Bu protokol, insan bağırsak epitel yanıtında viral enfeksiyona karşı bireysel hücre tiplerini nasıl ortaya olduğunu anlamamızı sağlar. Burada, enfeksiyon rotasının hücrenin nasıl tepki verdiğini nasıl etkileyebileceğine değinmek için insan bağırsak organoidlerini tohumlamak için üç bağımsız yol sunuyoruz. Kategori 3 patojenleri ile çalışırken uyulması gereken biyogüvenlik yönetmeliklerini göz önünde bulundurarak tek hücreli RNA dizilimi için örneklerin nasıl hazırlanacağını vurguluyoruz.
Bu yöntem diğer patojenlere ve organoid kültürlere kolayca uyarlanabilir. En önemli husus, organoid modellerinizin seçilen tohumlama yöntemi ile tamamen farklılaşmasını ve viral enfeksiyonu destekleyebilmesini sağlamaktır. Enfekte organoidleri hasat etmeden önce, tek hücreli jel boncukları eksi 80 santigrat dereceden çıkarın ve oda sıcaklığına ısıtın.
Ayrıca, RT reaktifini, B maddesini ve RT enzimI C'yi oda sıcaklığına düşürerek aşındırın ve üreticinin talimatlarında açıklandığı gibi şablon anahtarı oligosunu yeniden uygulayın. Daha sonra, BSL-3 patojeni ile enfekte olmuş 3D organoidleri toplamak için, hücre kültürü plakasını inkübatörden çıkarın ve hücre kültürü başlığına yerleştirin. Daha sonra bir P1000 pipet kullanarak, 24 kuyu plakasının her kuyusundan farklılaşma medyasını çıkarın, her kuyuya 500 mikrolitre buz gibi PBS ekleyin ve oda sıcaklığında üç dakika kuluçkaya yatırın.
Daha sonra, hücre dışı matris çözeltisini tamamen bozmak için, PBS, hücre dışı matris ve organoidleri yeniden harcamak için 10 kez pipet yukarı ve aşağı, ardından yeniden sulandırılmış organoidleri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve tüpleri buza yerleştirin. Her enfeksiyon durumunu ayrı 15 mililitre konik tüplerde toplayın. Eldivenleri değiştirdikten sonra, tüpün dışını temizleyin ve tüpü hücre kültürü başlığından çıkarın.
Örnekleri beş dakika döndür. Tüpü hücre kültürü başlığına geri taşıyın ve PBS'yi çıkarın, organoidin peletinin tüpün altından yeniden taşınmasını önleyin. Daha sonra, peletin bir mililitrelik ayrışma enziminde yeniden süz.
ardından eldivenleri değiştirin, tüpü temizleyin ve numuneleri 37 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya bırakın. Kuluçka sırasında, tüpü her 10 dakikada bir hücre kültürü başlığına geri taşıyın ve yukarı ve aşağı pipetleme yaparak organoidleri yeniden dirildirin. Organoidlerin tek hücrelere ayrışıp dağılmamasını belirlemek için, organoid süspansiyonun 10 mikrolitresini P10 pipet kullanarak tek kullanımlık bir plastik hücre tezgahı kaydırağına yerleştirin, ardından numune giriş portu net bantla kapatın.
Eldivenleri değiştirdikten sonra, hücre sayacının dışını temizleyin ve brightfield mikroskobu kullanarak tek bir hücre süspansiyonu oluşturulduğunu onaylayın. Tek hücreli süspansiyonun onaylanmasından sonra, %10 FBS ve pipet içeren bir mililitre DMEM F12 ortamı ekleyerek sindirimi durdurun. Sonra eldivenleri değiştirin, tüpü temizleyin ve örneği döndürün.
Santrifüjlemeden sonra, alttaki hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat ederek, ayrışma enzimini içeren ortamı dikkatlice çıkarın. Ardından, tek hücreleri %0,1 BSA içeren en az PBS hacminde yeniden biriktirin. Hücre süspansiyonunu büyük kümeleri çıkarmak için bir filtreden bir FACS tüpüne geçirdikten sonra, tüpü buza yerleştirin.
