The authors would like to thank Christina Ball&#225;zs, Hug Aubin and J&#246;rn H&#252;lsmann for the critical reading of the manuscript and excellent editorial assistance. Moreover, the authors thank Gisela Mueller for the technical assistance. The authors thank Particle Metrix GmbH for providing the funds covering the publication costs.

NOT: Bu çalışmada sunulan deneyler Düsseldorf Üniversitesi&#39;nin kurumsal etik kurulu tarafından onaylanmıştır. 1. Exosome Hazırlık <ol><li> (9 ml toplam) venipunktür yoluyla 3 sitrat tüpleri içerisine tam kan toplamak. Bir 15 ml Falcon tüpü içine kan dökün. </li><li> Plazmadan hücrelerinin ayrılmasını başlatmak için 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 1500 x g&#39;de santrifüjleyin. Yeni 15 ml şahin tüp süpernatant aktarın. </li><li> Plazmadan (; CFP hücre içermeyen plazma) tüm hücreleri çıkarmak için 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 2,800 x g&#39;de santrifüjleyin. Ultrasantrifügasyon tüpler, tüp başına 1 ml CFP aktarın. </li><li> 4 ° C&#39;de 90 dakika boyunca 100,000 x g&#39;de santrifüje eksozomlar tüketmek için. Üstte kalan sıvı kısmın 900 ul çıkarın. Ultrasantrifügasyon tüp içinde kalan 100 ul pelet yeniden askıya. 900 ul PBS ekleyin. </li><li> Tekrar santrifüj 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 100,000 x g&#39;de. Su 900 ul kaldırpernatant. Kalan 100 ul pelet yeniden askıya. </li><li> Aktarım damıtılmış su, 40 ml yeniden süspansiyon 5-20 ul. Daha büyük parçacıklar eksozomlar ayrılması için bir 450 nm filtre ile süspansiyon filtre. Parçacık ölçümü için bu son süspansiyon kullanın. </li></ol> Parçacık Takip Aracı 2. Başlangıç ​​Prosedürü <ol><li> Yazılım simgesine çift tıklayarak programı başlatın. Çeşitli yazılım sekmeleri tıklayın (&quot;Hücre Kontrolü&quot;, &quot;Ölçme&quot;, &quot;Analiz&quot;) protokol boyunca aralarında geçiş yapabilirsiniz. </li><li> Başlangıç ​​prosedürünün otomatik uygulanması için ekrandaki yönergeleri izleyin. Hücre kalite kontrol ve otomatik hizalama hem kutularını seçin. NOT: Bu adımların Ya &quot;hücre kontrolü&quot; sekmesine düğmesini (A) veya (B) tuşuna basarak ayrı gerekirse tekrar edilebilir. </li><li> NTA enstrüman giriş ve çıkış noktasını açın ve 10 m enjekteL giriş deliğinden hücre kanalının içine şırınga ile damıtılmış su. Su son miktarı enjekte ediliyor olarak çıkış deliği kapatın. Atık çözümü toplamak için çıkış portu altında bir behere koyun. Ölçüm hücresi hava kabarcıkları serbest olduğundan emin olun ve sisteme hava kabarcıkları şırınga yok. Hemen giriş deliğini kapatın. </li><li> &quot;Tamam&quot; butonuna tıklayarak hücre kalite kontrolünü gerçekleştirin. Yazılım birkaç saniye sonra hücre kaliteli sonuçlar gösterecektir. </li><li> Herhangi parçacıklar hala yazılım canlı görünümü ekranda görsel veya kalite kontrol sonucu sadece iyi ya da kötü olması durumunda, kalan parçacıklar kadar adımı tekrarlayın 2.3 ölçüm hücresinden çıkarılırsa. Ayrıca partiküllerin birikmesini önlemek için her ölçüm aşamasından sonra 2.3 tekrarlayın. Distile su enjeksiyon yinelenen ve hücre kontrolü &quot;iyi&quot; sonuç vermezse, 2.9 geçin. </li><li> Üniforma 200 nm büyüklüğünde pol içeren bir kontrol süspansiyon hazırlayın; polisitren parçacıklar lazer ve mikroskop odakları hizalamak için kullanılacak. 600 ± 100 parçacıkları canlı görünümünde bir ekranda görüntülenir, öyle ki gerekli konsantrasyon elde etmek üzere damıtılmış su 500 ml, cihaz üreticisi tarafından sağlanan süspansiyon konsantresi bir damla ekleyin. </li><li> Adım 2.3 açıklandığı gibi NTA aracı haline hizalama süspansiyon enjekte edilir. &quot;OK&quot; tuşuna oto uyum, sistem otomatik olarak iki odaklarının optimum pozisyonunu bulacaksınız hangi aracılığıyla otomatik rutin başlatmak için. </li><li> Bir istemi sistemi belirten göründüğünde ölçümü başlatmak için OK üzerine tıklayın, şimdi deneyler için hazır. </li><li> Zaman zaman, bir etanol% 30 çözeltisi ile hücre yıkama ile deneyler arasında el hücre kanalı temizleyin. Yazılım otomatik hata raporu görüntüler her kanalı temizleyin. </li></ol> Örnek 3. Ölçümü <ol><li> Ea önce distile su ile kanal yıkayın(adım 2.3 de tarif edildiği gibi) kanal numune ölçümü. </li><li> Aşama 2.3 de tarif edildiği gibi, kanal