Standartlaştırılmış optogenetik protokol, mühendislik ürünü memeli hücre sistemlerinde hücresel özellikleri kontrol etmek için ışığı uyaran olarak kullanmakla ilgilenen laboratuvarlar için tasarlanmıştır. Bu protokolün optogenetiğe aşina olmayan laboratuvarlarda uygulanması kolaydır ve mühendislik biyolojik sistemlerinin hassas mekansal zamansal kontrolü için yöntemler sağlar. Bu yöntem, kanser biyolojisi, sistem biyolojisi ve doku farklılaşması dahil olmak üzere mekansal zamansal bilgilerin önemli olabileceği belirli araştırma alanlarında geniş bir uygulama alanına sahiptir.
Başlangıç olarak, tek bir gen devresine veya plazmidine bağlanacak genetik bileşenleri seçin. Örneğin, memeli DNA entegrasyon bölgeleri, ışığa duyarlı elementler veya fonksiyonel genler. Başlangıç kodonları, düzenleyici veya çevrilmiş diziler gibi gerekli tüm özellikleri bir araya getirdikten ve inceledikten sonra, herhangi bir genetik mühendisliği ve moleküler klonlama yazılımı kullanın, DNA dizilerine daha sonra kullanmak ve referans olarak açıklama ekleyin ve saklayın.
Astarları, plazmid yapımı için hesaplamalı olarak, yerleşik moleküler klonlama yazılımı özellikleri, örneğin dizi hizalaması aracılığıyla doğrulayın. Kararlı bir hücre hattı oluşturmak için, uygun rekombinaz ile gen devresi DNA'sının lipozom karışımını kullanarak tasarım gen devrelerini ve istenen hücreleri transfekte edin. Hücreler% 80 ila% 100 birleştikten sonra,% 45 eski ortam,% 45 taze ortam ve% 10 DMSO karışımında hücreleri dondurun.
Kalan hücreleri steril bir tüpe aktarın ve monoklonal hücreleri 96 delikli bir plakaya izole etmek için tek hücreli sıralama yapın. Monoklonal sıralamadan yaklaşık iki ila üç hafta sonra, 96 delikli plaka içindeki kuyucukların odakları olmalıdır. % 50 ila% 60 akıcılık elde edildiğinde, hücreleri 12 delikli bir plakaya bölün.
Ürün yazılımını bir mikrodenetleyici programcısı kullanarak monte edilmiş LPA devresine ekleyin. Daha sonra, montaj plakası, devre kartı, LED ara parça, plaka adaptörü, 24 delikli bir plaka, bir plaka kapağı, montaj cıvataları, kanat somunları ve istifleme bileşenlerini kullanarak monte edilmiş devre kartındaki 3D baskılı parçaları birleştirin. Bir optogenetik deneye başlamak için, LPA için bir SD kart programlamak ve uygun ışık koşullarını keşfetmek için Tabor Lab web sitesinde bulunan Iris yazılımını kullanın.
Ardından, istenen deneysel anahat için teknik kopyalarla yoğunluk değerlerini girin. Toplam 500 mikrolitre hacimde 24 kuyucuklu siyah bir plakaya kuyucuk başına yaklaşık 75.000 hücre ekleyin, ardından hücreleri iki ila altı saat boyunca yerleşmelerini sağlamak için% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin. Kuluçka sonunda doku kültürü davlumbazındaki hücreleri aktardıktan sonra, plastik kapağı çıkarın ve kuyucuklar arasındaki ışık transferini en aza indirmek için plakanın üstüne yapışkan bir folyo şerit ekleyin, böylece ışık yalnızca kuyunun dibinde bulunan LED'den girebilir.
Plakayı LPA'nın takılı 3D parçalarına yerleştirin, ardından plakayı her köşedeki cihaz vidalarının üzerine oturan 3D baskılı LPA kapağıyla örtün. Güncellenmiş LPA deney ayarlarının uygulandığından emin olmak ve hücreleri inkübe etmek için cihazı güç kaynağına takın ve LPA cihazındaki sıfırlama düğmesine basın. Kuluçkadan sonra, doku kültürü davlumbazının içinde, folyo şeridini plakadan çıkarın ve plastik kapakta yoğuşmanın oluşmasını önlemek için plakayı bir ila iki dakika bekletin.
Ardından, orijinal plastik kapağı tekrar plakaya koyun ve hücreleri uygun faz kontrastı veya floresan mikroskobu ile görüntüleyin. İndüksiyondan 24 ila 72 saat sonra, ardından tripsinizasyon, yaklaşık 500 mikrolitrelik her bir kuyucuğun tüm içeriğini hücre süzgeci ile donatılmış etiketli tüplere aktarın. Daha sonra uygun akış sitometri cihazı yazılımını kullanarak, enkaz ve hücresel kümeleri dışlamak için uygun boyut ve granülerlikteki tek hücreleri yakalamak için bir ileri ve yan saçılma kapısı oluşturun.
