Name: glutamine flux imaging using genetically encoded sensors
Uploaded: 2014-07-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors at JoVE.com

Bu çalışma NIH hibe 1R21NS064412, NSF hibe 1052048 ve Jeffress Memorial Trust hibe J-908 tarafından desteklenmiştir.

1.. Numune Hazırlama Not: Birçok durumda perfüzyon deneyleri sinir bozucu bir sorun haline, hangi hücrelerin önemli bir kısmını silsin. Poli-L-lizin ile tüm hücre hatları, kaplama, cam yüzeyler için kapak (yüzeye% 0.01 çözelti 1.0 ml/25 cm 2 eklemek gerekli değildir, ancak, hücre kültürü dereceli su ile iki kere yıkayın,&gt; 5 dakika inkübe edilir, ve kuru biyogüvenlik kabini) hücre yapışmasını artırır. Ayrıca, kullanılan hücre hattının biyogüvenlik düzeyi (BGS) farkında olmak ve yerel çevre, sağlık ve güvenlik ofisi tarafından onaylanan standart işletim prosedürü izleyin. Bu deneyde, COS7 hücreleri (bkz. Şekil 4) bağlı olarak düşük bir endojen glutamin taşıma aktivitesi için kullanılmıştır. <ol><li> Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) içinde% 70-80 konflüansa +% 10 kozmik buzağı serumu ve 100 U / ml penisilin / streptomisin, ya da 6-çukurlu kültür yerleştirilen steril 25 mm cam lamelleri ° &#39;de Tohum COS7 hücreleriçanak veya 8-iyi cam alt slaytlar. 37 ° C,% 5 CO2, 24 saat boyunca% 100 nemde inkübe edin. </li><li> Üreticinin protokolüne göre, DMEM +% 10 kozmik buzağı serumu (no antibiyotikler) için büyüme ortamı değiştirin. % 100 nemde 37 ° C,% 5 CO2 de O / N büyütün. </li><li> (CMV promotörü altında 10 FLIPQTV3.0 algılayıcı taşıma pcDNA3.1) glutamin sensör ve 10-50 ml serum içermeyen ortam (OPTI-MEM) mCherry-etiketli ASCT2 kodlayan 0,4 mg plasmid DNA&#39;nın her ekleyin ve hafifçe karıştırın. </li><li> 50 ml serumsuz ortam için transfeksiyon reaktifi 1 ml ilave edilir. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> DNA (adım 1.3) ve transfeksiyon ayıracı (adım 1.4) içeren iki çözüm karıştırın ve 20 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Yavaşça hücrelerin üstünde transfeksiyon reaktifi ekleyin ve bölmeyi sallanan ile yavaşça karıştırın. 37 ° C,% 5 CO2,% 100 nemde 24 saat boyunca inkübe edin. </li><li> 24 saat sonra, DMEM +% 10 Cosmic Buzağı Serumu için orta alışverişiPenisilin / streptomisin (CCS) + 100 birim. </li><li> Hücreler 48-72 saat sonrası transfeksiyonunu görüntülenmiş. </li></ol> 2.. Perfüzyon Deney Not: Bu deneyde kullanılan COS7 hücreleri için, ortam perfüzyon ve oda sıcaklığında tutuldu ve ortam CO2 konsantrasyonu edilmiştir. Kullanılan hücreler, yüksek sıcaklık ve CO2 konsantrasyonu kontrol hayatta kalmak için, ısıtılmış mikroskop sahne ve / veya çevresel bir odayı gerektirir, ancak, kullanılmalıdır. <ol><li> Perfüzyon tampon AF hazırlayın (Malzeme Listesi). , 50 ml şırınga stopcocks takın stopcocks kapatın perfüzyon çözümleri ile doldurun. Tampon ile vana baş boşluğu doldurmak için kısa bir süre için musluğunu açın. </li><li> Bir perfüzyon kalem ile 8-kanal, yerçekimi beslemeli perfüzyon sistemine geçin ve sonra İşlev Seç seçeneğinin altında &quot;Manual Mode&quot; seçeneğini seçin. Perfüzyon kalem altında bir atık kabı yerleştirin. </li><li> El ileilgili sayılara basarak bağlantı noktalarını etkinleştirmek ve su içeren 10 ml şırınga kullanarak borulama doldurun ve ardından bağlantı noktasını kapatın. Bağlantı noktaları su ile doldurulur sonra, perfüzyon sisteminin bağlantı 1-6 tampon AF içeren şırıngalar ayarlayın ve sonra stopcocks açın. Tamponlar ile boru içinde su yerine tekrar bağlantı noktalarını açın. Akış hızı yaklaşık 0.8 ml / min. </li><li> Geri tuşuna basın &quot;İşlev Seç&quot; menüsüne gitmek için perfüzyon denetleyici kez iptal. &quot;Düzenleme Programı&quot; seçeneğine geçiş, daha sonra perfüzyon protokol Tablo 1&#39;de belirtilmiştir yazın. Perfüzyon programı kaydedin. </li><li> Kuluçka hücrelerini almak. Perfüzyon tamponu ile iki kez yıkanır ve daha sonra sahnede hücreleri ayarlayın. Bölmeye perfüzyon sistemine bağlayın. Açık bir bölme kullanılırsa, odasından perfüzyon çözeltisi kaldıran bir pompayı ayarlamak. </li><li> Slidebook yazılımını açın. Yeni bir slayt başlatın. Not:Aşağıdaki prosedür, Slidebook yazılımına özeldir, ancak bu MetaFluor ve Nis&#39;te öğeli gibi diğer yazılım aynı zamanda burada tarif edilen görüntüleme türü için de kullanılabilir. Teorik deneyler zaman ders görüntüleme sağlayan herhangi bir yazılım kullanarak yapılabilir, ve görüntü dizileri