Bu çalışma NIH hibe 1R21NS064412, NSF hibe 1052048 ve Jeffress Memorial Trust hibe J-908 tarafından desteklenmiştir.

1.. Numune Hazırlama Not: Birçok durumda perfüzyon deneyleri sinir bozucu bir sorun haline, hangi hücrelerin önemli bir kısmını silsin. Poli-L-lizin ile tüm hücre hatları, kaplama, cam yüzeyler için kapak (yüzeye% 0.01 çözelti 1.0 ml/25 cm 2 eklemek gerekli değildir, ancak, hücre kültürü dereceli su ile iki kere yıkayın,&gt; 5 dakika inkübe edilir, ve kuru biyogüvenlik kabini) hücre yapışmasını artırır. Ayrıca, kullanılan hücre hattının biyogüvenlik düzeyi (BGS) farkında olmak ve yerel çevre, sağlık ve güvenlik ofisi tarafından onaylanan standart işletim prosedürü izleyin. Bu deneyde, COS7 hücreleri (bkz. Şekil 4) bağlı olarak düşük bir endojen glutamin taşıma aktivitesi için kullanılmıştır. <ol><li> Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) içinde% 70-80 konflüansa +% 10 kozmik buzağı serumu ve 100 U / ml penisilin / streptomisin, ya da 6-çukurlu kültür yerleştirilen steril 25 mm cam lamelleri ° &#39;de Tohum COS7 hücreleriçanak veya 8-iyi cam alt slaytlar. 37 ° C,% 5 CO2, 24 saat boyunca% 100 nemde inkübe edin. </li><li> Üreticinin protokolüne göre, DMEM +% 10 kozmik buzağı serumu (no antibiyotikler) için büyüme ortamı değiştirin. % 100 nemde 37 ° C,% 5 CO2 de O / N büyütün. </li><li> (CMV promotörü altında 10 FLIPQTV3.0 algılayıcı taşıma pcDNA3.1) glutamin sensör ve 10-50 ml serum içermeyen ortam (OPTI-MEM) mCherry-etiketli ASCT2 kodlayan 0,4 mg plasmid DNA&#39;nın her ekleyin ve hafifçe karıştırın. </li><li> 50 ml serumsuz ortam için transfeksiyon reaktifi 1 ml ilave edilir. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> DNA (adım 1.3) ve transfeksiyon ayıracı (adım 1.4) içeren iki çözüm karıştırın ve 20 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Yavaşça hücrelerin üstünde transfeksiyon reaktifi ekleyin ve bölmeyi sallanan ile yavaşça karıştırın. 37 ° C,% 5 CO2,% 100 nemde 24 saat boyunca inkübe edin. </li><li> 24 saat sonra, DMEM +% 10 Cosmic Buzağı Serumu için orta alışverişiPenisilin / streptomisin (CCS) + 100 birim. </li><li> Hücreler 48-72 saat sonrası transfeksiyonunu görüntülenmiş. </li></ol> 2.. Perfüzyon Deney Not: Bu deneyde kullanılan COS7 hücreleri için, ortam perfüzyon ve oda sıcaklığında tutuldu ve ortam CO2 konsantrasyonu edilmiştir. Kullanılan hücreler, yüksek sıcaklık ve CO2 konsantrasyonu kontrol hayatta kalmak için, ısıtılmış mikroskop sahne ve / veya çevresel bir odayı gerektirir, ancak, kullanılmalıdır. <ol><li> Perfüzyon tampon AF hazırlayın (Malzeme Listesi). , 50 ml şırınga stopcocks takın stopcocks kapatın perfüzyon çözümleri ile doldurun. Tampon ile vana baş boşluğu doldurmak için kısa bir süre için musluğunu açın. </li><li> Bir perfüzyon kalem ile 8-kanal, yerçekimi beslemeli perfüzyon sistemine geçin ve sonra İşlev Seç seçeneğinin altında &quot;Manual Mode&quot; seçeneğini seçin. Perfüzyon kalem altında bir atık kabı yerleştirin. </li><li> El ileilgili sayılara basarak bağlantı noktalarını etkinleştirmek ve su içeren 10 ml şırınga kullanarak borulama doldurun ve ardından bağlantı noktasını kapatın. Bağlantı noktaları su ile doldurulur sonra, perfüzyon sisteminin bağlantı 1-6 tampon AF içeren şırıngalar ayarlayın ve sonra stopcocks açın. Tamponlar ile boru içinde su yerine tekrar bağlantı noktalarını açın. Akış hızı yaklaşık 0.8 ml / min. </li><li> Geri tuşuna basın &quot;İşlev Seç&quot; menüsüne gitmek için perfüzyon denetleyici kez iptal. &quot;Düzenleme Programı&quot; seçeneğine geçiş, daha sonra perfüzyon protokol Tablo 1&#39;de belirtilmiştir yazın. Perfüzyon programı kaydedin. </li><li> Kuluçka hücrelerini almak. Perfüzyon tamponu ile iki kez yıkanır ve daha sonra sahnede hücreleri ayarlayın. Bölmeye perfüzyon sistemine bağlayın. Açık bir bölme kullanılırsa, odasından perfüzyon çözeltisi kaldıran bir pompayı ayarlamak. </li><li> Slidebook yazılımını açın. Yeni bir slayt başlatın. Not:Aşağıdaki prosedür, Slidebook yazılımına özeldir, ancak bu MetaFluor ve Nis&#39;te öğeli gibi diğer yazılım aynı zamanda burada tarif edilen görüntüleme türü için de kullanılabilir. Teorik deneyler zaman ders görüntüleme sağlayan herhangi bir yazılım kullanarak yapılabilir, ve görüntü dizileri gibi ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) ya da Fiji gibi yazılımları kullanarak post-deneysel