içinde (bölüm 1 &#39;de hazırlandı) eksozom süspansiyon enjekte edilir. </li><li> Gerektiğinde yazılım şu ana parametreleri ayarlayın: <ol><li> Duyarlılık. Optimum hassasiyet aralığını bulmak için, farklı hassasiyet seviyeleri için ekran başına ölçülen parçacıklar için bir eğri görüntülemek için düğmeye &quot;Duyarlılık vs Parçacıkların sayısı&quot; üzerine tıklayın. Eğrisinin maksimum eğimi önce hassasiyet seviyesini seçti. Daha yüksek hassasiyet seviyesi daha küçük parçacıkların görselleştirme sağlar, aynı zamanda arka plan gürültü ile ilgili sorunlar artar. </li><li> Asgari Parlaklık. Exosome ölçümü bir filtre olarak bu işlevi kullanmak için 20 bir başlangıç ​​parlaklığını seçti. Dışarı boş güçlü ışık saçılım parçacıklar kadar bu parametreyi düzenler. Eserler saçılma zayıf yükseltmek için aşağı düzenler. Deney boyunca gerektiği gibi parlaklığını Vary. NOT: ışık ParçacıklarÇok güçlü bir örtüşme dağılım ve yanlışlıkla analize dahil edilebilir. </li><li> Min ve Max boyutu. Minimum ve maksimum boyutu düzenleyerek boy parçacıklar piksel gürültü ve istenmeyen dağılım ortadan kaldırmak için bir dijital filtre ayarlayın. Eksozom ölçümü için 10-500 piksel aralığı kullanın. </li><li> Shutter. Kamera 1/300 sn açık süreyi ayarlayın. </li></ol></li><li> Okunan parametreleri Canlı: <ol><li> &quot;Canlı görüntü&quot; butonuna tıklayarak herhangi bir noktada bir dijital ve analog görünümü modus arasında geçiş. </li><li> Deney boyunca bir renk kodlu göstergesi olarak örnek doyma durumunu gösterir saçılma yoğunluğu bar, monitör. Saçılma çubuğu kırmızı ise eksozomlar analiz etmeyin. Böyle bir durumda, daha fazla bu olguyu önlemek için örnek seyreltin. Deneysel durum numune süspansiyonu bir manipülasyon yasaklar varsa, duyarlılık aşağı-regüle veya yazılım-s parlaklığını düzenleyenyarlar ölçüm sonuçlarını iyileştirmek için. NOT: parçacıkların son derece yüksek konsantrasyon ile örnekler incelendiğinde dağılım, bireysel parçacıkları sigorta ve onlar tek parçacık olarak sayılır. </li><li> Ekrandan görme alanında sayılır parçacıkların sayısı not edin. </li></ol></li><li> &quot;Ölçme&quot; sekmesine tıklayın. </li><li> &quot;Run seçenekler&quot; dizisindeki ayarları seçin. <ol><li> Her satın alma öncesinde, bir tekrarlanan çek parçacık sürüklenme testi için &quot;onay hareketi &#39;seçin. Bütün analiz başlamadan önce en az bir kez testi yapın. Sürüklenme daha yüksek 20 mm / sn ise, numune akan durdurur, böylece ölçüm devam etmeden önce bekleyin. </li><li> Deney sayısını (5) ve aralarındaki zaman gecikmesini (0) seçin. </li><li> Bir &quot;örnek çek &#39;Gerekirse gerçekleştirin. Bu test başlangıç ​​prosedürü otomatik hizalama parçasıdır ve gerektiği gibi sonradan tekrar edilebilir. </li&gt; </ol></li><li> Sonunda &quot;run Video kazanım&quot; butonuna tıklayın. Yeni pencerede, döngü sayısını (15) ve ölçüm pozisyonların sayısı (11) tanımlar. NOT: Lazer kafası ve mikroskop 11 farklı pozisyonlarda parçacık numarasını analiz taşınmış olabilir. Deneysel talebe bağlı olarak, deney tek pozisyona veya farklı pozisyonlarda yapılmalıdır karar. <ol><li> Bir parçacık video çözünürlüğü (düşük) ayarlayarak bir bireysel parçacık olarak sayılacak takip edilecek olan minimum süreyi onaylayın. Kısa izleme süresi düşük bir çözünürlükte sonuçları. </li><li> Bir dosya adı seçin ve Ölçümü başlatmak için &quot;Tamam&quot; tıklayın. </li></ol></li></ol> Sonuçların Yorumlanması 4. <ol><li> &quot;Sonuçlar&quot; sekmesinde ölçümden sonra görüntülenen aşağıdaki sonuçları ve parametreleri görüntüle: takip parçacıkların (1) toplam sayısı, parçanın (2) ortalama sayısıpozisyonda, ve (3) parçacık konsantrasyon başına icles. <ol><li> Parçacık numaralarının yüzdesine partikül boyutu (çapı, yüzey ve hacim) sayısal oranı sonucu ortalama tablosunu görüntüleme yanı sıra ortalama ve standart farklılaşma değerleri. </li><li> Birden fazla pik grafik analizinde varsa zirve analizi tablosunu kullanın. Bu tablo, birinci veya ikinci tepe daha küçük olan parçacıkların dağılımını göstermektedir. </li></ol></li><li> Büyüklüklerine göre parçacıkların bir dağılımını görmek için ölçümden sonra hesaplanan grafiği görüntüleyin. Ayarlarını değiştirmek için ekran modunda ve grafiğin üstünde simgeleri kullanınız. </li></ol>