gibi ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) ya da Fiji gibi yazılımları kullanarak post-deneysel analiz edilebilir (http:/ / fiji.sc / Fiji). Ancak, alıcı / verici oranının gerçek zamanlı izleme sağlayan bir yazılımdır son derece yararlıdır. </li><li> Floresan mikroskop sahneye slayt monte edin. Uygun filtre setleri kullanılarak sensör ve ASCT-mCherry birlikte sentezleyen hücreleri bulmak &quot;ODAK&quot; fonksiyonu altında (Malzeme listesi). &quot;Kamera&quot; sekmesini tıklayarak ve &quot;kazanç&quot; altında kaydırma çubuğunu kaydırarak kazanç ayarlayın. Ayrıca, nötr yoğunluk filtresi açılır menüden nötr yoğunluk filtresi ayarını. Not: Filtre küp göz filtresi içermiyorsa, shor beri göz parçaları kullanmayınt-dalga boyu uyarım ışık gözler için zararlıdır. Yerine hücreleri bulmak için bilgisayar ekranı kullanın. </li><li> Hücrelerin görüntülerini elde with donor ( mTFP1) ex donor(mTFP1) em , donor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em and acceptor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em m channels (Filtreler Malzeme Listesi&#39;nde belirtilen). &quot;Görüntü Yakalama&quot; tıklatın ve sonra satın alma penceresinde, kullanılan olacak olan filtreleri belirtebilirsiniz. Sonraki filtre ayarları kutuya istenen pozlama süresini yazarak pozlama süresini ayarlamak için &quot;TEST&quot; butonuna tıklayın. Not: Tüm üç kanalın aynı uzunluğu için açık olması gerekir. Görüntüleme parametrelerini ayarlarken, beklenen verimliliği FRET değişiklik almak ve dikkate artırmak kat: FRET verimliliği deney sırasında 2 kat gitmesi bekleniyor ise, örneğin, görüntüleme parametreleri ayarlanmalıdıro kanal deney sırasında doymuş olmaz bu yüzden dinlenme devlet Donör eski Akseptör em yoğunluğu, &lt;aracı ile kaydedilebilir maksimum değerin% 50 olmalıdır ki. Etiketlenmiş hücrelerden sinyal arka bölgede daha en az üç kat daha yüksek olmalıdır. </li><li> Yazılımda bölgeler aracı kullanılarak ilgi konusu bir bölge çizin. Alternatif olarak, belirli bir yoğunluk yukarıda piksel seçmek için bir yazılım fonksiyonu kullanılabilir ve daha sonra bölgeler dönüştürülür. Bunu yapmak için, Maske tıklayın - Segment, ardından istenen alanları vurgulamak için kayan çubuğu hareket ettirin. </li><li> Yakalama tipi kutusunda &quot;time lapse&quot; seçin, sonra aralığını (bu deneyde 10 sn) ve deney için zaman noktaları belirtin. </li><li> Herhangi bir floresan hücreleri olmadan bir alanda bir bölge çizin. Bu alan, arka plan çıkarma için kullanılır. Sağ çizilen bölgeyi tıklatın ve sonra bir arka plan olarak ayarlayın. Not: bir hayır vardır İdeal olarak, hücreleriSensörlerin ifade t otoflüoresanla ve kamera tarafından algılanan arka plan çiçeklenme hem de hesaba arka bölge olarak kullanılmalıdır. Böyle bir hücre, görüş alanında mevcut ise, hücrelerin olmadan en az bir bölge eşiğe hesaba katmak için kullanılmalıdır. </li><li> Seçenek - &quot;Run programları Select Function&quot; altında istediğiniz programı seçin. Kayıtlı program (adım 2.3) geliniz, ve sonra perfüzyon kumanda üzerindeki ENTER tuşuna basın. Şimdi program yüklü ve herhangi bir tuşa basarak perfüzyon başlayacaktır. </li><li> Perfüzyonu sağlamak ve görüntüleme deney perfüzyon denetleyici bir tuşa basarak aynı anda yakalama penceresinde &quot;Başlat&quot; düğmesini tıklayarak aynı anda başlayacak. Not: Bu çözümler (bu satın alma sekmesi içinde bulunan &quot;NOTLAR&quot; fonksiyonu kullanılarak yapılabilir) alışverişinde zaman noktası kaydetmek için tavsiye edilir. </li><li> Aynı perfüzyon protokol USI gerçekleştirinDeneysel koşullar altında doymuş veya ilişkisiz ya olması beklenen bir algılayıcı ifade eden hücreleri ng. Not: Burada, deneysel koşullar altında, doymuş FLIPQTV3.0_1.5μ, bir kontrol, Şekil 6 olarak kullanılan bu tür kontrol deneyleri FRET verim değişiklik olmayan alt-tabakanın gerçek değişim nedeniyle ve onaylamak için gereklidir. nedeniyle bu tür hücresel pH gibi diğer parametreleri değiştirmek için. </li></ol> 3. Post-deney Analizi <ol><li> Örnek sürüklenme deney sırasında meydana gelirse inceleyin. Faiz (ROI) Bölgeler Beraberlik timepoint 0 alınan görüntü üzerinde s, daha sonra görüntüleme penceresinin üst kısmında kayan çubuğu hareket ve hücreler deneyde sonra çekilen görüntülerde İB&#39;nin kalkmak olmadığını kontrol edin. </li><li> Evet, o Maskesini seçerek hücrelerinin etrafında maskeler oluşturarak, ilk olarak sürüklenme