Biz geribildirim Dr Evan Newell ve Dr Sean Bendall teşekkür etmek istiyorum. Biz de Multi-lantanit içeren polistiren boncuklar bir örnek için DVS Bilimler ve Doktor Sean Bendall teşekkür etmek istiyorum. Biz NIH hibe 2 U19 AI057229 fon için minnettarız.

CyTOF için tüm hücre örneklerinin sabitlenir ve permeabilize gerekir. Bu, iridyum içeren DNA enterkalatörün daha fazla giriş sağlar, ve aynı zamanda kütle sitometresi içine enjekte hemen önce MilliQ su ve yıkama adımları sırasında yeniden süspansiyon hücre parçalama önler. 1. Start-up Kütle Sitometre arasında <ol><li> CyTOF yazılım programını açın. Enstrüman Ayarları&#39;nı seçin. Kart Kafesini sekmesinde, sağ alt köşeye gidin ve düğmesine &quot;ON&quot; Isıtıcı tıklayın. 200 ° C&#39;ye ulaşması sprey haznesi manto için yeterli zaman tanımak için ısıtıcı üzerinde istenilen zaman önce en az 15 dakika çevirin </li><li> MilliQ su ile dolu taze bir şırınga ile şırınga pompası beyaz Norm-JECT 3 ml şırınga değiştirin. </li><li> Nebulizatör Temizleme. Küçük sıvı giriş portu ve büyük gaz giriş noktası hem de 5 ile% citranox 2-3 kez çekmek için şırınga ve tüp kullanarak nebulizatör Backflush. MilliQ su t su tutmanın tekrarlayınrezidüel citranox kaldır o. </li><li> CyTOF ön panelindeki ışıklar Şekil 1&#39;deki gibi yandığını teyit için kontrol edin. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig1.jpg" /> Almadan önce Şekil 1. CyTOF paneli ışıkları. <ol start="5"><li> Argon gazı tank valfini açın. Bu açmak için ön &quot;ARGON&quot; ışığı neden olmalıdır. </li><li> Gaz girişi makyaj nebulizatör takın. Sökün gaz boru sistemi bağlayıcı makyaj ve siyah kauçuk o-ring ve beyaz konik plastik parça kaldırın. Nebulizer gaz giriş noktası kök üzerinde daha geniş bir &quot;knuckle&quot; unutmayın. Gaz giriş noktası konektörü yerleştirin. Gaz bağlantı ucuna siyah o-ring yerleştirin ve liman kök geniş kısmı geçmiş o-ring zorlamak. Make-up gaz boru üzerine beyaz konik plastik işaret dar ucu ile üst parça ve vida yerleştirin. </li><li&gt; Sıvı giriş hortumuna nebulizatör takın. Dikkatle nebulizer sonunda deliğe küçük boru yerleştirin. Bir mikropipet üzerinde durur hissediyorum benzer iki durak olacaktır. Eğer ışık direnci karşılayacak kadar Birincisi, basın; küçük hortumun ucu cam düz bölüm sonunda olmalıdır. İkincisi, uydurma içine daha fazla camın düz bölüm sonuna zorlamak için sert basın ve mühür rakoru sıkın. Isıtma manto beyaz boşluğa nebulizer sokun. </li><li> Enstrüman Setup penceresinin RFG Kontrolörü sekmesinde, &quot;Başlat Plazma&quot; tuşuna basın. Nebulizatör önceden takılmış olduğundan, &quot;OK&quot; tuşuna basın. Yazılım, chiller açın gaz akışını başlatmak ve bir plazma tutuşturmak olacaktır. Dedektör gerilimi kadar rampa olacak. Bittiğinde &quot;Plazma başlangıç ​​süreci başarıyla tamamladı&quot; söyleyerek bir pop-up penceresi olacak; basın &quot;Tamam&quot;. Yeni ışıkları (Şekil 2 ön panelde olmalıdır </strong<html> &gt;). </li></ol><img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4398/4398fig2.jpg" /> Şekil 2. Plazma ateşlenir ve start-up başarıyla tamamlandı CyTOF paneli ışıkları sonra. <ol start="9"><li> Şırınga pompası açma. Sağ üst köşesinde, şırınga pompası başlatmak ve borular yoluyla sıvı akan ve nebulizatör dıarıya başlamak için yeşil &quot;play&quot; tuşuna basın. Varsayılan şırınga ayarları 3 mL su içindir. Bu su bittiğinde örnek örnek döngü akan edilmesi için için, şırınga pompası belirli aralıklarla değiştirilmesi gerekir. Ekranın üst kısmında, sıvı şırınga pompası dışarı akıyordu ne kadar gösteren bir sayaç var. Şırınga pompası bu sayaç şırınga sonunda isabet &quot;3000&quot; ya da piston ulaştığı zaman durur. Şırınga doldurma zaman, &quot;dur&quot; yerine sayacını sıfırlamak için mavi &quot;pause&quot; düğmesine vurmalıdır. </li></ol>Kitle Sitometre e &quot;&gt; 2. Günlük Kalibrasyon <ol><li> Kitle sitometresinin kalibrasyon önce sıcak, kararlı plazma elde etmek için yaklaşık 20 dakika gerekir. Yüksek değerin% 3 altında sinyal; ayar adımların amacı &quot;Gd155&quot; (La139 + O16 oksit) tutarak Tm169 veya Tb159, istenen sinyali maksimize etmektir. Veri Toplama Ayarları penceresini açmak için Acquisition Ayarlar düğmesini tıklatın. Analitler sekmesinde, izotop seçim panelini açmak için periyodik tabloyu tıklatın. Kılavuzunda listelenen DVS Bilimleri ayarlama çözüm izotoplar seçin, ardından &quot;Kaydet&quot; düğmesini tıklatın. </li><li> Okuma penceresi Başına Kütle (es) açmak için düğmeye Okuma Başına İzotoplar tıklayın. Yeni bir numara girerken ve &quot;enter&quot; tuşuna basarak &quot;Bakliyat Count&quot; ve rescale y ekseni seçin. </li><li> Ayar solüsyonu ile yeşil 1 ml Norm-jesi şırınga doldurun. &quot;LOAD&quot; için örnek bağlantı noktası düğmesini çevirin, tuning çözüm 450 ul enjekte, sonra &quot;eklemesine&quot; düğmesini çevirin. Veri Acquisit ve Kütle Kalibrasyonu sekmesindeki<html> iyon Ayarlar penceresinde, kitleler tarafından akan hangi izlemek için &quot;Çalıştır&quot; tuşuna basın. Sağ tarafta yüksek kütle ise, pencerenin sol tarafında, düşük değerli bir kütledir. Not: önceden argon gazı içinde ksenon izotopları (Şekil 3) bağlı TOF 9400-9800 bölgede sinyalleri olacaktır. Akort çözüm izotoplar Bu ekranda çizgiler (Şekil 4) gibi görünmeye başlayacaktır kadar bekleyin. </li></ol><img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig3.jpg" /> Yıkama solüsyonu ve su durulama sonra çeşitli izotopları için arka plan düzeyini gösteren Şekil 3. Kütle kalibrasyon sekme penceresi,. TOF 9400-9800 çevresindeki bölgeye argon gazı xenon izotoplar karşılık gelir ve her zaman mevcut olmalıdır. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig3large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . 4 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4398/4398fig4.jpg &quot;/&gt; Şekil 4. Kütle kalibrasyon sekme penceresi, DVS ayarlama çözüm çeşitli izotopları dikey çizgiler gösteren. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig4large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <ol start="4"><li> Penceresi Okuma Başına Kütle (es) geri dönün ve sol üst köşede yeşil &quot;Oynat&quot; düğmesine basın. Adım 2.1 &#39;de seçilen her izotop farklı bir renkli çizgi ile temsil edilir. Varsayılan x-ekseni sn, &quot;Zaman&quot; dır. Onlar sabit oluncaya kadar farklı izotopların düzeyleri izleyin. </li><li> Akım ayarlama. Veri Toplama Ayarları penceresinin Parametre sekmesinde, açılan menüden &quot;Current&quot; seçeneğini seçin. = 0, bitiş = 10, adım değeri = 0.5, yerleşme zamanı = 200 başlayalım ve &quot;Kaydet&quot; tuşuna basın. Okuma pencere ve hit oyun Başına Kütle (es) geri tıklayınız. X-ekseni şimdi &quot;Güncel&quot; dir. Not nerede izotopları zirve (Şekil 5), ve r sinyalleri<html> ecord. Enstrüman Setup penceresinin DAC Kanallar Kurulumu sekmesi altında, &quot;Mevcut&quot; aşağı ilerleyin ve bu yeni bir değer girin. Basın &quot;Gerçek akım değeri ayarlama&quot;, sonra &quot;Kaydet&quot;. </li></ol><img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/4398/4398fig5.jpg" /> Şekil 5. Akım ayar profili. <ol start="6"><li> Makyaj gaz Tuning. Açılır menüsüne gidin &quot;Make-up gaz.