molecule, CagA4,5. The Cag-T4SS is responsible for translocating CagA and peptidoglycan into host epithelial cells5,6. The activity of the Cag-T4SS results in numerous changes in host cell biology including upregulation of cytokine expression, activation of proinflammatory pathways, cytoskeletal remodeling, and induction of oncogenic cell-signaling networks5-8. The Cag-T4SS is a macromolecular machine comprised of sub-assembly components spanning the inner and outer membrane and extending outward from the cell into the extracellular space. The extracellular portion of the Cag-T4SS is referred to as the &#8220;pilus&#8221;5. Numerous studies have demonstrated that the Cag-T4SS pili are formed at the host-pathogen interface9,10. However, the environmental features that regulate the biogenesis of this important organelle remain largely obscure. Recently, we reported that conditions of low iron availability increased the Cag-T4SS activity and pilus biogenesis. Here we present an optimized protocol to grow H. pylori in varying conditions of iron availability prior to co-culture with human gastric epithelial cells. Further, we present the comprehensive protocol for visualization of the hyper-piliated phenotype exhibited in iron restricted conditions by high resolution scanning electron microscopy analyses.

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Here we describe a method to visualize the oncogenic bacterial organelle known as the Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). We find that the Cag-T4SS is differentially produced on the surface of H. pylori in response to varying conditions of iron availability.

Yüksek çözünürlüklü elektron mikroskobu<em&gt; Helikobakter pilori</emDemir Kullanılabilirlik Değişen Koşullarda Üretilen&gt; Çağ Tip IV Salgı Sistemi Pili

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

Fare Küçük Bağırsak Lenfositler izolasyonu ve Akım Sitometrisi Karakterizasyonu

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

The Madagascar Hissing Cockroach as an Alternative Non-mammalian Animal Model to Investigate Virulence, Pathogenesis, and Drug Efficacy

Many aspects of innate immunity are conserved between mammals and insects. An insect, the Madagascar hissing cockroach from the genus Gromphadorhina, can be utilized as an alternative animal model for the study of virulence, host-pathogen interaction, innate immune response, and drug efficacy. Details for the rearing, care and breeding of the hissing cockroach are provided. We also illustrate how it can be infected with bacteria such as the intracellular pathogens Burkholderia mallei, B. pseudomallei, and B. thailandensis. Use of the hissing cockroach is inexpensive and overcomes regulatory issues dealing with the use of mammals in research. In addition, results found using the hissing cockroach model are reproducible and similar to those obtained using mammalian models. Thus, the Madagascar hissing cockroach represents an attractive surrogate host that should be explored when conducting animal studies.

We present a protocol to utilize the Madagascar hissing cockroach as an alternative non-mammalian animal model to conduct bacterial virulence, pathogenesis, drug toxicity, drug efficacy, and innate immune response studies.

Hamam böceği virülans, Patogenez ve uyuşturucu etkinliği araştırmak için alternatif bir Non-memeli hayvan Model tıslama Madagaskar

Many aspects of innate immunity are conserved between mammals and insects. An insect, the Madagascar hissing cockroach from the genus Gromphadorhina, can ...

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in humans. Several mouse models of gastric Helicobacter infection have been developed to study the molecular and cellular mechanisms whereby H. pylori bacteria colonize the stomach of human hosts and cause disease. Herein, we describe protocols to: 1) prepare bacterial suspensions for the in vivo infection of mice via intragastric gavage; 2) determine bacterial colonization levels in mouse gastric tissues, by polymerase chain reaction (PCR) and viable counting; and 3) assess pathological changes, by histology. To establish Helicobacter infection in mice, specific pathogen-free (SPF) animals are first inoculated with suspensions (containing &#8805;105 colony-forming units, CFUs) of mouse-colonizing strains of either Helicobacter pylori or other gastric Helicobacter spp. from animals, such as Helicobacter felis. At the appropriate time-points post-infection, stomachs are excised and dissected sagittally into two equal tissue fragments, each comprising the antrum and body regions. One of these fragments is then used for either viable counting or DNA extraction, while the other is subjected to histological processing. Bacterial colonization and histopathological changes in the stomach may be assessed routinely in gastric tissue sections stained with Warthin-Starry, Giemsa or Haematoxylin and Eosin (H&#38;E) stains, as appropriate. Additional immunological analyses may also be undertaken by immunohistochemistry or immunofluorescence on mouse gastric tissue sections. The protocols described below are specifically designed to enable the assessment in mice of gastric pathologies resembling those in human-related H. pylori diseases, including inflammation, gland atrophy and lymphoid follicle formation. The inoculum preparation and intragastric gavage protocols may also be adapted to study the pathogenesis of other enteric human pathogens that colonize mice, such as Salmonella Typhimurium or Citrobacter rodentium.

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Mice represent an invaluable in vivo model to study infection and diseases caused by gastrointestinal microorganisms. Here, we describe the methods used to study bacterial colonization and histopathological changes in mouse models of Helicobacter pylori-related disease.