düzeltmek için izleme fonksiyonunu kullanırsanız - Segment, sonra HIG için cutoff belirten hattını kaydırınbölgeler hücreleri içeren hlight. Maskesini tıklayarak bölgeleri takip - Partikül izleme - Temel parçacık izleme. </li><li> Gerektiğinde ROI&#39;ler yeniden çizmek ve arka plan bölgesi. </li><li> Deney boyunca İB&#39;nin ortalama yoğunluğu aktarın. İstatistikler tıklayın - İhracat - Oran / timelapse veri. </li><li> Substrat konsantrasyon FRET verimliliği ve ölçülmesi gerekli değildir iken, alt tabakanın dinamiklerinin bir vekil olarak yoğunluk oranı (Donör ex Alıcı em / Donör ex Donör em) zaman ders arsa. Sitosolik konsantrasyonunu belirlemek için, maksimal ve (sırasıyla substratın doyurma ve yokluğunda da, yani,) minimum bir değişim oranı, Ír max hesaplamak - aşağıdaki denkleme Δratio (Ír) doğrusal olmayan regresyon ile Ír min: Ír = [S] / (Kd + [S]) x (Ír <sub&gt; max - Ír dk) + Ír dk burada [S] sitozol içinde alt-tabaka konsantrasyonudur. Ír maksimum kullanma - belirli bir Ír da sensörün Ír dakika, elde edilen değeri, doygunluk (S) olarak hesaplanır S = (Ír - Ír dak) / (Ír max - Ír dakika) S, bundan başka aşağıdaki denklem kullanılarak substrat konsantrasyonu [S] dönüştürülebilir: S = [S] / (K d + [S]) Not: Alıcı ex Alıcı em kanalın yoğunluğu, aynı zamanda, deney durumu doğrudan akseptörünün floresan etkilenmiş olup olmadığını incelemek için çizilen olmalıdır. </li><li> Foto-beyazlatma için bir temel sürüklenme bakıldığında, bir temel düzeltme yapmak. Bunu yapmak için, zaman içinde verici ve alıcı arasında yoğunluklarını (Şekil 5A) arsa. Daha sonra th için kullanılan zaman noktalarında belirlenmesie taban, perfüzyon sisteminde gecikmesi ve belirli bir hücre (Şekil 5B) ve taşıma aktivitesi göre. </li><li> En temel açıklayan bir polinominal uydurma hesaplayın. Daha sonra, taban (Şekil 5C), her bir zaman noktasında elde edilen ham yoğunluğu normalleştirmek. Normalize donör ve alıcı şiddetleri gelen yoğunluk oranı (Donör ex Alıcı em / Donör ex Donör em) hesaplayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+hepatic+ammonia+metabolism:+the+intercellular+glutamine+cycle.">Regulation of hepatic ammonia metabolism: the intercellular glutamine cycle.</a> Adv Enzyme Regul. 25, 159-180 (1986).</li><li>Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+glutamine+metabolism.">Hepatic glutamine metabolism.</a> Beitr Infusionther Klin Ernahr. 17, 144-157 (1987).</li><li>Watford, M., Chellaraj, V., Ismat, A., Brown, P., Raman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+glutamine+metabolism.">Hepatic glutamine metabolism.</a> Nutrition. 18, 301-303 (2002).</li><li>Mustroph, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+translatomes+of+discrete+cell+populations+resolves+altered+cellular+priorities+during+hypoxia+in+Arabidopsis.">Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 18843-18848 (2009).</li><li>Sasagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quartz-Seq:+a+highly+reproducible+and+sensitive+single-cell+RNA+sequencing+method,+reveals+non-genetic+gene-expression+heterogeneity.">Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity.</a> Genome Biol. 14, R31 (2013).</li><li>Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+cycle+of+Ca(2+)+ions+in+dendritic+spines.">The life cycle of Ca(2+) ions in dendritic spines.</a> Neuron. 33, 439-452 (2002).</li><li>Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+with+fluorescent+biosensors.">Quantitative imaging with fluorescent biosensors.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).</li><li>Newman, R. H., Fosbrink, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encodable+fluorescent+biosensors+for+tracking+signaling+dynamics+in+living+cells.">Genetically encodable fluorescent biosensors for tracking signaling dynamics in living cells.</a> Chemical reviews. , 111-3666 (2011).</li><li>Okumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+approach+for+monitoring+cellular+metabolites+and+ions+using+genetically+encoded+biosensors.">Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors.</a> Curr Opin Biotech. 21, 45-54 (2010).</li><li>Gruenwald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+glutamine+transporter+activities+in+living+cells+using+genetically+encoded+glutamine+sensors.">Visualization of glutamine transporter activities in living cells using genetically encoded glutamine sensors.