analiz edilebilir (http:/ / fiji.sc / Fiji). Ancak, alıcı / verici oranının gerçek zamanlı izleme sağlayan bir yazılımdır son derece yararlıdır. </li><li> Floresan mikroskop sahneye slayt monte edin. Uygun filtre setleri kullanılarak sensör ve ASCT-mCherry birlikte sentezleyen hücreleri bulmak &quot;ODAK&quot; fonksiyonu altında (Malzeme listesi). &quot;Kamera&quot; sekmesini tıklayarak ve &quot;kazanç&quot; altında kaydırma çubuğunu kaydırarak kazanç ayarlayın. Ayrıca, nötr yoğunluk filtresi açılır menüden nötr yoğunluk filtresi ayarını. Not: Filtre küp göz filtresi içermiyorsa, shor beri göz parçaları kullanmayınt-dalga boyu uyarım ışık gözler için zararlıdır. Yerine hücreleri bulmak için bilgisayar ekranı kullanın. </li><li> Hücrelerin görüntülerini elde with donor ( mTFP1) ex donor(mTFP1) em , donor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em and acceptor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em m channels (Filtreler Malzeme Listesi&#39;nde belirtilen). &quot;Görüntü Yakalama&quot; tıklatın ve sonra satın alma penceresinde, kullanılan olacak olan filtreleri belirtebilirsiniz. Sonraki filtre ayarları kutuya istenen pozlama süresini yazarak pozlama süresini ayarlamak için &quot;TEST&quot; butonuna tıklayın. Not: Tüm üç kanalın aynı uzunluğu için açık olması gerekir. Görüntüleme parametrelerini ayarlarken, beklenen verimliliği FRET değişiklik almak ve dikkate artırmak kat: FRET verimliliği deney sırasında 2 kat gitmesi bekleniyor ise, örneğin, görüntüleme parametreleri ayarlanmalıdıro kanal deney sırasında doymuş olmaz bu yüzden dinlenme devlet Donör eski Akseptör em yoğunluğu, &lt;aracı ile kaydedilebilir maksimum değerin% 50 olmalıdır ki. Etiketlenmiş hücrelerden sinyal arka bölgede daha en az üç kat daha yüksek olmalıdır. </li><li> Yazılımda bölgeler aracı kullanılarak ilgi konusu bir bölge çizin. Alternatif olarak, belirli bir yoğunluk yukarıda piksel seçmek için bir yazılım fonksiyonu kullanılabilir ve daha sonra bölgeler dönüştürülür. Bunu yapmak için, Maske tıklayın - Segment, ardından istenen alanları vurgulamak için kayan çubuğu hareket ettirin. </li><li> Yakalama tipi kutusunda &quot;time lapse&quot; seçin, sonra aralığını (bu deneyde 10 sn) ve deney için zaman noktaları belirtin. </li><li> Herhangi bir floresan hücreleri olmadan bir alanda bir bölge çizin. Bu alan, arka plan çıkarma için kullanılır. Sağ çizilen bölgeyi tıklatın ve sonra bir arka plan olarak ayarlayın. Not: bir hayır vardır İdeal olarak, hücreleriSensörlerin ifade t otoflüoresanla ve kamera tarafından algılanan arka plan çiçeklenme hem de hesaba arka bölge olarak kullanılmalıdır. Böyle bir hücre, görüş alanında mevcut ise, hücrelerin olmadan en az bir bölge eşiğe hesaba katmak için kullanılmalıdır. </li><li> Seçenek - &quot;Run programları Select Function&quot; altında istediğiniz programı seçin. Kayıtlı program (adım 2.3) geliniz, ve sonra perfüzyon kumanda üzerindeki ENTER tuşuna basın. Şimdi program yüklü ve herhangi bir tuşa basarak perfüzyon başlayacaktır. </li><li> Perfüzyonu sağlamak ve görüntüleme deney perfüzyon denetleyici bir tuşa basarak aynı anda yakalama penceresinde &quot;Başlat&quot; düğmesini tıklayarak aynı anda başlayacak. Not: Bu çözümler (bu satın alma sekmesi içinde bulunan &quot;NOTLAR&quot; fonksiyonu kullanılarak yapılabilir) alışverişinde zaman noktası kaydetmek için tavsiye edilir. </li><li> Aynı perfüzyon protokol USI gerçekleştirinDeneysel koşullar altında doymuş veya ilişkisiz ya olması beklenen bir algılayıcı ifade eden hücreleri ng. Not: Burada, deneysel koşullar altında, doymuş FLIPQTV3.0_1.5μ, bir kontrol, Şekil 6 olarak kullanılan bu tür kontrol deneyleri FRET verim değişiklik olmayan alt-tabakanın gerçek değişim nedeniyle ve onaylamak için gereklidir. nedeniyle bu tür hücresel pH gibi diğer parametreleri değiştirmek için. </li></ol> 3. Post-deney Analizi <ol><li> Örnek sürüklenme deney sırasında meydana gelirse inceleyin. Faiz (ROI) Bölgeler Beraberlik timepoint 0 alınan görüntü üzerinde s, daha sonra görüntüleme penceresinin üst kısmında kayan çubuğu hareket ve hücreler deneyde sonra çekilen görüntülerde İB&#39;nin kalkmak olmadığını kontrol edin. </li><li> Evet, o Maskesini seçerek hücrelerinin etrafında maskeler oluşturarak, ilk olarak sürüklenme düzeltmek için izleme fonksiyonunu kullanırsanız - Segment, sonra HIG için cutoff