Daha sonra, mikrolitre başına hücre sayısını belirlemek için, tek kullanımlık bir plastik hücre sayma odasına hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini ekleyin. Ardından, örneği hücre kültürü davlumbazından çıkarmadan önce örnek giriş portunu şeffaf bantla kapatın. Eldivenleri değiştirin, hücre sayma odasını temizleyin, sonra Brightfield mikroskobu kullanarak hücre sayısını sayın.
Daha sonra, hücre kültürü başlığının içinde, deneydeki numune sayısına bağlı olarak üreticinin talimatlarına göre 1,5 mililitrelik bir tüpte RT reaktifi, şablon anahtarı oligo, azaltıcı B ve RT enzim C'nin ana karışımını hazırlayın. Her örnek için, bir PCR tüpüne aliquot 33.4 mikrolitre ana karışım, daha sonra hedef hücre numarasına göre ana karışıma hücreleri ve suyu ekleyin. Eldivenleri değiştirdikten sonra, tek hücre denetleyicisini hücre kültürü başlığına taşıyın ve çipi hazırlayın.
Ardından, tek hücreli çipi talaş tutucusuna ekleyin ve kullanılmayan şeritleri% 50 gliserol ile doldurun. Ana karışımı, boncukları ve bölme yağını üreticinin talimatlarına göre numune içeren şeritlere ekleyin ve çipi bir conta ile örtün. Çipi denetleyiciye yükledikten sonra programı başlatın.
Programın tamamlanmasından sonra, çipi ve contayı çıkarın, ardından çok kanallı bir pipet kullanarak, PCR tüplerini temizlemek için emülsiyonların 100 mikrolitresini aktarın. Her emülsiyon, tam bir emülsiyon oluştuğunu gösteren tekdüze bir beyaz renge sahip olduğundan emin olun. Eldivenleri değiştirdikten ve tüpleri temizledikten sonra PCR tüplerini bir PCR makinesine aktarın ve programı başlatın.
PCR çalışmasının sonunda, zarflı virüslerin çoğu inaktive edilecektir. Bir, üç, beş ve yedi kez bölünen organoidlerin temsili Brightfield görüntüleri burada gösterilmiştir. Ortalama olarak, organoidler merkezler karardığında haftada bir kez bölünür.
Ortam koşullarını değiştirerek, Wnt-3a'yı çıkararak ve R-spondin ve noggin azaltarak, insan bağırsağı içinde bulunan hücresel karmaşıklık taklit edilebilir. Normalde, Paneth hücrelerine, kadeh hücrelerine ve enterositlere doğru hücresel farklılaşma dört günlük farklılaşma ortamı gerektirir. SARS-CoV-2 enfekte insan kolonu ve ileum türevi organoidlerden elde edilen tek hücreli dizileme verilerinin analizi, 12 ve 24 saat sonra sars-CoV-2 enfeksiyonunu sadece insan bağırsak epitel hücrelerinin bir alt nüfusunun desteklediğini göstermiştir.
SARS-CoV-2 enfekte kolon kaynaklı organoidlerde doğuştan gelen immün yanıtların analizi, SARS-CoV-2'nin enfekte olmuş hücrelerde pro-enflamatuar bir sinyal kaskadına neden olduğunu, enfekte olmayan seyirci hücrelerinin ise interferon aracılı immün yanıt gösterdiğini göstermiştir. Ek olarak, tek hücreli RNA dizilimi, enfekte hücrelerin yolun virüs aracılı tıkanması nedeniyle interferonları hissedemediğini göstermiştir. Organoidler iyi ayırt edilmeli ve sağlıklı olmalıdır.
Enfeksiyondan önce qPCR ile hücre farklılaşma belirteçlerinin seviyesi belirlenerek kontrol edilebilir. Hücreler iyi ayırt edilmezse, viral enfeksiyonu desteklemez ve bilgilendirici olmayan sonuçlara yol açar. Bu teknik hem ışık ve doku tarafından mukozayı enfekte etmemizi sağlar.
Bu, bir tarafta kirli bir ortamı, diğer tarafta steril bir ortamı tolere etmek için mukozal yüzeyler tarafından kullanılan mekanizmaları çözmemizi sağladığı için çok önemlidir.