</a> PLoS One. 7, e38591 (2012).</li><li>Chaudhuri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protonophore-+and+pH-insensitive+glucose+and+sucrose+accumulation+detected+by+FRET+nanosensors+in+Arabidopsis+root+tips.">Protonophore- and pH-insensitive glucose and sucrose accumulation detected by FRET nanosensors in Arabidopsis root tips.</a> Plant Journal. 56, 948-962 (2008).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499, 295-300 (2013).</li><li>Jiang, D. W., Zhao, L. L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+RNAi+Screen+Identifies+Letm1+as+a+Mitochondrial+Ca2+/H++Antiporter.">Genome-Wide RNAi Screen Identifies Letm1 as a Mitochondrial Ca2+/H+ Antiporter.</a> Science. , 326-147 (2009).</li><li>Barnett, N. L., Pow, D. V., Robinson, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Muller+cell+glutamine+synthetase+rapidly+impairs+the+retinal+response+to+light.">Inhibition of Muller cell glutamine synthetase rapidly impairs the retinal response to light.</a> Glia. 30, 64-73 (2000).</li><li>Rothstein, J. D., Tabakoff, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+Striatal+Glutamate+Release+after+Glutamine-Synthetase+Inhibition.">Alteration of Striatal Glutamate Release after Glutamine-Synthetase Inhibition.</a> J Neurochem. 43, 1438-1446 (1984).</li><li>Gu, S., Villegas, C. J., Jiang, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+amino+acid+transporter+SNAT3+by+insulin+in+hepatocytes.">Differential regulation of amino acid transporter SNAT3 by insulin in hepatocytes.</a> J Biol Chem. 280, 26055-26062 (2005).</li><li>Palmada, M., Speil, A., Jeyaraj, S., Bohmer, C., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serine/threonine+kinases+SGK1,+3+and+PKB+stimulate+the+amino+acid+transporter+ASCT2.">The serine/threonine kinases SGK1, 3 and PKB stimulate the amino acid transporter ASCT2.</a> Biochem Bioph Res Co. 331, 272-277 (2005).</li><li>Br&#246;er, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+astroglial+ASCT2+amino+acid+transporter+as+a+mediator+of+glutamine+efflux.">The astroglial ASCT2 amino acid transporter as a mediator of glutamine efflux.</a> J Neurochem. 73, 2184-2194 (1999).</li><li>Wallace, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-spike+detection+in+vitro+and+in+vivo+with+a+genetic+Ca2++sensor.">Single-spike detection in vitro and in vivo with a genetic Ca2+ sensor.</a> Nature. 5, 797-804 (2008).</li><li>Haugh, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+fluorescence+microscopy+with+molecular+biosensors:+what+are+we+really+measuring.">Live-cell fluorescence microscopy with molecular biosensors: what are we really measuring.</a> Biophys J. 102, 2003-2011 (2012).</li><li>San Martin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+FRET+lactate+sensor+and+its+use+to+detect+the+Warburg+effect+in+single+cancer+cells.">A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells.</a> PLoS One. 8, e57712 (2013).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators.">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat Protoc. 1, 1057-1065 (2006).</li><li>Ponsioen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+cAMP-induced+Epac+activation+by+fluorescence+resonance+energy+transfer:+Epac+as+a+novel+cAMP+indicator.">Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator.</a> Embo Rep. 5, 1176-1180 (2004).</li><li>Joseph, J., Seervi, M., Sobhan, P. K., Retnabai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+ratio+imaging+to+profile+caspase+activity:+potential+application+in+multiparameter+high+content+apoptosis+analysis+and+drug+screening.">High throughput ratio imaging to profile caspase activity: potential application in multiparameter high content apoptosis analysis and drug screening.</a> PLoS One. 6, e20114 (2011).</li><li>Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+identifies+Letm1+as+a+mitochondrial+Ca2+/H++antiporter.">Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter.</a> Science. 326, 144-147 (2009).</li><li>Ma, H., Gibson, E. A., Dittmer, P. J., Jimenez, R., Palmer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+examination+of+fluorescence+resonance+energy+transfer-detected+metal-ion+response+in+mammalian+cells.">High-throughput examination of fluorescence resonance energy transfer-detected metal-ion response in mammalian cells.</a> J Am Chem Soc. 134, 2488-2491 (2012).</li></ol>