belirten hattını kaydırınbölgeler hücreleri içeren hlight. Maskesini tıklayarak bölgeleri takip - Partikül izleme - Temel parçacık izleme. </li><li> Gerektiğinde ROI&#39;ler yeniden çizmek ve arka plan bölgesi. </li><li> Deney boyunca İB&#39;nin ortalama yoğunluğu aktarın. İstatistikler tıklayın - İhracat - Oran / timelapse veri. </li><li> Substrat konsantrasyon FRET verimliliği ve ölçülmesi gerekli değildir iken, alt tabakanın dinamiklerinin bir vekil olarak yoğunluk oranı (Donör ex Alıcı em / Donör ex Donör em) zaman ders arsa. Sitosolik konsantrasyonunu belirlemek için, maksimal ve (sırasıyla substratın doyurma ve yokluğunda da, yani,) minimum bir değişim oranı, Ír max hesaplamak - aşağıdaki denkleme Δratio (Ír) doğrusal olmayan regresyon ile Ír min: Ír = [S] / (Kd + [S]) x (Ír <sub&gt; max - Ír dk) + Ír dk burada [S] sitozol içinde alt-tabaka konsantrasyonudur. Ír maksimum kullanma - belirli bir Ír da sensörün Ír dakika, elde edilen değeri, doygunluk (S) olarak hesaplanır S = (Ír - Ír dak) / (Ír max - Ír dakika) S, bundan başka aşağıdaki denklem kullanılarak substrat konsantrasyonu [S] dönüştürülebilir: S = [S] / (K d + [S]) Not: Alıcı ex Alıcı em kanalın yoğunluğu, aynı zamanda, deney durumu doğrudan akseptörünün floresan etkilenmiş olup olmadığını incelemek için çizilen olmalıdır. </li><li> Foto-beyazlatma için bir temel sürüklenme bakıldığında, bir temel düzeltme yapmak. Bunu yapmak için, zaman içinde verici ve alıcı arasında yoğunluklarını (Şekil 5A) arsa. Daha sonra th için kullanılan zaman noktalarında belirlenmesie taban, perfüzyon sisteminde gecikmesi ve belirli bir hücre (Şekil 5B) ve taşıma aktivitesi göre. </li><li> En temel açıklayan bir polinominal uydurma hesaplayın. Daha sonra, taban (Şekil 5C), her bir zaman noktasında elde edilen ham yoğunluğu normalleştirmek. Normalize donör ve alıcı şiddetleri gelen yoğunluk oranı (Donör ex Alıcı em / Donör ex Donör em) hesaplayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+hepatic+ammonia+metabolism:+the+intercellular+glutamine+cycle.">Regulation of hepatic ammonia metabolism: the intercellular glutamine cycle.</a> Adv Enzyme Regul. 25, 159-180 (1986).</li><li>Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+glutamine+metabolism.">Hepatic glutamine metabolism.</a> Beitr Infusionther Klin Ernahr. 17, 144-157 (1987).</li><li>Watford, M., Chellaraj, V., Ismat, A., Brown, P., Raman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+glutamine+metabolism.">Hepatic glutamine metabolism.</a> Nutrition. 18, 301-303 (2002).</li><li>Mustroph, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+translatomes+of+discrete+cell+populations+resolves+altered+cellular+priorities+during+hypoxia+in+Arabidopsis.">Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 18843-18848 (2009).</li><li>Sasagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quartz-Seq:+a+highly+reproducible+and+sensitive+single-cell+RNA+sequencing+method,+reveals+non-genetic+gene-expression+heterogeneity.">Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity.</a> Genome Biol. 14, R31 (2013).</li><li>Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+cycle+of+Ca(2+)+ions+in+dendritic+spines.">The life cycle of Ca(2+) ions in dendritic spines.</a> Neuron. 33, 439-452 (2002).</li><li>Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+with+fluorescent+biosensors.">Quantitative imaging with fluorescent biosensors.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).</li><li>Newman, R. H., Fosbrink, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encodable+fluorescent+biosensors+for+tracking+signaling+dynamics+in+living+cells.">Genetically encodable fluorescent biosensors for tracking signaling dynamics in living cells.</a> Chemical reviews. , 111-3666 (2011).</li><li>Okumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+approach+for+monitoring+cellular+metabolites+and+ions+using+genetically+encoded+biosensors.">Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors.</a> Curr Opin Biotech. 21, 45-54 (2010).</li><li>Gruenwald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+glutamine+transporter+activities+in+living+cells+using+genetically+encoded+glutamine+sensors.">Visualization of glutamine transporter activities in living cells using genetically encoded glutamine sensors.</a> PLoS One. 7, e38591 (2012).