Kapı ayarlandıktan sonra, uygun kapıyla yaklaşık 10.000 hücre yakalayın ve gerekli hücresel veri miktarına bağlı olarak hücre sayısını ayarlayın ve her tüpteki deneysel hücreleri yakalamayı tekrarlayın. İndüksiyon ve tripsinizasyondan sonra, yaklaşık 500 mikrolitrelik her bir kuyucuğun tüm içeriğini etiketli tüplere aktarın. Hücreleri 400 kez beş dakika boyunca santrifüj yapın G.Supernatant'ı attıktan sonra, numuneleri kimyasal bir duman başlığına taşıyın.
PBS'de seyreltilmiş 750 ila 1.000 mikrolitre PFA'daki hücreleri yeniden askıya alın ve hücre kümelerini kırmak için pipet birkaç kez yukarı ve aşağı doğru pipet yapın. 15 dakikalık inkübasyondan sonra, 750 ila 1.000 mikrolitre PBS ekleyin ve tekrar birkaç kez yukarı ve aşağı pipet ekleyin, ardından hücreleri oda sıcaklığında 400 kez G'de beş dakika boyunca pelet edin. Süper natantı attıktan sonra, numuneleri kimyasal bir duman başlığına taşıyın ve hücreleri gösterildiği gibi 750 ila 1.000 mikrolitre buz gibi soğuk metanol içinde yeniden askıya alın ve hücrelerin eksi 20 santigrat derece dondurucuda 30 dakika oturmasına izin verin.
Kuluçkadan sonra, birkaç kez yukarı ve aşağı pipetle çekerken 750 ila 1.000 mikrolitre PBS ekleyin. Daha sonra hücreleri 400 kat G'de beş dakika santrifüj ettikten sonra, süpernatantı atın ve numuneleri kimyasal bir duman başlığına taşıyın. Hücreleri 100 mikrolitrede veya etiketli birincil antikor ve pipetin altı ila sekiz kez yukarı ve aşağı doğru başka bir uygun seyreltmesinde yeniden askıya alın, ardından oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.
Daha sonra, 750 ila 1.000 mikrolitre inkübasyon tamponu ve pipet çözeltisini birkaç kez yukarı ve aşağı ekleyin, ardından hücreleri 400 kez G.Next'te beş dakika boyunca santrifüj edin, hücreleri 500 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın ve birkaç kez yukarı ve aşağı pipet yaparak kümeleri kırın. Her tüpün tüm içeriğini hücre süzgeçleri olan etiketli tüplere aktarın. Hücreleri doğru dalga boylarında lazerlerle uygun akış sitometri cihazlarına getirin.
Cihazlar için optik kalibrasyon yapıldı. Elde edilen görüntü kullanılarak, LED için telafi değerleri hesaplandı, arka plan sinyali çıkarıldı ve piksel yoğunluğu çıkarıldı. Varyasyon katsayısı 96 kuyu arasında minimum düzeydeydi.
Kalibrasyon yazılımı, konuma göre LED varyasyonunu gösterdi ve her LED'in aynı yoğunluğa normalleştirilmesi için gri bir ölçek ayarı oluşturdu. Gen ekspresyonu, LPA üzerindeki farklı ışık darbe sürelerinde floresan mikroskobu yoluyla mühendislik ürünü daha hafif hücrelerde indüklendi ve hücreler Brightfield ve GFP ekspresyonu için görüntülendi. Akış sitometrisi kullanılarak, hücreler farklı nabız uzunluğu değerlerinde indüklendi ve indüklenmemiş durumlardan dört kattan fazla değişimin popülasyon seviyesinde ölçülen gen ekspresyonunun bir doz yanıtını gösterdi.
Negatif geri bildirim, daha hafif sistem için çeşitli ışık yoğunluğu değerlerini canlı veya açık olarak karşılaştırarak gösterildiği gibi beş kat gen ekspresyonu gürültü azaltma elde etti. qPCR analizi, mühendislik ürünü daha hafif hücrelerin, RNA seviyelerini, indüklenmemiş durumlardan on kattan fazla indüksiyonla doza duyarlı bir şekilde ifade ettiğini ve akış sitometrisi nicelleştirmesiyle eşleştiğini göstermiştir. Tasarlanmış daha hafif gen devresi, KRAS protein seviyelerinin ve fosforile ERK seviyelerinin artmasına neden olan artan miktarda mavi ışık gösterdi.
Büyüme, hücre hareketliliği, yara iyileşmesi, proliferasyon veya invazyon testleri dahil olmak üzere çeşitli fonksiyonel testler yapılabilir. Bu yöntemler, kanser biyolojisi, doku farklılaşması veya ilaç direnci mekanizmaları hakkında spesifik bilgiler sağlayabilir.