Ifşa hiçbir şey yok.

Görüntüleme deneylerin başarısı birkaç kritik faktöre bağlıdır. Bu faktörlerden biri yukarıda ele alındığı gibi, kullanılan sensörlerin eğilimidir. Ilgi konusu hücre içi bölme içindeki alt-tabakanın mutlak konsantrasyon, ancak, genellikle bilinmemektedir. Bu nedenle arzu edilen deneysel koşul altında en uygun olanı bulmak için kaydırılmış afinitelerle çoklu sensör denemenizi öneririz. Örneğin, bizim durumumuzda 1.5μ ile glutamin sensörleri ile transfekte edilmiş COS7 hücreleri, ...

Nedeniyle hücresel düzeyde transcriptome ve proteomun incelenmesini sağlar teknolojilerindeki olağanüstü ilerleme için, artık biyokimya ve metabolitleri ve iyonların çıkan akı yüksek hücre türüne özgü olduğu açık hale gelmiştir. Örneğin, memeli karaciğer, ardışık glutamin bozulması ve sentez ikinci 1-3 aşırı amonyak tüketirken eski bir hücre tipinde üre döngüsü amonyum besleme sırasıyla periportal hücreleri ve perivenöz hücreleri ile aynı anda gerçekleştirilmektedir. Bazı durumlarda, önemli biyokimyasal heterojenite da tek bir &quot;hücre tipi&quot; 4, 5 içinde tespit edilir. Mekansal özgüllük ek olarak, metabolitlerin ve iyonların hücre seviyeleri (örneğin, Ca 2 + ve siklik nükleotidler gibi sinyal molekülleri, örneğin) son derece dinamiktir. Metabolitleri ve iyonların zamanmekansal desenler genellikle sinyal iletiminde kritik roller oynamaktadır. Mmetabolitleri ve iyonların hücre dinamikleri ZLEME Ancak, eşsiz bir meydan okuma oluşturmaktadır. Birçok durumda konsantrasyonlarda değişim hızlı ve geçici, örneğin dendritik dikenler 6 ~ 20 msn içinde azalır Ca 2 + gibi sinyal molekülleri durumunda ile örneklenmiştir. Buna ek olarak, hücreler içinde ve arasında biyokimyasal yolların bölmelere zor çıkarma ve sütun kromatografisi / kütle spektrometrisi teknikleri kullanılarak metabolitleri ve iyonların dinamiklerini ölçülmesini mümkün kılar. Biyolojik moleküllerin için genetik olarak kodlanmış sensörler artık yaygın nedeniyle deneyci kısa ömürlü ve / veya bölümlere moleküler dinamiklerini incelemek için izin verir yüksek uzaysal çözünürlüğü için kullanılır (7 gözden, 8). Bu genetik olarak kodlanmış sensörler kabaca iki kategoriye ayrılabilir; yoğunluk-tabanlı sensörler ve ratiometic sensörler. Yoğunluk bazlı sensörler tipik olarak bir bağlama alanı ve bir grip oluşmaktadırorescent proteini (FP) ve bağlama sahasına bağlama çözünen floresan yoğunluğunu değiştirir. Ratiometic sensörler, diğer taraftan çoğu zaman bir FRET çifti olarak işlev iki FP arasında koruyucu rezonans enerji transferi (FRET) yararlanmak. Bu sensörler bir bağlama alanı ve iki FP oluşur ve bağlayıcı çözünen iki FP arasında FRET etkinliğindeki değişim olmaktadır. Biyolojik olarak önemli metabolitleri ve iyonlar için sensörler çok sayıda son on 8, 9 geliştirilmiştir. Bu tür genetik olarak kodlanmış sensörler tarafından sunulan verici olasılığı biri daha önce hücresel düzeyde tespit etmek kolay değildi membran taşıma işlemlerinin yüksek çözünürlüklü analizi, bunların kullanılmasıdır. Genetik olarak kodlanmış sensörler, alt-tabaka özgüllüğü, pH bağımlılığı ve 10, 11 ve transport mekanizmalarını analizini kolaylaştırmak. Ayrıca, genetik res ile bir aradaRNAİ&#39;nin kütüphane model organizmalar için inşa ources gibi, genetik olarak kodlanmış sensörleri kullanarak yeni nakil işlemleri için genom-geniş arama yapmak artık mümkün. Gerçekten de, birden çok durumda 12, 13 daha önce karakterize taşıyıcıları keşfine genetik olarak kodlanmış sensor kurşun kullanımı. Son zamanlarda, bizim laboratuvar glutamin için FRET tabanlı sensör bir dizi geliştirdi. Biz hücresel glutamin düzeyleri gibi FRET glutamin sensörler 10 kullanılarak görüntülendi edilebilir olduğunu göstermiştir. Bu sensörler glnH arasında C-terminalleri (Şekil 1) bir bakteriyel glutamin bağlayıcı proteinin glnH içine sokulan bir FRET verici (mTFP1) ve bir alıcı FRET (venus) oluşur. Bu sensörlerin FRET etkinliği alıcı / verici yoğunluk oranının azalması ile sonuçlanan, glutamin bağlanması üzerine düşmektedir. Glutamin taşıma süreçlerinin ince düzenlenmesi gibi neurotransm gibi biyolojik süreçlerde önemliission 14, 15 ve karaciğer 1, 16, 17 üre döngüsünün bakımı. Burada geniş bir alan floresan mikroskop set-up kullanarak, glutamin için FRET sensörleri ile taşımacılık faaliyetlerini analiz yöntemi göstermektedir. Burada gösterilen deneylerin amacı, tek bir hücrede taşıyıcı aktivitelerini tespit etmek için ve bir geçici ifade taşıyıcı alt-tabaka özgüllüğü incelemektir.