</li><li>Chaudhuri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protonophore-+and+pH-insensitive+glucose+and+sucrose+accumulation+detected+by+FRET+nanosensors+in+Arabidopsis+root+tips.">Protonophore- and pH-insensitive glucose and sucrose accumulation detected by FRET nanosensors in Arabidopsis root tips.</a> Plant Journal. 56, 948-962 (2008).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499, 295-300 (2013).</li><li>Jiang, D. W., Zhao, L. L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+RNAi+Screen+Identifies+Letm1+as+a+Mitochondrial+Ca2+/H++Antiporter.">Genome-Wide RNAi Screen Identifies Letm1 as a Mitochondrial Ca2+/H+ Antiporter.</a> Science. , 326-147 (2009).</li><li>Barnett, N. L., Pow, D. V., Robinson, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Muller+cell+glutamine+synthetase+rapidly+impairs+the+retinal+response+to+light.">Inhibition of Muller cell glutamine synthetase rapidly impairs the retinal response to light.</a> Glia. 30, 64-73 (2000).</li><li>Rothstein, J. D., Tabakoff, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+Striatal+Glutamate+Release+after+Glutamine-Synthetase+Inhibition.">Alteration of Striatal Glutamate Release after Glutamine-Synthetase Inhibition.</a> J Neurochem. 43, 1438-1446 (1984).</li><li>Gu, S., Villegas, C. J., Jiang, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+amino+acid+transporter+SNAT3+by+insulin+in+hepatocytes.">Differential regulation of amino acid transporter SNAT3 by insulin in hepatocytes.</a> J Biol Chem. 280, 26055-26062 (2005).</li><li>Palmada, M., Speil, A., Jeyaraj, S., Bohmer, C., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serine/threonine+kinases+SGK1,+3+and+PKB+stimulate+the+amino+acid+transporter+ASCT2.">The serine/threonine kinases SGK1, 3 and PKB stimulate the amino acid transporter ASCT2.</a> Biochem Bioph Res Co. 331, 272-277 (2005).</li><li>Br&#246;er, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+astroglial+ASCT2+amino+acid+transporter+as+a+mediator+of+glutamine+efflux.">The astroglial ASCT2 amino acid transporter as a mediator of glutamine efflux.</a> J Neurochem. 73, 2184-2194 (1999).</li><li>Wallace, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-spike+detection+in+vitro+and+in+vivo+with+a+genetic+Ca2++sensor.">Single-spike detection in vitro and in vivo with a genetic Ca2+ sensor.</a> Nature. 5, 797-804 (2008).</li><li>Haugh, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+fluorescence+microscopy+with+molecular+biosensors:+what+are+we+really+measuring.">Live-cell fluorescence microscopy with molecular biosensors: what are we really measuring.</a> Biophys J. 102, 2003-2011 (2012).</li><li>San Martin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+FRET+lactate+sensor+and+its+use+to+detect+the+Warburg+effect+in+single+cancer+cells.">A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells.</a> PLoS One. 8, e57712 (2013).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators.">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat Protoc. 1, 1057-1065 (2006).</li><li>Ponsioen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+cAMP-induced+Epac+activation+by+fluorescence+resonance+energy+transfer:+Epac+as+a+novel+cAMP+indicator.">Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator.</a> Embo Rep. 5, 1176-1180 (2004).</li><li>Joseph, J., Seervi, M., Sobhan, P. K., Retnabai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+ratio+imaging+to+profile+caspase+activity:+potential+application+in+multiparameter+high+content+apoptosis+analysis+and+drug+screening.">High throughput ratio imaging to profile caspase activity: potential application in multiparameter high content apoptosis analysis and drug screening.</a> PLoS One. 6, e20114 (2011).</li><li>Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+identifies+Letm1+as+a+mitochondrial+Ca2+/H++antiporter.">Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter.</a> Science. 326, 144-147 (2009).</li><li>Ma, H., Gibson, E. A., Dittmer, P. J., Jimenez, R., Palmer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+examination+of+fluorescence+resonance+energy+transfer-detected+metal-ion+response+in+mammalian+cells.">High-throughput examination of fluorescence resonance energy transfer-detected metal-ion response in mammalian cells.</a> J Am Chem Soc. 134, 2488-2491 (2012).</li></ol>