&quot; = 0.95, adım değeri = 0.05, yerleşme zamanı = 200 = 0.55, son başlayalım. Kaydetmek basın. Okuma pencere ve hit oyun Başına Kütle (es) dönün. X-ekseni şimdi &quot;Make-up gaz&quot; akış oranıdır. Kayıt burada izotopları tepe sinyaller. Sonuna &quot;Gd155&quot; sinyali (Şekil 6) hızlı artış dikkat edin. DAC Kanallar Kurulum sekmesine dönmek için &quot;Make-up gaz&quot; aşağı ilerleyin ve bu yeni bir değer girin. Basın &quot;Gerçek akım değeri ayarlama&quot;, sonra &quot;Kaydet&quot;. </li></ol>ŞEKIL 6 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4398/4398fig6.jpg &quot;/&gt; Şekil 6. Make-up gaz ayar profili. <ol start="7"><li> Kaydedilmesi oranı izotop vs oksit istenen. Ayarlama çözüm ikinci bir 450 ul enjeksiyonu olun. Parametre sekmesinde, açılan menüden &quot;Time&quot; öğesini, süre = 200 yerleşmeden, = 0, bitiş = 10, adım değeri = 1 başlayalım. &quot;Tasarruf&quot; a basın. Penceresinde Okuma Başına Kütlesindeki &quot;play&quot; (es) Hit. Hatları (Şekil 7) stabilize sonra, Tm169 veya Tb159 (daha yüksek bir değer) için üst sol kutulara değeri okumak için imleci kullanımı ve ayrıca &quot;Gd155&quot; değeri (daha yüksek bir değer arasında &lt;% 3). Bu değerler aynı zamanda ileride bir ayar dosyasına kaydedilebilir. </li></ol><img alt="Şekil 7" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig7.jpg" /> Şekil 7. Akım ve Make-up gaz optimize sonra ayar çözümü sinyal intensitesi ölçümü. <ol start="8"><li> Sam temizlenmesiple döngü. DVS Yıkama Çözeltisi 500 ul ardından, örnek döngü MilliQ 3 mL su enjekte edilir. Kütle Kalibrasyonu sekmesindeki &quot;run&quot; düğmesine basarak temizleme ilerleme izleyin. Çizgiler yoğunluğunu (Şekil 4) arka plan düzeyleri (Şekil 3) aşağı kadar MilliQ su ve monitör 3 ml uygulayın, sonra azalmaya başlayana kadar yıkayın. </li></ol> 3. Koşu Örnekleri <ol><li> Toplama penceresini açın. Varsayılan ayarlar:-The-Fly Analizi = Do = Çift, Çift Sayım Kalibrasyon = Veri Analiz Sinyal. Gürültü Azaltma seçilir. İstenirse, bu herhangi bir değiştirilebilir. Dosya adını girin. Tüm dosyaları E :/ / diskinize GEREKIR. </li><li> Edinimi Gecikmelerin ayarlanması. Örnek döngü ve nebulizatör arasındaki boru uzunluğu nedeniyle yaklaşık 30 sn hücre olayları kaydederken bir gecikme olacaktır. Bu nedenle, toplam &quot;Toplama gecikmesi&quot; toplam ve &quot;Dedektör styetenek gecikmesi &quot;, en az 30 saniye olmalıdır. Detektör kararlılık gecikme en az 20 saniye olmalıdır. </li><li> Veri toplama süresinin ayarlanması. &quot;Toplama zaman&quot; size örnek çalıştırmak istediğiniz saniye sayısıdır. Tüm 450 mikrolitre numune döngü Dolum 600 sn tamamlamak için gerektirir. Bu 50-100 sn numune taşınmasını en aza indirmek için çalışma süresi sonuna eklenecek önerilmektedir. </li><li> Örnek yeniden süspanse. Makine içinde tuzların birikmesi en aza indirmek için, MilliQ su içinde son bir yeniden süspansiyon, ardından hücre boyama sonunda, MilliQ su içinde en azından iki yıkamadan yapılması önerilmektedir. MilliQ su hacmi pelet Eğer ile başladığı hücre ile tüm boyama işlemi sonrası iyileşme hücre sayısına bağlı olarak değişecektir hücre süspansiyonu kullanılır. Iyi bir başlangıç ​​yeri 10 6 (başlangıç) hücre / ml &#39;dir. Tabanda sonra, agrega kaldırmak için bir hücre süzgecinden filtre. </li><li> Başlangıç ​​örnek çalıştırın. Geçerli örnek için yeni bir dosya adı girin.