<table><tbody><tr><td>Inverted fluorescent microscope</td><td>Olympus</td><td>IX81F-3-5</td><td>An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also be appropriate.</td></tr><tr><td>Excitation filter (mTFP1)</td><td>Omega Optical</td><td>3RD450-460</td><td>Band width 450-460 nm</td></tr><tr><td>Excitation filter (Venus)</td><td>Chroma</td><td>ET500/20</td><td>Band width 490-510 nm</td></tr><tr><td>Emission filter (mTFP1)</td><td>Chroma</td><td>HQ495/30m</td><td>Band width 475-505 nm</td></tr><tr><td>Emission filter (Venus)</td><td>Chroma</td><td>ET535/30m</td><td>Band width 520-550 nm</td></tr><tr><td>Dichroic mirror (FRET channels)</td><td>Chroma</td><td>470dcxr</td><td>Long pass, 470 nm cut off</td></tr><tr><td>Dichroic mirror (YFP channel)</td><td>Chroma</td><td>89002bs</td><td>Passes 445-490 nm, 510-560 nm, 590-680 nm</td></tr><tr><td>mCherry filter set</td><td>Chroma</td><td>49008</td><td>Excitation 540-580 nm, long pass dichroic with 585 nm cut off, emission filter 595-695 nm</td></tr><tr><td>Light source</td><td>Olympus</td><td>U-LH100L-3-5</td><td>LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended</td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Qimaging</td><td>Rolera-MGi EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>Apochromatic fluorescence objective</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfusion system, ValveBank II</td><td>AutoMate Scientific</td><td>[01-08]</td><td>Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work</td></tr><tr><td>Laminar-flow chambers</td><td>C&amp;amp;L Instruments</td><td>VC-MPC-TW</td><td>Other larminar-flow chambers would also work.</td></tr><tr><td>Chambered slide</td><td>Lab-Tek</td><td>154534</td><td>For open-chamber experiments</td></tr><tr><td>Perfusion pump</td><td>Thermo Scientific</td><td>74-046-12131</td><td>For open-chamber experiments</td></tr><tr><td>Software supporting ratiometric measurements</td><td>Intellegenent Imaging Innovation</td><td>Slidebook 5.5</td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow biosafety cabinet</td><td>ESCO</td><td>LA-3A2</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp CO&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-255-25</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s MEM (DMEM)</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Cosmic calf serum</td><td>Hyclone</td><td>SH3008703</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I)</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td>Used with Lipofectamine 2000</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine solution</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>25 mm circular glass cover slips</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-545-102</td><td>In case VC-MPC-TW is used</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td>Other transfection reagents can also be used.</td></tr><tr><td>Solution A (Hank&#039;s buffer)</td><td></td><td></td><td>9.7 g HANK salt (Sigma H1387), 0.35 g NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 5.96 g HEPES to 1 L, pH adjusted to 7.35 with NaOH</td></tr><tr><td>Solution B</td><td></td><td></td><td>Solution A + 0.04 mM Gln</td></tr><tr><td>Solution C</td><td></td><td></td><td>Solution A + 0.2 mM Gln</td></tr><tr><td>Solution D</td><td></td><td></td><td>Solution A + 1 mM Gln</td></tr><tr><td>Solution E</td><td></td><td></td><td>Solution A + 5 mM Gln</td></tr><tr><td>Solution F</td><td></td><td></td><td>Solution A + 5 mM Ala</td></tr></tbody></table>

glutamine flux imaging using genetically encoded sensors

Genetik olarak kodlanmış sensörler hücrealtı çözünürlükte biyolojik moleküllerin gerçek zamanlı izlenmesini sağlar. Biyolojik moleküller için bu tür sensörler muazzam çeşitliliği birçok laboratuvarda rutin kullanılan vazgeçilmez araçları haline bazıları, son 15 yıl içinde kullanılabilir hale geldi. Genetik olarak kodlanmış sensörlerin verici uygulamalarından biri hücresel nakil işlemleri araştıran bu sensörlerin kullanılmasıdır. Böyle kinetik ve zemin özgünlükleri gibi taşıyıcıların özellikleri taşımacılık faaliyetlerinin hücre tipi özel analizler için olanakları sağlayan, bir hücresel düzeyde incelenebilir. Bu yazıda, taşıyıcı dinamikleri bir örnek olarak genetik olarak kodlanmış glutamin sensörünü kullanarak görülebilir nasıl gösterecektir. Deneysel tasarım, deneysel ayarları teknik detayları ve post-deneysel analizler için hususlar ele alınacaktır.

Tipik zaman süreçli deneyler, Şekil 2 de temsil edilmiştir., Bu deneylerde, 8 mM (FLIPQTV3.0_8m, Şekil 2A ve 2B) ve 100 uM (FlipQTV3.0_100 μ C ve D) afinitelere sahip glutamin FRET sensörler ile birlikte ifade edildi COS7 hücreleri 10 zorunlu bir amino asit değiştirici ASCT2 18. Glutamin akını verici (mTFP1) ile alıcı (venus) (Şekil 2A ile 2C) arasındaki flüoresan yoğunluğu oranlarında değişik...

Watch this Scientific Journal Video about Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors at JoVE.com

Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

Bu makale FRET kullanarak canlı hücreler glutamin dinamiklerini izlemek için nasıl gösterecektir. Genetik olarak kodlanmış sensörler hücrealtı çözünürlükte biyolojik moleküllerin gerçek zamanlı izlenmesini sağlar. Deneysel tasarım, deneysel ayarları teknik detayları ve post-deneysel analizler için düşünceler genetik olarak kodlanmış glutamin sensörler için ele alınacaktır.

Genetiği Kodlanmış Sensörleri kullanarak glutamin Akı Görüntüleme

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

glutamine-flux-imaging-using-genetically-encoded-sensors

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.5K Görüntüleme.  Virginia Tech.  Bu makale FRET kullanarak canlı hücreler glutamin dinamiklerini izlemek için nasıl gösterecektir. Genetik olarak kodlanmış sensörler hücrealtı çözünürlükte biyolojik moleküllerin gerçek zamanlı izlenmesini sağlar. Deneysel tasarım, deneysel ayarları teknik detayları ve post-deneysel analizler için düşünceler genetik olarak kodlanmış glutamin sensörler için ele alınacaktır. 