Fare modelleri Helicobacter enfeksiyonu ve gastrik patolojiler

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, including cell biology, oncology, dentistry, and immunology. The SMG is an exocrine gland comprised of secretory epithelial cells, myofibroblasts, endothelial cells, nerves, and extracellular matrix. Dynamic cellular processes in the rat and mouse SMG have previously been imaged, mostly using inverted multi-photon microscope systems. Here, we describe a straightforward protocol for the surgical preparation and stabilization of the murine SMG in anesthetized mice for in vivo imaging with upright multi-photon microscope systems. We present representative intravital image sets of endogenous and adoptively transferred fluorescent cells, including the labeling of blood vessels or salivary ducts and second harmonic generation to visualize fibrillar collagen. In sum, our protocol allows for surgical preparation of mouse salivary glands in upright microscopy systems, which are commonly used for intravital imaging in the field of immunology.

We describe a protocol to surgically expose and stabilize the murine submandibular salivary gland for intravital imaging using upright intravital microscopy. This protocol is easily adaptable to other exocrine glands of the head and neck region of mice and other small rodents.

Dik Intravital mikroskopi için fare Submandibular Tükürük bezi hazırlanması

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular mechanisms underlying the production of the vast repertoire of antibodies by the acquired immune systems, it has not yet been possible to arrive at a global view of a complete antibody repertoire. In particular, B cell repertoires have been regarded as a black box because of their astronomical number of antibody clones. However, next-generation sequencing technologies are enabling breakthroughs to increase our understanding of the B cell repertoire. In this report, we describe a simple and efficient method to visualize and analyze whole individual mouse and human antibody repertoires. From the immune organs, representatively from spleen in mice and peripheral blood mononuclear cells in humans, total RNA was prepared, reverse transcribed, and amplified using the 5&#39;-RACE method. Using a universal forward primer and antisense primers for the antibody class-specific constant domains, antibody mRNAs were uniformly amplified in proportions reflecting their frequencies in the antibody populations. The amplicons were sequenced by next-generation sequencing (NGS), yielding more than 105 antibody sequences per immunological sample. We describe the protocols for antibody sequence analyses including V(D)J-gene-segment annotation, a bird&#39;s-eye view of the antibody repertoire, and our computational methods.

Here, we describe protocols for the analysis and visualization of the structure and constitution of whole antibody repertoires. This involves the acquisition of vast sequences of antibody RNA using next-generation sequencing.

Fare ve insan antikoru kapsayacağını tarafından yeni nesil sıralama

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected in the urinary tract. The protocol can be broadly divided into three sections: the infection, bladder epithelial cell harvesting, and mouth micropipetting to isolate individual infected epithelial cells. The isolated epithelial cell contains viable bacterial cells and is nearly free of contaminating extracellular bacteria, making it ideal for downstream single-cell analysis. The time taken from the start of infection to obtaining a single intracellular bacterial community is about 8 h. This protocol is inexpensive to deploy and uses widely available materials, and we anticipate that it can also be utilized in other infection models to isolate single infected cells from cell mixtures even if those infected cells are rare. However, due to a potential risk in mouth micropipetting, this procedure is not recommended for highly infectious agents.

This protocol describes a simple method of isolating single, infected-bladder epithelial cells from a murine model of urinary tract infection.

İdrar yolu enfeksiyonu aşağı akım tek hücreli analiz için bir fare modelinden oluşturulan tek hücre içi bakteriyel toplulukların yalıtım

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...

Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 per codon, the actual error rates vary widely, depending on the species, environment, and codons being studied. We have previously shown that mycobacteria use a two-step pathway for the generation of aminoacylated glutamine and asparagine tRNAs and that this is specifically associated with relatively high error rates due to the modulation of mistranslation rates by an essential component of the pathway, the amidotransferase GatCAB. We modified a previously employed Renilla-Firefly dual-luciferase system that had been used to measure mistranslation rates in Escherichia coli for use in mycobacteria to measure specific mistranslation rates of glutamate at glutamine codons and aspartate for asparagine codons. Although this reporter system was suitable for the accurate estimation of specific error rates, lack of sensitivity and requirements for excessive manipulation steps made it unsuitable for high-throughput applications. Therefore, we developed a second gain-of-function reporter system, using Nluc luciferase and green fluorescent protein (GFP), which is more amenable to medium/high-throughput settings. We used this system to identify kasugamycin as a small molecule that can decrease mycobacterial mistranslation. Although the reporters that we describe here have been used to measure specific types of mycobacterial mistranslation, they may be modified to measure other types of mistranslation in a number of model systems.

In this article, we present two complementary methods to measure specific rates of translational error and mistranslation in the model mycobacterium, Mycobacterium smegmatis, using gain-of-function reporter systems. The methods can be employed to measure accurate error rates in low throughput or relative error rates in a more high-throughput setting.

Fonksiyon kazancı Reporter sistemleri ile spesifik Mikobakteriyel güvenirlik oranlarının ölçülmesi

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 ...