<html> , &quot;LOAD&quot; örnek enjekte, Toplama penceresinde o vurdu &quot;Çalıştır&quot; &quot;INJECT&quot; geri dönmek için örnek döngü valfi açın. </li><li> Hücre olayları kaydediliyor. Hücreler her dikey izotop / işaretleyici kanalı (Şekil 8) işaretleri yatay koleksiyonları gibi anlık penceresinde temsil edilecek. Kitle sitometresinin 1.000 hücre / sn kayıt olurken, hücre olaylar arasında daha iyi çözünürlük, genellikle 300-500 hücre / sn elde edilir. Bu ~ 1 hücre / ekran tazeleme bir ortalama karşılık gelir. Hücre olay sayacını tırmanmaya başlamadan önce yaklaşık 30 saniye kadar sürebilir. Bu &quot;On-the-fly&quot; veri işleme nedeniyle, herhangi bir hücre olay bilgileri kaybolur. </li></ol><img alt="Şekil 8," src="/files/ftp_upload/4398/4398fig8.jpg" /> Şekil 8. Örnek sırasında Kazanç penceresi üç ayrı hücre olaylar ile ilişkili öğelere karşılık gelen noktalar yatay satırları gösteren, çalışıyor.ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın. <ol start="7"><li> Hücre olayların Kalitesi. Her bir izotop kanal, aynı zamanda, hücre olay oranında çizgiler Herhangi bir arka plan dikkat edin. Kitle sitometresinin bir arka plan üzerinde sinyal belirli bir artış olarak &quot;hücre olay&quot;, yani serbest metal veya ilişkisiz antikor &quot;hücre olayı&quot; sayısı değiştirebilir arka plan sinyali tanır. Ayrıca, çok yüksek bir konsantrasyonda hücrelere çalışan çifti olay daha fazla sayıda neden olabilir. Arkaplan ek yıkar veya daha hücre seyreltme ile azalmış olabilir. Çiftlerin artan çalışma zamanı pahasına, büyük hücreli seyreltme ile minimize edilebilir. </li><li> Örnek veri toplama tamamlanması. Toplama zamanı ulaşıldığında, veri toplama sona erecektir. Ile bir pop-up penceresi önce biraz gecikme olacak &quot;Tamam&quot; düğmesi belirir ve yine bu &quot;On-the-fly&quot; veri işleme kaynaklanmaktadır. Örnek satın alma aynı zamanda Premat durdurulabilirurely &quot;Stop&quot; düğmesine basarak. Bu durumda, zaten kayıtlı tüm hücre olaylar çıktı dosyalarına sayılır ve işlenecektir. </li><li> Her numune arasındaki MilliQ su en az 500 ul Enjeksiyon ayrıca numune taşınmasını en aza indirir. </li></ol> 4. Kullanım sonrası Temizleme Makinesi <ol><li> Çözüm yıkayın. Son örneği çalıştırın ve su ile yıkanmalıdır örnek döngü örnek döngüye yıkama solüsyonu 450 ul enjekte edildikten sonra. Adım 2.8 olarak Veri Toplama Ayarlar penceresinde (Şekil 9) Kütle Kalibrasyonu sekmesindeki serbest metal serbest izleyin. Serbest metal sinyali azalmaya başladığında, MilliQ 3 mL su ile yıkayın ve arka plan düzeyi elde edilinceye kadar izlenmesi. </li></ol><img alt="Şekil 9" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig9.jpg" /> DVS Yıkama solüsyonu ile post-run temizlik sırasında Şekil 9. Kütle kalibrasyon sekme penceresi,. TOF bölgede 9800-11000 yılında dikey çizgiler makineden temizlendi antikor-etiket izotopları vardır. TOF 11500 çevresindeki dikey çizgiler iki Ir enterkalatörün izotopu karşılık gelir. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig9large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . 5. Makine Kapatma <ol><li> Enstrüman Setup penceresinin RFG Kontrolörü sekmesinde, &quot;Plazma durdur&quot; seçeneğini seçin. Işlemi tamamlandığında, nebulizatör kaldırmak isteyen bir pop-up penceresi olacak. &quot;Tamam&quot; tuşuna basın. Kart Kafesini sekmesinde, ısıtıcıyı kapatın. Argon kaynağı vanasını kapatın. </li><li> Nebulizer Kaldırma. Dikkatle geriye çekerek sprey odasından nebulizatör çıkarın. Sökün numune tanıtım Adım 1.6 hortumu ve bir kenara koyun. Biraz gevşetmek için sökün makyaj gaz giriş bağlantısı, sonra nebulizatör çekin. Birlikte vidalı montaj Leaving l şansını azaltacaktırsiyah kauçuk o-ring ve beyaz konik plastik parça osing. </li><li> Nebulizatör Temizleme. Adım 1.3 olarak şırınga ve tüp kullanarak% 5 citranox ile nebulizer iki port Backflush. Mağaza, sonraki kullanıma kadar% 5 citranox içinde kaplı. </li></ol>