Video: Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including destruction of the sample, introduction of potential artifacts, and a lack of specificity for the reactive species involved. Thus, there is a current need in the field of toxicology for non-destructive, sensitive, and specific methods that can be used to observe and quantify intracellular redox perturbations, more commonly referred to as oxidative stress. Here, we present a method for the use of two genetically-encoded fluorogenic sensors, roGFP2 and HyPer, to be used in live-cell imaging studies to observe xenobiotic-induced oxidative responses. roGFP2 equilibrates with the glutathione redox potential (EGSH), while HyPer directly detects hydrogen peroxide (H2O2). Both sensors can be expressed into various cell types via transfection or transduction, and can be targeted to specific cellular compartments. Most importantly, live-cell microscopy using these sensors offers high spatial and temporal resolution that is not possible using conventional methods. Changes in the fluorescence intensity monitored at 510 nm serves as the readout for both genetically-encoded fluorogenic sensors when sequentially excited by 404 nm and 488 nm light. This property makes both sensors ratiometric, eliminating common microscopy artifacts and correcting for differences in sensor expression between cells. This methodology can be applied across a variety of fluorometric platforms capable of exciting and collecting emissions at the prescribed wavelengths, making it suitable for use with confocal imaging systems, conventional wide-field microscopy, and plate readers. Both genetically-encoded fluorogenic sensors have been used in a variety of cell types and toxicological studies to monitor cellular EGSH and H2O2 generation in real-time. Outlined here is a standardized method that is widely adaptable across cell types and fluorometric platforms for the application of roGFP2 and HyPer in live-cell toxicological assessments of oxidative stress.

This manuscript describes the use of genetically-encoded fluorogenic reporters in an application of live-cell imaging for the examination of xenobiotic-induced oxidative stress. This experimental approach offers unparalleled spatiotemporal resolution, sensitivity, and specificity while avoiding many of the shortcomings of conventional methods used for the detection of toxicological oxidative stress.

Genetik olarak kodlanmış Fluorogenic sensörleri kullanarak toksikolojik oksidatif stres ilişkin Değerlendirmeler yaklaşımlar görüntüleme

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

Kanser Araştırmaları

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be validated for predictive purposes. Ideally such systems would be low volume, which precludes sampling and destructive analyses when time course data are to be obtained. What is needed is an in situ monitoring tool which can report the necessary information in real-time and noninvasively. An interesting option is the use of fluorescent, protein-based in vivo biological sensors as reporters of intracellular concentrations. One particular class of in vivo biosensors that has found applications in metabolite quantification is based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorescent proteins connected by a ligand binding domain. FRET integrated biological sensors (FIBS) are constitutively produced within the cell line, they have fast response times and their spectral characteristics change based on the concentration of metabolite within the cell. In this paper, the method for constructing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines that constitutively express a FIBS for glucose and glutamine and calibrating the FIBS in vivo in batch cell culture in order to enable future quantification of intracellular metabolite concentration is described. Data from fed-batch CHO cell cultures demonstrates that the FIBS was able in each case to detect the resulting change in the intracellular concentration. Using the fluorescent signal from the FIBS and the previously constructed calibration curve, the intracellular concentration was accurately determined as confirmed by an independent enzymatic assay.

A description of how to calibrate F&#246;rster Resonance Energy Transfer integrated biological sensors (FIBS) for in situ metabolic profiling is presented.&#160;The FIBS can be used to measure intracellular levels of metabolites noninvasively aiding in the development of metabolic models and high throughput screening of bioprocess conditions.

Noninvaziv metabolik profil FIBS etkin

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Biyomühendislik

Visualizing Cellular Gibberellin Levels Using the nlsGPS1 F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) Biosensor

The phytohormone gibberellin (GA) is a small, mobile signaling molecule that plays a key role in seed germination, cellular elongation, and developmental transitions in plants. Gibberellin Perception Sensor 1 (GPS1) is the first F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)-based biosensor that allows monitoring of cellular GA levels in vivo. By measuring a fluorescence emission ratio of nuclear localized-GPS1 (nlsGPS1), spatiotemporal mapping of endogenously and exogenously supplied GA gradients in different tissue types is feasible at a cellular scale. This protocol will describe how to image nlsGPS1 emission ratios in three example experiments: steady-state, before-and-after exogenous gibberellin A4 (GA4) treatments, and over a treatment time-course. We also provide methods to analyze nlsGPS1 emission ratios using both Fiji and a commercial three-dimensional (3-D) micrograph visualization and analysis software and explain the limitations and likely pitfalls of using nlsGPS1 to quantify gibberellin levels.

Gibberellin Perception Sensor 1 (GPS1) is the first F&#246;rster resonance energy transfer-based biosensor for measuring the cellular levels of gibberellin phytohormones with a high spatiotemporal resolution. This protocol reports on the method to visualize and quantify cellular gibberellin levels using the genetically encoded nlsGPS1 biosensor in Arabidopsis hypocotyls and root tips.

NlsGPS1 Förster rezonans enerji kullanarak görüntülenmesi hücresel Giberellin düzeyleri (FRET) biyoalgılayıcı aktarma

The phytohormone gibberellin (GA) is a small, mobile signaling molecule that plays a key role in seed germination, cellular elongation, and developmental ...