Ifşa hiçbir şey yok.

Görüntüleme deneylerin başarısı birkaç kritik faktöre bağlıdır. Bu faktörlerden biri yukarıda ele alındığı gibi, kullanılan sensörlerin eğilimidir. Ilgi konusu hücre içi bölme içindeki alt-tabakanın mutlak konsantrasyon, ancak, genellikle bilinmemektedir. Bu nedenle arzu edilen deneysel koşul altında en uygun olanı bulmak için kaydırılmış afinitelerle çoklu sensör denemenizi öneririz. Örneğin, bizim durumumuzda 1.5μ ile glutamin sensörleri ile transfekte edilmiş COS7 hücreleri, ...

Nedeniyle hücresel düzeyde transcriptome ve proteomun incelenmesini sağlar teknolojilerindeki olağanüstü ilerleme için, artık biyokimya ve metabolitleri ve iyonların çıkan akı yüksek hücre türüne özgü olduğu açık hale gelmiştir. Örneğin, memeli karaciğer, ardışık glutamin bozulması ve sentez ikinci 1-3 aşırı amonyak tüketirken eski bir hücre tipinde üre döngüsü amonyum besleme sırasıyla periportal hücreleri ve perivenöz hücreleri ile aynı anda gerçekleştirilmektedir. Bazı durumlarda, önemli biyokimyasal heterojenite da tek bir &quot;hücre tipi&quot; 4, 5 içinde tespit edilir. Mekansal özgüllük ek olarak, metabolitlerin ve iyonların hücre seviyeleri (örneğin, Ca 2 + ve siklik nükleotidler gibi sinyal molekülleri, örneğin) son derece dinamiktir. Metabolitleri ve iyonların zamanmekansal desenler genellikle sinyal iletiminde kritik roller oynamaktadır. Mmetabolitleri ve iyonların hücre dinamikleri ZLEME Ancak, eşsiz bir meydan okuma oluşturmaktadır. Birçok durumda konsantrasyonlarda değişim hızlı ve geçici, örneğin dendritik dikenler 6 ~ 20 msn içinde azalır Ca 2 + gibi sinyal molekülleri durumunda ile örneklenmiştir. Buna ek olarak, hücreler içinde ve arasında biyokimyasal yolların bölmelere zor çıkarma ve sütun kromatografisi / kütle spektrometrisi teknikleri kullanılarak metabolitleri ve iyonların dinamiklerini ölçülmesini mümkün kılar. Biyolojik moleküllerin için genetik olarak kodlanmış sensörler artık yaygın nedeniyle deneyci kısa ömürlü ve / veya bölümlere moleküler dinamiklerini incelemek için izin verir yüksek uzaysal çözünürlüğü için kullanılır (7 gözden, 8). Bu genetik olarak kodlanmış sensörler kabaca iki kategoriye ayrılabilir; yoğunluk-tabanlı sensörler ve ratiometic sensörler. Yoğunluk bazlı sensörler tipik olarak bir bağlama alanı ve bir grip oluşmaktadırorescent proteini (FP) ve bağlama sahasına bağlama çözünen floresan yoğunluğunu değiştirir. Ratiometic sensörler, diğer taraftan çoğu zaman bir FRET çifti olarak işlev iki FP arasında koruyucu rezonans enerji transferi (FRET) yararlanmak. Bu sensörler bir bağlama alanı ve iki FP oluşur ve bağlayıcı çözünen iki FP arasında FRET etkinliğindeki değişim olmaktadır. Biyolojik olarak önemli metabolitleri ve iyonlar için sensörler çok sayıda son on 8, 9 geliştirilmiştir. Bu tür genetik olarak kodlanmış sensörler tarafından sunulan verici olasılığı biri daha önce hücresel düzeyde tespit etmek kolay değildi membran taşıma işlemlerinin yüksek çözünürlüklü analizi, bunların kullanılmasıdır. Genetik olarak kodlanmış sensörler, alt-tabaka özgüllüğü, pH bağımlılığı ve 10, 11 ve transport mekanizmalarını analizini kolaylaştırmak. Ayrıca, genetik res ile bir aradaRNAİ&#39;nin kütüphane model organizmalar için inşa ources gibi, genetik olarak kodlanmış sensörleri kullanarak yeni nakil işlemleri için genom-geniş arama yapmak artık mümkün. Gerçekten de, birden çok durumda 12, 13 daha önce karakterize taşıyıcıları keşfine genetik olarak kodlanmış sensor kurşun kullanımı. Son zamanlarda, bizim laboratuvar glutamin için FRET tabanlı sensör bir dizi geliştirdi. Biz hücresel glutamin düzeyleri gibi FRET glutamin sensörler 10 kullanılarak görüntülendi edilebilir olduğunu göstermiştir. Bu sensörler glnH arasında C-terminalleri (Şekil 1) bir bakteriyel glutamin bağlayıcı proteinin glnH içine sokulan bir FRET verici (mTFP1) ve bir alıcı FRET (venus) oluşur. Bu sensörlerin FRET etkinliği alıcı / verici yoğunluk oranının azalması ile sonuçlanan, glutamin bağlanması üzerine düşmektedir. Glutamin taşıma süreçlerinin ince düzenlenmesi gibi neurotransm gibi biyolojik süreçlerde önemliission 14, 15 ve karaciğer 1, 16, 17 üre döngüsünün bakımı. Burada geniş bir alan floresan mikroskop set-up kullanarak, glutamin için FRET sensörleri ile taşımacılık faaliyetlerini analiz yöntemi göstermektedir. Burada gösterilen deneylerin amacı, tek bir hücrede taşıyıcı aktivitelerini tespit etmek için ve bir geçici ifade taşıyıcı alt-tabaka özgüllüğü incelemektir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1129">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81F-3-5</td>