<ol>
	<li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+Technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+Time-of-Flight+mass+spectrometry.">Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).</li><li>Lou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-based+elemental+tags+for+sensitive+bioassays.">Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).</li><li>Majonis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curious+results+with+palladium-+and+platinum-carrying+polymers+in+mass+cytometry+bioassays+and+an+unexpected+application+as+a+dead+cell+stain.">Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain.</a> Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).</li><li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+mass+cytometry+methods+for+bacterial+discrimination.">Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination.</a> Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).</li><li>Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum.">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li><li>Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry+by+Time-of-Flight+shows+combinatorial+cytokine+expression+and+virus-specific+cell+niches+within+a+continuum+of+CD8++T+cell+phenotypes.">Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes.</a> Immunity. 36, 142-152 (2012).</li></ol>

İnsan İmmün İzleme Merkezi, kitlesel sitometri dahil testlerin maliyeti kurtarmak için sadece kullanıcı ücretleri ücretleri Stanford Üniversitesi&#39;nde bir hizmet merkezinde yazarlar her iki çalışma.

Son birkaç yıldır, floresans akış sitometri yüzey ekspresyonu açısından ve fonksiyonel testleri, hem tek hücre analizi için bir beygir yöntem olmuştur. Ancak, floresan boyalar spektral örtüşme sorunları eşzamanlı belirteçlerin sayısını sınırladı. 12&#39;den fazla eşzamanlı işaretleyiciler kullanılarak deneyler bildirilmiştir ederken, gerekli tazminat miktarı bu teknik zorlaştırmaktadır. Bunun yerine florofor, kitle sitometri antikorları için etiket gibi m...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> CyTOF TM kitle sitometresinde </td><td> DVS Bilimleri </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Çözüm yıkayın </td><td> DVS Bilimleri </td><td> 201071 </td><td> Su içinde% 0.05 hidroflorik asit </td></tr><tr><td> Çözüm Tuning </td><td> DVS Bilimleri </td><td> 201072 </td><td> 0.5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, iz nitrik asit </td></tr><tr><td> Eu içeren polistiren boncuklar </td><td> DVS Bilimleri </td><td> 201073 </td><td> Yaklaşık 1 milyon / mL &#39;de verilen boncuklar; doğal bolluk Eu izotoplar içerir </td></tr><tr><td> Multi-lantanit içeren (La / Pr / Tb / Tm / Lu) - polistiren boncuklar </td><td> DVS Bilimleri </td><td> Henüz piyasada bulunan </td><td> Listelenen lantanitler doğal bolluk izotoplar içerir </td></tr><tr><td> Nitrik asit (konsantre) </td><td> Fisher Scientific </td><td> A467-500 </td><td> Optima iz-metal saf ICP-MS dereceli </td></tr><tr><td> Polistiren yuvarlak tabanlı tüp hücre süzgeç kap-5ml ile </td><td> BD </td><td> 352235 </td><td> Enjeksiyon öncesi hücre örneklerinin filtrelemek için kullanılır </td></tr><tr><td> Norm-JECT tuberkulin şırınga 1ml </td><td> Henke Sass Wolf, </td><td> 4010-200V0 </td><td> silikonsuz, lateks içermeyen </td></tr><tr><td> Norm-JECT şırınga-3 mL </td><td> Henke Sass Wolf, </td><td> 4010.000V0 </td><td> silikonsuz, lateks içermeyen </td></tr><tr><td> MilliQ su </td><td></td><td></td><td> 18 MΩ saf su, cam veya ticari deterjan (baryum mevcut yüksek düzeyleri nedeniyle) ile yıkanmış plastik şişelerde muhafaza edilmemelidir. </td></tr><tr><td> Citranox </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z273236 </td><td> asit deterjan </td></tr><tr><td> Argon gazı </td><td> Praxair </td><td> AR 5.0UH-T </td><td> 99.999% Ultra yüksek saflıkta </td></tr></tbody></table>

mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a cytof mass cytometer

Son yıllarda, tek hücrelerin hızlı analiz genellikle akış sitometrisi ve floresan-etiketli antikorlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Ancak, fluorofor emisyon spektral örtüşme sorunu eşzamanlı probların sayısını sınırladı. Buna karşılık, daha çok floroforlar göre bir ICP-MS. 1 bir sıvı tek hücreli giriş sistemi DVS Sciences çiftler tarafından yeni CyTOF kütle sitometresinde yüksek oranda zenginleştirilmiş metal şelatlama izotopları ihtiva eden polimerler, antikorlar ya da başka özel problar ile birleştirilir. 2-5 Çünkü metal saflık ve kitle sitometresinin kütle çözünürlüğü, komşu izotoplar hiçbir &quot;spektral örtüşme&quot; olduğunu ve bu nedenle tazminat matrisler gerek. Buna ek olarak, lantanit metallerinin kullanımına bağlı olarak, otoflöresans herhangi bir eşdeğer bu nedenle hiçbir biyolojik arka plan ve. Atomik kütle 103-203, teorik olarak en fazla 100 etiket eşzamanlı ayırtedilebilecektir kapsayan kitlesel bir pencere bulunmaktadır. Şu anda, 35&#39;ten fazla kanalı örneklerin immünolojik profili görülmemiş diseksiyonu izin DVS Bilimler edinilebilir şelatlama reaktifler kullanılarak kullanılabilir. 6-7 Kitle sitometri için Dezavantajları prob başına ayrı bir metal izotop (ileri veya yan dağılım hiçbir eşdeğeri) ve yıkıcı bir tekniktir (kurtarma sıralama ihtimalinin) olması için sıkı gereksinimi vardır. Kütle sitometresinin akım konfigürasyonu, aynı zamanda tek bir hücre iletim hızı ~% 25, ​​ve böylece hücrelerin daha yüksek giriş numarası gerektiren sahiptir. Kitle sitometresinin Optimal günlük performans birkaç adım gerektirir. Optimizasyon temel hedefi M sinyal yoğunluğu azaltmak ve M +16 de istenilen sinyal ile müdahale edeceğini oksitler (M +16) oluşumunu azaltırken istenen metal izotopları (M) ölçülen sinyal yoğunluğunun maksimize etmektir. İlk adım, makinenin çok sıcak, istikrarlı Ben ısınmak içinCP plazma kurulmuştur. İkincisi, güncel ve makyaj gaz akış hızı ayarlarına günlük olarak optimize edilmelidir. Numune toplama sırasında yüksek hücre olay hızı detektörü verim ve işlem hızı 1000 hücre / dakika ile sınırlıdır. Bununla birlikte, daha düşük bir hücre olay oranı (300-500 hücre / saniye), örnek kalitesine bağlı olarak, genellikle hücre olaylar arasında ve böylece daha iyi bir çözünürlüğe çiftler çifti ve kalıntı fazla bozulmadan singlet en üst düzeye izin vermek için arzu edilir. Son olarak, günün sonunda makinenin uygun temizleme serbest metale bağlı olarak arka plan sinyali en aza indirir.

Yukarıdaki protokolü takiben dört şeyi başarmak gerekir. İlk olarak, kitle sitometresi için yeterli ısınma süresi sağlayan optimal sinyal ve minimal oksit oluşumu için gerekli bir sıcak, kararlı plazma üretecek. MilliQ su ve DVS Yıkama solüsyonu (Şekil 9) ile kitle sitometresinin İkincisi, yeterli yıkama (Şekil 8) örnek toplama sırasında arka plan azaltmaya yardımcı, metal adsorpsiyon düzeyleri tüp ve makinenin diğer parçaları azaltmaya yardımcı olacakt...