Gelişim Biyolojisi

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Akış Sitometri Plazma Membran GLUT4 Translokasyon Kantitatif Ölçüm

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Biyoloji

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

Bioluminescent Kalsiyum Göstergesi GFP-aequorin dayanarak Vivo Fonksiyonel Beyin Görüntüleme Yaklaşım

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Nörobilim

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

Floresan ile yüksek verim Tarama ve Biyoalgılayıcı C. elegans Suşlarının

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR malfunction, expressed as either over- or under-activity caused by mutations, altered expression, trafficking, or localization, can contribute to numerous diseases, especially in the central nervous system. Therefore, understanding the receptor&#39;s biology as well as facilitating the discovery of compounds and small molecules is crucial in ongoing efforts to combat neurological diseases. Current approaches to studying the receptor have limitations including low throughput, high cost, and the inability to study its functional abilities due to the necessary presence of channel blockers to prevent NMDAR-mediated excitotoxicity. Additionally, the existing assay systems are sensitive to stimulation by glutamate only and lack sensitivity to stimulation by glycine, the other co-ligand of the NMDAR. Here, we present the first plate-based assay with high-throughput power to study an NMDA receptor with sensitivity to both co-ligands, glutamate and D-serine/glycine. This approach allows the study of different NMDAR subunit compositions and allows functional studies of the receptor in glycine- and/or glutamate-sensitive modes. Additionally, the method does not require the presence of inhibitors during measurements. The effects of positive and negative allosteric modulators can be detected with this assay and the known pharmacology of NMDAR has been replicated in our system. This technique overcomes the limitations of existing methods and is cost-effective. We believe that this novel technique will accelerate the discovery of therapies for NMDAR-mediated pathologies.

The goal of this protocol is to facilitate the study of NMDA-receptors (NMDAR) at a larger scale and allow the examination of modulatory effects of small molecules and their therapeutic applications.

NMDA reseptörleri glisin/D-serin ve glutamat duyarlılık ile çalışmak için bir yüksek-den geçerek kalsiyum-flux tahlil

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical manifestations include weight loss, dyslipidemia, and hypermetabolism; however, it remains unclear how these relate to motor neuron degeneration. Using a Drosophila model of TDP-43 proteinopathy that recapitulates several features of ALS including cytoplasmic inclusions, locomotor dysfunction, and reduced lifespan, we recently identified broad ranging metabolic deficits. Among these, glycolysis was found to be upregulated and genetic interaction experiments provided evidence for a compensatory neuroprotective mechanism. Indeed, despite upregulation of phosphofructokinase, the rate limiting enzyme in glycolysis, an increase in glycolysis using dietary and genetic manipulations was shown to mitigate locomotor dysfunction and increased lifespan in fly models of TDP-43 proteinopathy. To further investigate the effect on TDP-43 proteinopathy on glycolytic flux in motor neurons, a previously reported genetically encoded, FRET-based sensor, FLII12Pglu-700&#181;&#948;6, was used. This sensor is comprised of a bacterial glucose-sensing domain and cyan and yellow fluorescent proteins as the FRET pair. Upon glucose binding, the sensor undergoes a conformational change allowing FRET to occur. Using FLII12Pglu-700&#181;&#948;6, glucose uptake was found to be significantly increased in motor neurons expressing TDP-43G298S, an ALS causing variant. Here, we show how to measure glucose uptake, ex vivo, in larval ventral nerve cord preparations expressing the glucose sensor FLII12Pglu-700&#181;&#948;6 in the context of TDP-43 proteinopathy. This approach can be used to measure glucose uptake and assess glycolytic flux in different cell types or in the context of various mutations causing ALS and related neurodegenerative disorders.

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Glucose uptake is increased in Drosophila motor neurons affected by TAR DNA binding protein (TDP-43) proteinopathy, as indicated by a FRET-based, genetically encoded glucose sensor.

TDP-43 Proteinopatisinin Drosophila Modellerinde Glikoz Alımının Ölçülmesi

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical ...

Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant thiol-disulfide redox buffer glutathione is considered a central player in antioxidant defenses. Therefore, measuring the mitochondrial glutathione redox potential provides useful information about mitochondrial redox status and oxidative stress. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) is a genetically encoded, green fluorescent protein (GFP)-based ratiometric indicator of the glutathione redox potential that has two redox-state-sensitive excitation peaks at 400 nm and 490 nm with a single emission peak at 510 nm. This article describes how to perform confocal live microscopy of mitochondria-targeted Grx1-roGFP2 in primary hippocampal and cortical neurons. It describes how to assess steady-state mitochondrial glutathione redox potential (e.g., to compare disease states or long-term treatments) and how to measure redox changes upon acute treatments (using the excitotoxic drug N-methyl-D-aspartate (NMDA) as an example). In addition, the article presents co-imaging of Grx1-roGFP2 and the mitochondrial membrane potential indicator, tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE), to demonstrate how Grx1-roGPF2 can be multiplexed with additional indicators for multiparametric analyses. This protocol provides a detailed description of how to (i) optimize confocal laser scanning microscope settings, (ii) apply drugs for stimulation followed by sensor calibration with diamide and dithiothreitol, and (iii) analyze data with ImageJ/FIJI.

This article describes a protocol to determine differences in basal redox state and redox responses to acute perturbations in primary hippocampal and cortical neurons using confocal live microscopy. The protocol can be applied to other cell types and microscopes with minimal modifications.

Primer Nöronlarda Mitokondriyal Glutatyon Redoksu Durumunun Oranmetrik Gösterge Kullanılarak Canlı Görüntülenmesi

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

Bir taranabilir<em&gt; İn Vivo</em&gt; Transjenik biyolojik olarak ışık veren kullanarak Mitokondriyal Modülatörleri için tahlil<em&gt; Caenorhabditis elegans</em