			<td>An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also appropriate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exitation filter (mTFP1)</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>3RD450-460</td>
			<td>band width 450-460 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exitation filter (Venus)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET500/20</td>
			<td>band width 490-510 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter (mTFP1)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ495/30m</td>
			<td>band width 475-505nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter (Venus)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET535/30m</td>
			<td>band width 520-550nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror (FRET channels)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>470dcxr</td>
			<td>long pass, 470nm cut off</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror (YFP channel)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>89002bs</td>
			<td>passes 445-490nm, 510-560nm, 590-680nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry filter set</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49008</td>
			<td>excitation 540-580nm, long pass dichroic with 585nm cut off, emission filter 595-695nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-LH100L-3-5</td>
			<td>LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>Rolera-MGi EMCCD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apochromatic fluorescence objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion system, ValveBank II</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>[01-08]</td>
			<td>Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar-flow chambers</td>
			<td>C&#38;L Instruments</td>
			<td>VC-MPC-TW</td>
			<td>Other larminar-flow chambers would also work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chambered slide</td>
			<td>Lab-Tek</td>
			<td>154534</td>
			<td>For open-chamber experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion pump</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>74-046-12131</td>
			<td>For open-chamber experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software supporting ratiometric measurements</td>
			<td>Intellegenent Imaging Innovation</td>
			<td>Slidebook 5.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow biosafety cabinet</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>LA-3A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-255-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s MEM (DMEM)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3008703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td>Used with Lipofectamine 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine solution</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mm circular glass cover slips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-545-102</td>
			<td>in case VC-MPC-TW is used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668027</td>
			<td>Other transfection reagents can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution A (Hank&#39;s buffer)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>9.7g HANK salt (Sigma H1387), 0.35g NaHCO3, 5.96g HEPES to 1L, pH adjusted to 7.35 with NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 0.04mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 0.2mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution D</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 1mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution E</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 5mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution F</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 5mM Ala</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glutamine flux imaging using genetically encoded sensors