Watch this Scientific Journal Video about Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer at JoVE.com

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Bir CyTOF kitle sitometresinin performans günlük ayarlama ve optimizasyon için gerekli adımlar açıklanmaktadır. Optimum numune hazırlama ve akış hızı Comments on tartışılır

Kütle Sitometri: Bir CyTOF Kütle Sitometre Daily Tuning ve Koşu Hücre Örnekleri için protokol

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

mass-cytometry-protocol-for-daily-tuning-running-cell-samples-on

Research

JoVE Journal

Bioengineering

22.7K Görüntüleme.  Stanford University. Bir CyTOF kitle sitometresinin performans günlük ayarlama ve optimizasyon için gerekli adımlar açıklanmaktadır. Optimum numune hazırlama ve akış hızı Comments on tartışılır

Video: Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

3D parçacıklarının Üretimi için Basit Asma Bırak Hücre Kültürü Protokolü

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Biyomühendislik

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Hücresel Lipid Ekstraksiyon Hedefli Kararlı İzotop Seyreltme Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Analizi

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general relatively bulky and costly, making them less effective in the resource limited settings. To potentially address these limitations, we have recently demonstrated the integration of wide-field fluorescent microscopy and imaging flow cytometry tools on cell-phones using compact, light-weight, and cost-effective opto-fluidic attachments. In our flow cytometry design, fluorescently labeled cells are flushed through a microfluidic channel that is positioned above the existing cell-phone camera unit. Battery powered light-emitting diodes (LEDs) are butt-coupled to the side of this microfluidic chip, which effectively acts as a multi-mode slab waveguide, where the excitation light is guided to uniformly excite the fluorescent targets. The cell-phone camera records a time lapse movie of the fluorescent cells flowing through the microfluidic channel, where the digital frames of this movie are processed to count the number of the labeled cells within the target solution of interest. Using a similar opto-fluidic design, we can also image these fluorescently labeled cells in static mode by e.g. sandwiching the fluorescent particles between two glass slides and capturing their fluorescent images using the cell-phone camera, which can achieve a spatial resolution of e.g. ~ 10 &mu;m over a very large field-of-view of ~ 81 mm2. This cell-phone based fluorescent imaging flow cytometry and microscopy platform might be useful especially in resource limited settings, for e.g. counting of CD4+ T cells toward monitoring of HIV+ patients or for detection of water-borne parasites in drinking water.

We review our recent results on the integration of fluorescent microscopy and imaging flow cytometry tools on a cell-phone using compact and cost-effective opto-fluidic attachments. These cell-phone based micro-analysis devices might be useful for cytometric analysis, such as performing various cell counting tasks as well as for high-throughput screening of e.g., water samples in resource limited settings.

Bir Cep telefonu ile ilgili Geniş alan Floresan Mikroskopi ve Floresan Görüntüleme Flow Sitometri

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

Desorpsiyon Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometresi ile Biyolojik Dokuların Görüntüleme

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

Photolithographically Tanımlı Parylene-C hücre Desenlendirme: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Yüzeyleri

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Immortalized cancer cell lines can be grown as 3D cell cultures, a valuable model for biological research. This protocol describes mass spectrometry imaging of 3D cell cultures, including improvements in the sample preparation platform. The goal of this protocol is to instruct users to prepare 3D cell cultures for mass spectrometry imaging analysis.

3D Hücre Kültürü Modelleri Kütle Spektrometre Görüntüleme Hazırlık Stratejileri Numune

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion receptors and associated signal transduction membrane proteins, the cytoskeletal architecture, and molecular motors1, 2. Mechanosensitivity of different cancer cells in vitro are investigated primarily with immortalized cell lines or murine derived primary cells, not with primary human cancer cells. Hence, little is known about the mechanosensitivity of primary human colon cancer cells in vitro. Here, an optimized protocol is developed that describes the isolation of primary human colon cells from healthy and cancerous surgical human tissue samples. Isolated colon cells are then successfully cultured on soft (2 kPa stiffness) and stiff (10 kPa stiffness) polyacrylamide hydrogels and rigid polystyrene (~3.6 GPa stiffness) substrates functionalized by an extracellular matrix (fibronectin in this case). Fluorescent microbeads are embedded in soft gels near the cell culture surface, and traction assay is performed to assess cellular contractile stresses using free open access software. In addition, immunofluorescence microscopy on different stiffness substrates provides useful information about primary cell morphology, cytoskeleton organization and vinculin containing focal adhesions as a function of substrate rigidity.