<ol>
	<li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., Bonifacino, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.+Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.+.">Chapter 3. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. .</a> Current protocols in cell biology / editorial board. (3.22), (2006).</li><li>Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+isolation+for+proteomic+analyses+and+RNA+profiling.">Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling.</a> Methods in molecular biology. 728, 235-246 (2011).</li><li>Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+RNA-containing+exosomes.">Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.</a> J. Vis. Exp. , e3037 (2012).</li><li>Konokhova, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-scattering+flow+cytometry+for+identification+and+characterization+of+blood+microparticles.">Light-scattering flow cytometry for identification and characterization of blood microparticles.</a> Journal of biomedical. 17, 057006 (2012).</li><li>Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+current+knowledge+of+their+composition,+biological+functions,+and+diagnostic+and+therapeutic+potentials.">Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials.</a> Biochimica et biophysica acta. 1820, 940-948 (2012).</li><li>Sokolova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+exosomes+derived+from+human+cells+by+nanoparticle+tracking+analysis+and+scanning+electron+microscopy.">Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy.</a> Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 87, 146-150 (2011).</li><li>Clayton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+antigen+presenting+cell+derived+exosomes,+based+on+immuno-magnetic+isolation+and+flow+cytometry.">Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry.</a> Journal of immunological. 247, 163-174 (2001).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> Amer. J. Phys. Renal Phys. 292, F1657-1661 (2007).</li><li>Carr, B., Warren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Company+profile:+NanoSight:+delivering+practical+solutions+for+biological+nanotechnology.">Company profile: NanoSight: delivering practical solutions for biological nanotechnology.</a> Nanomedicine. 7, 1129-1132 (2012).</li><li>Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal-like+vesicles+are+present+in+human+blood+plasma.">Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma.</a> International immunology. 17, 879-887 (2005).</li></ol>

This work was supported by the institutional funds of the Dept. of Cardiovascular Surgery, Medical Faculty, HHU. The publication costs of this study were provided by Particle MetrixGmbH.