Genetik olarak kodlanmış sensörler hücrealtı çözünürlükte biyolojik moleküllerin gerçek zamanlı izlenmesini sağlar. Biyolojik moleküller için bu tür sensörler muazzam çeşitliliği birçok laboratuvarda rutin kullanılan vazgeçilmez araçları haline bazıları, son 15 yıl içinde kullanılabilir hale geldi. Genetik olarak kodlanmış sensörlerin verici uygulamalarından biri hücresel nakil işlemleri araştıran bu sensörlerin kullanılmasıdır. Böyle kinetik ve zemin özgünlükleri gibi taşıyıcıların özellikleri taşımacılık faaliyetlerinin hücre tipi özel analizler için olanakları sağlayan, bir hücresel düzeyde incelenebilir. Bu yazıda, taşıyıcı dinamikleri bir örnek olarak genetik olarak kodlanmış glutamin sensörünü kullanarak görülebilir nasıl gösterecektir. Deneysel tasarım, deneysel ayarları teknik detayları ve post-deneysel analizler için hususlar ele alınacaktır.

Tipik zaman süreçli deneyler, Şekil 2 de temsil edilmiştir., Bu deneylerde, 8 mM (FLIPQTV3.0_8m, Şekil 2A ve 2B) ve 100 uM (FlipQTV3.0_100 μ C ve D) afinitelere sahip glutamin FRET sensörler ile birlikte ifade edildi COS7 hücreleri 10 zorunlu bir amino asit değiştirici ASCT2 18. Glutamin akını verici (mTFP1) ile alıcı (venus) (Şekil 2A ile 2C) arasındaki flüoresan yoğunluğu oranlarında değişik...

Watch this Scientific Journal Video about Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors at JoVE.com

Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

Bu makale FRET kullanarak canlı hücreler glutamin dinamiklerini izlemek için nasıl gösterecektir. Genetik olarak kodlanmış sensörler hücrealtı çözünürlükte biyolojik moleküllerin gerçek zamanlı izlenmesini sağlar. Deneysel tasarım, deneysel ayarları teknik detayları ve post-deneysel analizler için düşünceler genetik olarak kodlanmış glutamin sensörler için ele alınacaktır.

Genetiği Kodlanmış Sensörleri kullanarak glutamin Akı Görüntüleme

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

glutamine-flux-imaging-using-genetically-encoded-sensors

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.5K Görüntüleme.  Virginia Tech.  Bu makale FRET kullanarak canlı hücreler glutamin dinamiklerini izlemek için nasıl gösterecektir. Genetik olarak kodlanmış sensörler hücrealtı çözünürlükte biyolojik moleküllerin gerçek zamanlı izlenmesini sağlar. Deneysel tasarım, deneysel ayarları teknik detayları ve post-deneysel analizler için düşünceler genetik olarak kodlanmış glutamin sensörler için ele alınacaktır. 