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

Cerrahi Dokular İlköğretim İnsan Kolon Tümör Hücreleri İzolasyon ve Çekiş Sitometrinin Yumuşak Elastik Yüzeyler Doğrudan onları Kültürleme

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

A Protocol for Bioinspired Design: A Ground Sampler Based on Sea Urchin Jaws

Bioinspired design is an emerging field that takes inspiration from nature to develop high-performance materials and devices. The sea urchin mouthpiece, known as the Aristotle's lantern, is a compelling source of bioinspiration with an intricate network of musculature and calcareous teeth that can scrape, cut, chew food and bore holes into rocky substrates. We describe the bioinspiration process as including animal observation, specimen characterization, device fabrication and mechanism bioexploration. The last step of bioexploration allows for a deeper understanding of the initial biology. The design architecture of the Aristotle's lantern is analyzed with micro-computed tomography and individual teeth are examined with scanning electron microscopy to identify the microstructure. Bioinspired designs are fabricated with a 3D printer, assembled and tested to determine the most efficient lantern opening and closing mechanism. Teeth from the bioinspired lantern design are bioexplored via finite element analysis to explain from a mechanical perspective why keeled tooth structures evolved in the modern sea urchins we observed. This circular approach allows for new conclusions to be drawn from biology and nature.

A protocol for bioinspired design is described for a sampling device based on the jaws of a sea urchin. The bioinspiration process includes observing the sea urchins, characterizing the mouthpiece, 3D printing of the teeth and their assembly, and bioexploring the tooth structure.

Biyolojik Tabanlı Akıllı Tasarım için Protokol: A Zemin Sampler Deniz Kestanesi Jaws dayanarak

Bioinspired design is an emerging field that takes inspiration from nature to develop high-performance materials and devices. The sea urchin mouthpiece, ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) is an example of such methods, where features of matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) (e.g., pulsed nature of desorption) and electrospray ionization (ESI) (e.g., soft-ionization) are combined. One of the major advantages of MALDESI is its inherent versatility. In MALDESI experiments, an ultraviolet (UV) or infrared (IR) laser can be used to resonantly excite an endogenous or exogenous matrix. The choice of matrix is not analyte dependent, and depends solely on the laser wavelength used for excitation. In IR-MALDESI experiments, a thin layer of ice is deposited on the sample surface as an energy-absorbing matrix. The IR-MALDESI source geometry has been optimized using statistical design of experiments (DOE) for analysis of liquid samples as well as biological tissue specimens. Furthermore, a robust IR-MALDESI imaging source has been developed, where a tunable mid-IR laser is synchronized with a computer controlled XY translational stage and a high resolving power mass spectrometer. A custom graphical user interface (GUI) allows user selection of the repetition rate of the laser, number of shots per voxel, step-size of the sample stage, and the delay between the desorption and scan events for the source. IR-MALDESI has been used in variety of applications such as forensic analysis of fibers and dyes and MSI of biological tissue sections. Distribution of different analytes ranging from endogenous metabolites to exogenous xenobiotics within tissue sections can be measured and quantified using this technique. The protocol presented in this manuscript describes major steps necessary for IR-MALDESI MSI of whole-body tissue sections.

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.

Kızılötesi Matriks destekli lazer desorpsiyon Elektrosprey İyonizasyon tarafından tüm vücut Kütle Spektrometre Görüntüleme (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In higher eukaryotes, paralogous genes can mask a potential phenotype by compensating the loss of a gene, thus limiting the information that can be obtained from genetic studies relying on single gene knockouts. We have developed a novel, rapid cloning method for guide RNA (gRNA) concatemers in order to create multi-gene knockouts following a single round of transfection in mouse small intestinal organoids. Our strategy allows for the concatemerization of up to four individual gRNAs into a single vector by performing a single Golden Gate shuffling reaction with annealed gRNA oligos and a pre-designed retroviral vector. This allows either the simultaneous knockout of up to four different genes, or increased knockout efficiency following the targeting of one gene by multiple gRNAs. In this protocol, we show in detail how to efficiently clone multiple gRNAs into the retroviral CRISPR-concatemer vector and how to achieve highly efficient electroporation in intestinal organoids. As an example, we show that simultaneous knockout of two pairs of genes encoding negative regulators of the Wnt signaling pathway (Axin1/2 and Rnf43/Znrf3) renders intestinal organoids resistant to the withdrawal of key growth factors.

This protocol describes the steps for cloning multiple single guide RNAs into one guide RNA concatemer vector, which is of particular use in creating multi-gene knockouts using CRISPR/Cas9 technology. The generation of double knockouts in intestinal organoids is shown as a possible application of this method.

Bir CRISPR-konkantör kullanarak Fare Küçük Bağırsak Organoidleri Üzerinde Birden Fazla Gen Kıyamet Protokolü

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In ...