Bir biyolojik sıvıda eksozom boyutu ve yoğunluğunu ölçmek için bir yeni ve yenilikçi bir yöntem olarak kan ve bu nanoparçacık takip eksozom izolasyonu için detaylı bir protokol göstermektedir. Gösterilen deneylerde, insan periferik kan eksozom kaynağı olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu gibi idrar, balgam, hücre kültürü üstte kalan sıvı, diğer kaynakları, ayrıca test materyali olarak kullanılabilir. İnsanlarda eksozom konsantrasyonunun biyolojik değişkenlik göre farklı bireylerden deneyler, eksozom derece değişen konsantrasyon özelliği olabilir. Ancak, biyolojik test denemesinde parçacıkların konsantrasyonu sonuçları üzerinde bir etkiye sahip olabilir. Bu nedenle, prob seyreltme için güvenilir ve standart bir yaklaşım gereklidir. Sunulan yöntem eksozom ihtiva eden plazma periferik tam kan, 9 ml elde edilmiştir. Diferansiyel santrifüj kullanılarak bir eksozom pelet izole edilmiştir adım1 ml plazma ve süspansiyona eksozom çalışma örneği meydana getirmek üzere damıtık su 5 ml yeniden süspansiyon haline. Bu ön-tanımlı ayar parçacıkların uygun bir konsantrasyon, NTA sırasında, yani uygun dağılım yoğunluğu ile bize sağladı. Hacmi ve seyreltme açıdan yanında, kullanılan çözeltilerin bir bileşim de büyük önem taşımaktadır. Biz eksozom son yeniden süspansiyon için distile su kullandık. Tabii ki, nihai seyreltme adımı için farklı medya da deney düzeneği gereklerine göre kullanılabilir. Ancak, tamponlama kapasitesi ile test, özellikle iyonik çözeltiler zeta potansiyel ölçümleri durumunda, türbülans bağımsız koşullarda ihtiyatlı bir seyreltme yararlıdır. Birden örneklerin doğrudan karşılaştırma için biz tüm örnekler için aynı seyreltme seviyesini tutmanızı öneririz. Hassasiyet ve video çözünürlüğü hariç tüm ayarlar ZetaView Analizi yazılımı kullanılarak sonradan değiştirilebilir. <p class=Yazarlar burada tanıttı sistem şu anda en uygun enstrüman temsil inanıyorum rağmen &quot;jove_content&quot;&gt;, sadece mevcut NTA sistem değildir. Daha önceki raporlarda bir dizi aynı NTA ilkelerini uygulamak, ancak bazı farklı özelliklere 10 ile birlikte gider başka enstrüman tasarımı sağlayan diğer sistemleri istihdam var. Biz sonuçların örnek işleme ve tekrarlanabilirlik ile ilgili pratik yönleri eksozom değerlendirme için metodolojik dizisi seçiminde merkezi öneme sahip olduğuna inanıyoruz. Biz de ideal bir algılama sistemi ölçümleri sonuçları ile etkileşime girebilir kullanıcı bağlı faktörleri ortadan kaldırmak gerektiğine inanıyoruz. Burada sunulan eksozom analiz yaklaşımı yüksek derecede kolay kullanım kriterlerini yerine getirmektedir. İlave bir avantaj olarak, numune, yarı-otomatik bir analiz, kısa sürede sonuç üreten, hızlı bir şekilde gerçekleşmektedir. Eksozom bir çevrimiçi görselleştirme ga için analizörü yardımcılarıeksozom özellikleri, örneğin, brüt konsantrasyon bir anlık fikir. Burada sunulan ölçüm tekniği çok basit ama şık bir ek antikor etiketli eksozomlann kullanımı ve dedektör önünde bir önceki filtre kullanarak dağınık lazer ışınının yakalama. Bu şekilde, eksozom alt-popülasyonları bulunduğunu seçici floresan boyama teknik erişilebilir yüzey antijenleri ve diğer biyolojik olarak ilgili özelliklerine göre ayırt edilebilir. Bizim parçacık izleme aracının güncel sürümü bir dezavantajı çok yüksek hassasiyet seviyelerinde arka plan gürültüsü gibi eserler hücre kanalı duvarına dayanan, mevcut olabilir olmasıdır. Mevcut sisteme bir teknik çözüm ve iyileştirme yakın gelecekte kullanılabilir hale gelebilir. Kanal duvarına lazer dağılım ışık bu yöntem yansımaları ile bu şekilde artan azalacaktır<html> Ölçülen sinyaller ve elde edilen verilerin ve algılama sınırı düşürücü doğruluğu. Exosome izolasyonu için şu anda kullanılan protokol köklü ve uygulamalı parçacık izleme aracı, 30 nm düşük boyut dağılımı ile son derece hassas çözünürlüğe sahip olmasına rağmen, tespit edilen parçacıklar aslında tamamen doğru eksozomlar olduğuna dair hiçbir garanti yoktur. Bu gibi ölü hücre fragmanları ya da daha büyük bir protein kompleksleri gibi diğer parçacıklar da eksozom süspansiyon içinde mevcut olabilir ve yanlış pozitif sinyallere neden olabilir. Örneğin &quot;kirlilik&quot; elektron mikroskobu (EM), iletim EM ya da tarama EM da olabilir dışı bırakılabilir hangi biri güvenilir bir yöntem. Daha önce önerilen yüzey markerlerinin bir dizi tetraspanin (Tspan), CD81, C63, CD9, vb 11 de dahil olmak üzere dikkat artan bir miktarını, kazanmıştır, ancak ne yazık ki, eksozom için genel ve spesifik bir işaretleyici, şimdiye kadar tanımlanmış edilmiştir. &quot;&gt; Bağımsız olarak eksozom biyoloji, özellikle de eksozom özel işaretleyiciler ile ilgili araştırma, gelecekteki ilerleme, burada sunulan protokol izolasyonu ve eksozom tespiti için güçlü bir yöntem sağlar. Konsantrasyon ve büyüklüğü de kolayca bir yazılım destekli tespit edilebilir basit moda. selektif floresan belirteçler ya da fluoroforun birleştiğinde antikorların eklenmesi muhtemel daha NTA sunulmuştur yaklaşımın olası uygulamalarını geliştirmek olacaktır.

dolaşımdaki eksozom tam işlevi uzun bir süre için bilinmemektedir. Şimdi bile eksozom tam yolu mekanizması tam olarak anlaşılmış değildir. Eksozomlar taşımak beri antijenler, proteinler ve menşe ebeveyn hücrenin, hücre-hücre sinyal vericiler olarak işlev onları ilgilidir RNA (mRNA ve miRNA) esas öncelik verilmiştir. Pek çok farklı yöntem izolasyonu ve eksozom 1,2 nicel tespiti için literatürde tarif edilmiştir. Ancak, &#39;altın standart&#39; üzerinde görüş birliği ulaşıldı. Bu arada exosome araştırma alanında aktif bilim adamlarının çoğunluğu izolasyonu tutarlı bir yöntem oldukça farklı raporlar ve çalışmalar arasında karşılaştırılabilirlik daha yüksek bir derece elde etmek garanti olduğunu kabul ediyorsunuz. Floresan aktive hücre sıralama (FACS) eksozom analizi 3 için en yaygın ve yaygın bir araçtır. FACS Ben&#39;i varflüoresan işaretleme ile, farklı kökenlerden gelen hücreler bir aşamada karşılaştırılabilir Efit. FACS önemli dezavantajlar daha az bunların boyutunu ölçmek için, eksozomlar çapı 5 30-120 nm arasında değişir ise, bu yöntem, parçacıkların daha küçük 0,5 ila 4 um, tespit için yeterince duyarlı değildir bulunmaktadır. Taramalı elektron mikroskopisi (SEM) ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) partikül boyutu ve eksozom morfoloji analizi için başka araçlar. Ancak, SEM ve TEM hem de numunelerin hazırlanması zaman alıcı, her iki yöntem emek-yoğun adımları dahil olduğunu dezavantajı var ve her buluntu nesil bazı riskler vardır. Her iki yöntem, yüksek numune ve bir numunenin bir parçacık binlerce karakterizasyonu için uygundur. Ayrıca, örnekler çoğu zaman bilgisi, klinik günlük rutin için bir nicel analiz çok kısa bir süre içinde eş zamanlı olarak ya da en azından analiz edilecekgerçekleştirmek zor. Yeni nesil teknikleri artık bize öncesinde yoğun hazırlık çalışmaları (örn, çevresel SEM) olmadan eksozomlar analiz sağlar. Bu modern teknikler hala ortalama sayısı ve boyut dağılımını 6 belirlemek için eksozomlar içeren büyük hacimli süspansiyonları analiz için oldukça sakıncalı. Görselleştirme ve eksozom analizi için diğer bir yüksek ölçüde hassas bir yöntem nanopartikül izleme analizi (NTA) &#39;dir. Bu yöntem, fizik iki prensip yararlanır. İlk olarak, parçacıklar, bir lazer ışını ile ışımaya zaman dağınık ışık ile tespit edilir. İkinci bir fenomen olduğu için uygun bir sıvı süspansiyon içinde farklı parçacıkların difüzyon büyüklükleriyle ters orantılıdır, Brown hareketi olarak da bilinir. Bu durumda hareket, aynı zamanda, sıcaklık ve sıvının viskozitesine bağlıdır. Bununla birlikte, bu oran, doğrudan parçacık büyüklüğü ile ilgilidir ve NTA kullanılır. Yumuşak kullanmaware-tabanlı analiz, tek parçacıklardan saçılan ışığın dijital görüntüler kaydedilir. Dağınık ışık noktalar Arsalar ve hareket onların hızı, toplam partikül sayısı ve büyüklüğü dağılımının belirlenmesini kolaylaştırmak verileri sağlamak. Bu teknik en az 100 nm bir ortalama çapa sahip parçacıkların analiz edilmesi için güçlü bir araçtır. boyutu ve konsantrasyon ölçümleri ZetaView Brown ve Elektroforez Hareket Video Analizi Mikroskop ile yapılmaktadır. Bu (bundan sonra partikül izleme aracı olarak anılacaktır), sıvı örnekleri için yarı-otomatik masa üstü nanoparçacık analiz cihazıdır. Bu parçacık izleme analizörü yanı sıra veri analizi için kullanılan yazılım ile bir dizüstü bilgisayar oluşur. Heterojen biyolojik örnekler, inorganik parçacıkların en çok homojen süspansiyonlar gibi bu yöntem için de uygundur. Bir video kamera ile bir lazer kırılmalı mikroskop parçacıkların tespiti için ve Obse için kullanılanonların hareket rvation. Mikroskop ekseni yatay ve eksozomlar ihtiva eden bir süspansiyon ile doldurulabilir hücre kanalının içine odaklanmış olsa da, lazer ışını dikey yönlendirilmiştir. mikroskop (Şekil 1) üzerinden bir dijital video kamera ile 90 ° altında kaydedilir lazer ışığı yayılımı ile ışınlanmış parçacıklar. saçılan ışığın yoğunluğu, daha büyük partiküller 60 nm çapında gözlenmesini sağlar. Böyle bir ortamda, bir parçacığın parlaklık parçacık büyüklüğü tek göstergesi değildir. Herhangi bir elektrik alanı uygulandığında, parçacık hareketinin Brownian hareketi takip eder ve parçacık boyutuna hesaplamak için bir gösterge olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, cihaz, aynı zamanda, hücre kanalı boyunca bir elektrik alanı uygulamak yeteneğine sahiptir. Bu alana maruz kaldığında, potansiyel, polarizasyon ve süspansiyon eksozom iyonik yük seviyesi, kendi hareket yönünde, daha belirleyici olmaktadır. Bir elektroforetik mo Hız ve yön sonucubility histogramı. Izole eksozomlar analiz için en uygun yöntem bulma bir sorun olsa da, başka bir tür kan, asit, idrar, süt, amniyotik sıvı veya hücre medya gibi farklı medya, gelen eksozom etkili izolasyon yatıyor. Farklı yöntemler Ultrasantrifügasyon 1 dayandığı, şimdiye kadar tarif edilmiştir (örneğin Exoquick gibi) endüstriyel ayırma reaktifleri 7, 8 veya ayrılık ultrafiltrasyon istihdam antijen için manyetik boncuk 9 adımları. Bu protokolde Ultrasantrifügasyon yoluyla eksozom izolasyon tüm süreci göstermek ve partikül izleme aracı vasıtasıyla süspansiyon içeren ortaya çıkan exosome analiz nasıl gösterir. Insan plazması ya da hücre kültür ortamı türetilmiş eksozom analizi için özel hususlar sağlanır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="645">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">Name of the Reagent</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Citrate tube</td>
			<td>BD</td>
			<td>364305</td>
			<td>BD Vacutainer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Distilled water</td>
			<td>Braun</td>
			<td>3880087</td>
			<td>Aqua ad iniectabilia</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon tube</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>188271</td>
			<td>PP Tube, Steril 15ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultracentrifugation tube</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>357448</td>
			<td>Microfuge Tube Polyallomer 1,5ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybead</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>07304</td>
			<td>2,6% Solids-Latex 
			Alignment Solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (Filter)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4617053V</td>
			<td>5ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (ZetaView)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606051V</td>
			<td>5ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305180</td>
			<td>BD Blunt Fill Needle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter</td>
			<td>Sartorius Stedim</td>
			<td>16555</td>
			<td>Syringe filter, hydrophilic, 450&#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Material Name&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>L8-M</td>
			<td>Rotor: 70Ti Ser. No E21078</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ZetaView</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>PMX 100, Type 101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td>Rotor: A-4-44</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an innovative method for exosome quantification and size measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

Bu gösteri için kullanılan örnek% 85 duyarlılık, hassasiyet eğrisinin maksimum eğimi önce (Şekil 2) ile ölçümü için optimum ayarı gösterir. protokol önerildiği gibi parlaklık, min / max değerleri seçildi. 5.3 parçacıkların bir konsantrasyon / ml x parçacıklarının ortalama boyutu, çoğu 0.137 um idi, 0.149 mikron idi ise 10 6, ölçülmüştür. Ölçme işleminden sonra alınan değerler .pdf bir dosya biçimi veya bir veritabanına ihracat için bir .txt olarak raporda kaydedilebilir. tercih edildiği protokolü (bölüm 4) &#39;de tarif edildiği gibi grafik ayarlanabilir. video dizisi de kaydedilir ve daha sonra hat-dışı yeniden analiz için kullanılabilir. Bununla birlikte, bu tür bir off-line analiz, kameranın ön alıcı ayarları geriye dönük olarak değiştirilemez. Bir ölçüm için en uygun parametre ayarlarını bulmak için, biz burada th açıklamak100 nm polistiren boyutu standart örnek gösterge ayarları e optimizasyonu. iki parametre, video görüntüsü ve parçacık büyüklüğü dağılımına duyarlılık ve / üst büyüklüğünün etkisinin altında ayrıntılı olarak ele alınmıştır. Diğer bütün parametreler Tablo 1 &#39;de özetlenmiştir. Analog ve dijital görüntüler üzerinde (50-94 arasında) duyarlılık etkisinin bir görsel izlenim Şekil 3&#39;te görüntülenmiştir. Görüntülerden elde edilen nicel bilgiler Tablo 1&#39;de ayarlara dayalı, Şekil 4&#39;te sunulmuştur Min Boyutu = 5 ve en büyük boyutu = 200 hassasiyet genel tespit parçacıkların sayısı tipik bir ilişki Şekil 4A&#39;da gösterilmiştir. 50 ve 90 yılları arasında, tespit edilen parçacıkların sayısı duyarlılığı artmış ve 90&gt; hassasiyetleri dramatik olarak artmıştır. Duyarlılık optimum aralığı 66 ve 86 (A) arasında bulunmuştur. Parçacık boyutu dağılımları dif ile elde edilenferent duyarlılığı ayarları Şekil 4B&#39;de gösterilmektedir. Parçacık boyutu dağılımları, üç ayrı ölçümün ortalamasını temsil etmektedir. Oldukça kötü istatistik sonuçlanan sadece birkaç parçacıklar analiz edildi çok düşük bir hassasiyet (duyarlılık = 62, kırmızı eğri) için. analiz parçacıkların sayısı duyarlılığı artmış ve 70 (sarı eğri) ve 86 (tan eğri) arasındaki bir optimum ulaştı. Daha küçük boyutlarda (duyarlılık = 94, mavi eğri) doğru kayması bırakarak parçacıklar ve boyut dağılımının sayısı ile parçacık boyutu dağılımı bir bozulmaya duyarlılık öne artar. Şekil 4C sayısı göre x50 çapının eğilimi (% 50 göstermektedir parçacıklar duyarlılık bir fonksiyonu olarak) bu çapından daha küçüktür. Kırmızı bölge kötü istatistiği (hassasiyet çok düşük) ya da geniş bir dağılım göstermesi sonucunda&gt;% 8 MSB göstermektedir bej aralığı içinde, partikül büyüklüğü MSB% 8&#39;den az ve A&#39;da uygun aralığına tekabülDaha küçük boyutlarda (hassasiyet çok yüksek) kayma ile rı payı. Min Boyutu ve Max Boyutu ayarları Min Boyutu daha küçük ve Max Boyutu daha büyük nokta boyutları ile parçacıkları kaldırmak için dijital görüntülere uygulanan filtreler vardır. Işığı dağıtır yeteneği nedeniyle, bir tanecik, bir dijital görüntü ile ilgili belirli bir büyüklükte bir nokta oluşturur. nokta boyutu piksel sayısı (piksel) olarak ölçülür. Bir parçacık çok iyi (örn, parçacıklar&gt; 200 nm veya agrega) ışık saçar zaman, nokta boyutu, örneğin,&gt; 500 px, oldukça büyüktür. spot büyüklüğü parçacık malzemeye bağlı olarak küçük parçacıklar (örneğin, &lt;20 nm) için (örneğin, &lt;10 px) oldukça küçük. Aynı değillerdir ve bu iki değişken arasında doğrudan bir ilişki olduğu gibi spot büyüklüğü (px) partikül boyutu (nm) ile değiştirilebilir olmayabilir. Min ve Max Boyutu bir optimizasyon kullanıcı gibi aglomeralar (Maks Boyu) ya da küçük olarak istenmeyen nesneleri filtrelemek için izin verirarka plan gürültüsü (Min Boyutu) olarak nesneler. 100 nm boyutlu standart parçacık boyutu dağılımına Min / Maks Boyutu etkisi Şekil 4D (duyarlılık = 82) &#39;de gösterilmiştir. Aralık küçük nokta boyutları ayarlandığında (örneğin, min = 1, max = 52; turuncu eğrisi), analiz parçacıkların sayısı azalır ve sayı tabanlı x50 çapı biraz daha küçük boyutlarda doğru kaydırılır. Büyük noktalar için bir ayar (min = 40, max = 1,000; kırmızı eğri) geniş bir parçacık boyut dağılımının sonuçları büyük boyutlarda doğru kaymıştır. Parçacıkların eşit toplam sayıları elde etmek için, turuncu ve kırmızı hem dağılımlarının aralığı sınırları 80 parçacıkları maç ayarlandı. en uygun ayarlarla dağılımı (dk = 5, max = 200; ten rengi eğrisi) 360 parçacıklardan oluşur. Başarılı bir seri deney eksozom ultra-santrifüj ile izole edildi ve sunulan sistem kullanılarak NTA ile ölçülen ile yapıldı. Elde edilen veriler son derece vardıve tutarlı yeniden üretilebilirlik yüksek düzeyde doğruladı. Diğer izolasyon yöntemleri benzer sonuçlar göstermelidir. Fakat bu seyreltme adımı özellikle kritik bir aşama olarak tespit edilmiştir ve parçacıkların hesaplanan toplam sayısı üzerindeki etkisi yeniden değerlendirilmelidir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/50974/50974fig1.jpg" /> NTA kurulumu Şekil 1. şematik. mikroskop / görüntü ekseni ve lazer ışını hücre kanal kesiti kapısını birbirine dik yönlendirilir. Parçacıkların tarafından saçılan ışık yazılımı &quot;canlı görünüm&quot; penceresinde görüntülenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/50974/50974fig2.jpg" /> <stronduyarlılık eğrisi parçacıkların g&gt; Şekil 2. sayısı. duyarlılık eğrisi parçacıkların sayısı otomatik hassasiyet tarama sırasında bir anda bir pozisyonda parçacıkları görüntüler. Bu grafik görselleştirme ilk ölçümler için en iyi tercihlerini belirlemek için kullanılır. Bir hassasiyet değeri grafik yer alan maksimum eğim önce seçilir. Bu eserler bu test deney elimine edilmez ve grafik etkileyebilir unutmamak önemlidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/50974/50974fig3.jpg" /> Canlı görünümü ekranda parçacıkların analog ve dijital görüntü. Görselleştirme üzerine duyarlılığı Şekil 3. Etki hem analog (üst satır) An 50 ve 94 arasında hassasiyetleri için görüntülenird dijital (alt sıra) bakıldı. Hassasiyet çok düşük olduğunda, sadece bir kaç partiküller (sol) tespit edilir. Optimum hassasiyet at parçacıklar birbirlerini iyi (orta) izole olarak tek noktalar görünür. Nispeten yüksek hassasiyet parçacıkları bir arada kötü görüntü kalitesi (sağda) yol açan birleştirme at. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/50974/50974fig4.jpg" /> Bir kontrol 100 nm polistiren partikül örnek için duyarlılık minimum ve maksimum boyutu ayarları Şekil 4. Etkisi (A) parçacıkların tespit sayıda karşı duyarlılık Arsa.; optimum aralığı, 66-86 eğrisinin azami eğimiyle önce gelir. (B) Partikül büyüklüğü dağılımları birkaç hassasiyet ayarları (62-94 elde); (62), çok düşük ya da çok yüksek için grafikler (94) karşı, 100 nm polistiren kontrol örneği için parçacık boyutu dağılımı toplanmamaktadır. (C) duyarlılık karşı Sayısı tabanlı x50 çapı; bej aralığında x50 hata% 8&#39;den az, uygun aralık 66&#39;dan parçacık boyutu dağılımına Min ve Maks Boyutu 86. (D) etkisi için olduğu; Optimal parametreler (min = 5 ve max = 200), kontrol numunesi için doğru dağıtım yakalamak. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Ön-satın alma parametreleri </td></tr><tr><td> Duyarlılık </td><td> değişken </td></tr><tr><td> Panjur </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Kare hızı </td><td> 30 fps </td></tr><tr><td> Çözüm </td><td> Selamgh </td></tr><tr><td> Bisikletler </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Çoklu Devralmalar </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Pozisyon </td><td> 1 </td></tr><tr><td colspan="2"> Post-satın alma parametreleri </td></tr><tr><td> Min Parlaklık </td><td> 30 </td></tr><tr><td> Max Boyut </td><td> değişken </td></tr><tr><td> Min Boyutu </td><td> değişken </td></tr></tbody></table> Parçacık izleme aracının ayarı için öncesi ve sonrası satın alma parametreleri Tablo 1. Özeti.

Watch this Scientific Journal Video about An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement at JoVE.com

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Exosome Kantifikasyon ve Boyut Ölçüm Yenilikçi Yöntem

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

an-innovative-method-for-exosome-quantification-and-size-measurement

Research

JoVE Journal

Biology

30.6K Görüntüleme.  Heinrich-Heine-University Dusseldorf. A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Video: An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

Tek Parçacık Düzeyinde Viral Fusion Kinetik Ölçüm yöntemi

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Biyoloji

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), and delta-cells (somatostatin) that are embedded in the exocrine tissues and comprise 1-2% of the entire pancreas. There is a close correlation between body and pancreas weight. Total beta-cell mass also increases proportionately to compensate for the demand for insulin in the body. What escapes this proportionate expansion is the size distribution of islets. Large animals such as humans share similar islet size distributions with mice, suggesting that this micro-organ has a certain size limit to be functional. The inability of large animal pancreata to generate proportionately larger islets is compensated for by an increase in the number of islets and by an increase in the proportion of larger islets in their overall islet size distribution. Furthermore, islets exhibit a striking plasticity in cellular composition and architecture among different species and also within the same species under various pathophysiological conditions. In the present study, we describe novel approaches for the analysis of biological image data in order to facilitate the automation of analytic processes, which allow for the analysis of large and heterogeneous data collections in the study of such dynamic biological processes and complex structures. Such studies have been hampered due to technical difficulties of unbiased sampling and generating large-scale data sets to precisely capture the complexity of biological processes of islet biology. Here we show methods to collect unbiased "representative" data within the limited availability of samples (or to minimize the sample collection) and the standard experimental settings, and to precisely analyze the complex three-dimensional structure of the islet. Computer-assisted automation allows for the collection and analysis of large-scale data sets and also assures unbiased interpretation of the data. Furthermore, the precise quantification of islet size distribution and spatial coordinates (i.e. X, Y, Z-positions) not only leads to an accurate visualization of pancreatic islet structure and composition, but also allows us to identify patterns during development and adaptation to altering conditions through mathematical modeling. The methods developed in this study are applicable to studies of many other systems and organisms as well.

Novel computer-assisted methods of large-scale procurement and analysis of immunohistochemically stained pancreatic specimens are described: (1) Virtual Slice capture of the entire section; (2) Mass analysis of large-scale data; (3) Reconstruction of 2D Virtual Slices; (4) 3D islet mapping; and (5) Mathematical analysis.

Bilgisayar destekli Büyük ölçekli Görselleştirme ve Pankreas Adacık Kütle, Boyut Dağılımı ve Mimarlık Niceleme

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large macromolecular complexes. Compared to X-ray crystallography, it has some unique advantages. First, single particle EM reconstruction does not need to crystallize the protein sample, which is the bottleneck in X-ray crystallography, especially for large macromolecular complexes. Secondly, it does not need large amounts of protein samples. Compared with milligrams of proteins necessary for crystallization, single particle EM reconstruction only needs several micro-liters of protein solution at nano-molar concentrations, using the negative staining EM method. However, despite a few macromolecular assemblies with high symmetry, single particle EM is limited at relatively low resolution (lower than 1 nm resolution) for many specimens especially those without symmetry. This technique is also limited by the size of the molecules under study, i.e. 100 kDa for negatively stained specimens and 300 kDa for frozen-hydrated specimens in general.
For a new sample of unknown structure, we generally use a heavy metal solution to embed the molecules by negative staining. The specimen is then examined in a transmission electron microscope to take two-dimensional (2D) micrographs of the molecules. Ideally, the protein molecules have a homogeneous 3D structure but exhibit different orientations in the micrographs. These micrographs are digitized and processed in computers as "single particles". Using two-dimensional alignment and classification techniques, homogenous molecules in the same views are clustered into classes. Their averages enhance the signal of the molecule's 2D shapes. After we assign the particles with the proper relative orientation (Euler angles), we will be able to reconstruct the 2D particle images into a 3D virtual volume.
In single particle 3D reconstruction, an essential step is to correctly assign the proper orientation of each single particle. There are several methods to assign the view for each particle, including the angular reconstitution1 and random conical tilt (RCT) method2. In this protocol, we describe our practice in getting the 3D reconstruction of yeast exosome complex using negative staining EM and RCT. It should be noted that our protocol of electron microscopy and image processing follows the basic principle of RCT but is not the only way to perform the method. We first describe how to embed the protein sample into a layer of Uranyl-Formate with a thickness comparable to the protein size, using a holey carbon grid covered with a layer of continuous thin carbon film. Then the specimen is inserted into a transmission electron microscope to collect untilted (0-degree) and tilted (55-degree) pairs of micrographs that will be used later for processing and obtaining an initial 3D model of the yeast exosome. To this end, we perform RCT and then refine the initial 3D model by using the projection matching refinement method3.

This article describes a standard method to get a three-dimensional (3D) reconstruction of biological macromolecules using negative staining electron microscopy (EM). In this protocol, we explain how to get the 3D structure of the Saccharomyces cerevisiae exosome complex at medium resolution using the random conical tilt reconstruction method (RCT).

Rastgele Konik Tilt Yöntemiyle Exosome Kompleksi Tek Parçacık Elektron Mikroskobu İmar

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Tangential Flow Ultrafiltration: A  &ldquo;Green&rdquo; Method for the Size Selection and Concentration of Colloidal Silver Nanoparticles

Nowadays, AgNPs are extensively used in the manufacture of consumer products,1 water disinfectants,2 therapeutics,1, 3 and biomedical devices4 due to their powerful antimicrobial properties.3-6 These nanoparticle applications are strongly influenced by the AgNP size and aggregation state. Many challenges exist in the controlled fabrication7 and size-based isolation4,8 of unfunctionalized, homogenous AgNPs that are free from chemically aggressive capping/stabilizing agents or organic solvents.7-13 Limitations emerge from the toxicity of reagents, high costs or reduced efficiency of the AgNP synthesis or isolation methods (e.g., centrifugation, size-dependent solubility, size-exclusion chromatography, etc.).10,14-18 To overcome this, we recently showed that TFU permits greater control over the size, concentration and aggregation state of Creighton AgNPs (300 ml of 15.3 &mu;g ml-1 down to 10 ml of 198.7 &mu;g ml-1) than conventional methods of isolation such as ultracentrifugation.19
TFU is a recirculation method commonly used for the weight-based isolation of proteins, viruses and cells.20,21 Briefly, the liquid sample is passed through a series of hollow fiber membranes with pore size ranging from 1,000 kD to 10 kD. Smaller suspended or dissolved constituents in the sample will pass through the porous barrier together with the solvent (filtrate), while the larger constituents are retained (retentate). TFU may be considered a "green" method as it neither damages the sample nor requires additional solvent to eliminate toxic excess reagents and byproducts. Furthermore, TFU may be applied to a large variety of nanoparticles as both hydrophobic and hydrophilic filters are available.
The two main objectives of this study were: 1) to illustrate the experimental aspects of the TFU approach through an invited video experience and 2) to demonstrate the feasibility of the TFU method for larger volumes of colloidal nanoparticles and smaller volumes of retentate. First, unfuctionalized AgNPs (4 L, 15.2 &mu;g ml-1) were synthesized using the well-established Creighton method22,23 by the reduction of AgNO3 with NaBH4. AgNP polydispersity was then minimized via a 3-step TFU using a 50-nm filter (460 cm2) to remove AgNPs and AgNP-aggregates larger than 50 nm, followed by two 100-kD (200 cm2 and 20 cm2) filters to concentrate the AgNPs. Representative samples were characterized using transmission electron microscopy, UV-Vis absorption spectrophotometry, Raman spectroscopy, and inductively coupled plasma optical emission spectroscopy. The final retentate consisted of highly concentrated (4 ml, 8,539.9 &mu;g ml-1) yet lowly aggregated and homogeneous AgNPs of 1-20 nm in diameter. This corresponds to a silver concentration yield of about 62%.

Tangential Flow Ultrafiltration: A  &amp;ldquo;Green&amp;rdquo; Method for the Size Selection and Concentration of Colloidal Silver Nanoparticles

Tangential flow ultrafiltration (TFU) is a recirculation method used for the weight-based separation of biosamples. TFU was adapted to size-select (1-20 nm diameter) and highly concentrate a large volume of polydisperse silver nanoparticles (4 L of 15.2 &mu;g ml-1 down to 4 ml of 8,539.9 &mu;g ml-1) with minimal aggregation.

Teğet Akış Ultrafiltrasyon: Kolloidal Gümüş Nanopartiküllerin Boyutu Seçme ve Konsantrasyon için &quot;Yeşil&quot; Yöntemi

Nowadays, AgNPs are extensively used in the manufacture of consumer products,1 water disinfectants,2 therapeutics,1, 3 and biomedical devices4 due to ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

Uçuş Performans Doğru ve hızlı ölçüm için geliştirilmiş Yöntemi<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One of the primary risk factors of EAC is Barrett&#8217;s esophagus (BE), a metaplastic change of the normal squamous esophagus in response to chronic heartburn. Despite the well-established connection between EAC and BE, interrogation of the molecular events, particularly altered signaling pathways involving progression of BE to EAC, are poorly understood. Much of this is due to the lack of suitable in vitro models available to study these diseases. Recently, immortalized BE cell lines have become commercially available allowing for in vitro studies of BE. Here, we present a method for immunofluorescent staining of immortalized BE cell lines, allowing in vitro characterization of cell signaling and structure after exposure to therapeutic compounds. Application of these techniques will help develop insight into the mechanisms involved in BE to EAC progression and provide potential avenues for treatment and prevention of EAC.

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&amp;#8217;s Esophagus Cells

There is a discernible need for improved information on molecular drivers of Barrett&#8217;s Esophagus. Immunofluorescent staining is a useful technique for understanding the effects of cell signaling on cell morphology. We present a simple, effective protocol for the use of immunofluorescent staining to assess therapeutic treatment in Barrett&#8217;s Esophagus cells.

Barrett Özofagus Hücrelerinin Karakterizasyonu için bir Immunofluorescent Yöntemi

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

Bitki Polizom Profiling için bir Kolay Yöntem

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. Three-dimensional (3D) cell culture techniques are a recent innovation developed to address the shortcomings of adherent cell culture. While several techniques for generating tissue analogues in vitro have been developed, these methods are frequently complex, expensive to establish, require specialized equipment, and are generally limited by compatibility with only certain cell types. Here, we describe a rapid and flexible protocol for aggregating cells into multicellular 3D spheroids of consistent size that is compatible with growth of a variety of tumor and normal cell lines. We utilize varying concentrations of serum and methyl cellulose (MC) to promote anchorage-independent spheroid generation and prevent the formation of cell monolayers in a highly reproducible manner. Optimal conditions for individual cell lines can be achieved by adjusting MC or serum concentrations in the spheroid formation medium. The 3D spheroids generated can be collected for use in a wide range of applications, including cell signaling or gene expression studies, candidate drug screening, or in the study of cellular processes such as tumor cell invasion and migration. The protocol is also readily adapted to generate clonal spheroids from single cells, and can be adapted to assess anchorage-independent growth and anoikis-resistance. Overall, our protocol provides an easily modifiable method for generating and utilizing 3D cell spheroids in order to recapitulate the 3D microenvironment of tissues and model the in vivo growth of normal and tumor cells.

Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions.

3D Sfero Üretim için bir Verimli ve esnek Hücre Toplama Yöntemi

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODELAY: Maya Büyümesinin Çok Parametreli Niceleşmesi İçin Büyük Ölçekli Bir Yöntem

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Bir hücre dışı asidik pH kültür sistemi kurulması

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...