PhaESC hatlarının türeyen dr. Giulio Di Minin'e ve akış sitometrisi operasyonu için Dr. Remo Freimann'a teşekkür ederiz. Ayrıca Bayan Michèle Schaffner ve Bay Thomas M. Hennek'i embriyo transferi konusunda teknik destek için kabul ediyoruz. Bu çalışma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (grant 31003A_152814/1) tarafından desteklendi.

<ol>
	<li>Ellegren, H., Galtier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+genetic+diversity.">Determinants of genetic diversity.</a> Nature Reviews: Genetics. 17 (7), 422-433 (2016).</li><li>Huijbers, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+genetically+modified+mice:+A+decision+guide.">Generating genetically modified mice: A decision guide.</a> Methods in Molecular Biology. 1642, 1-19 (2017).</li><li>Aizawa, E., Dumeau, C. E., Freimann, R., Di Minin, G., Wutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+of+semi-cloned+embryos+generated+from+parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells.">Polyploidy of semi-cloned embryos generated from parthenogenetic haploid embryonic stem cells.</a> PloS One. 15 (9), 0233072 (2020).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgenetic+haploid+embryonic+stem+cells+produce+live+transgenic+mice.">Androgenetic haploid embryonic stem cells produce live transgenic mice.</a> Nature. 490 (7420), 407-411 (2012).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+of+fertile+bimaternal+offspring+following+intracytoplasmic+injection+of+parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells.">Birth of fertile bimaternal offspring following intracytoplasmic injection of parthenogenetic haploid embryonic stem cells.</a> Cell Research. 26 (1), 135-138 (2016).</li><li>Wan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells+produce+fertile+mice.">Parthenogenetic haploid embryonic stem cells produce fertile mice.</a> Cell Research. 23 (11), 1330-1333 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+genetically+modified+mice+by+oocyte+injection+of+androgenetic+haploid+embryonic+stem+cells.">Generation of genetically modified mice by oocyte injection of androgenetic haploid embryonic stem cells.</a> Cell. 149 (3), 605-617 (2012).</li><li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells+efficiently+support+mouse+generation+by+oocyte+injection.">Parthenogenetic haploid embryonic stem cells efficiently support mouse generation by oocyte injection.</a> Cell Research. 26 (1), 131-134 (2016).</li><li>Elling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+and+reverse+genetics+through+derivation+of+haploid+mouse+embryonic+stem+cells.">Forward and reverse genetics through derivation of haploid mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (6), 563-574 (2011).</li><li>Leeb, M., Wutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+haploid+embryonic+stem+cells+from+mouse+embryos.">Derivation of haploid embryonic stem cells from mouse embryos.</a> Nature. 479 (7371), 131-134 (2011).</li><li>Surani, M. A., Barton, S. C., Norris, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+reconstituted+mouse+eggs+suggests+imprinting+of+the+genome+during+gametogenesis.">Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis.</a> Nature. 308 (5959), 548-550 (1984).</li><li>Li, Z. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+bimaternal+and+bipaternal+mice+from+hypomethylated+haploid+ESCs+with+imprinting+region+deletions.">Generation of bimaternal and bipaternal mice from hypomethylated haploid ESCs with imprinting region deletions.</a> Cell Stem Cell. 23 (5), 665-676 (2018).</li><li>Elling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+maintenance+of+mouse+haploid+embryonic+stem+cells.">Derivation and maintenance of mouse haploid embryonic stem cells.</a> Nature Protocols. 14 (7), 1991-2014 (2019).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Shuai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mammalian+offspring+by+haploid+embryonic+stem+cells+microinjection.">Generation of mammalian offspring by haploid embryonic stem cells microinjection.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 31, 1-15 (2014).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).</li><li>O'Neill, G. T., Rolfe, L. R., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+potential+and+chromosome+constitution+of+strontium-induced+mouse+parthenogenones.">Developmental potential and chromosome constitution of strontium-induced mouse parthenogenones.</a> Molecular Reproduction and Development. 30 (3), 214-219 (1991).</li><li>Campbell, K. H., McWhir, J., Ritchie, W. A., Wilmut, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sheep+cloned+by+nuclear+transfer+from+a+cultured+cell+line.">Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line.</a> Nature. 380 (6569), 64-66 (1996).</li><li>Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-term+development+of+mice+from+enucleated+oocytes+injected+with+cumulus+cell+nuclei.">Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei.</a> Nature. 394 (6691), 369-374 (1998).</li><li>Wilmut, I., Schnieke, A. E., McWhir, J., Kind, A. J., Campbell, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+offspring+derived+from+fetal+and+adult+mammalian+cells.">Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells.</a> Nature. 385 (6619), 810-813 (1997).</li><li>Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+frogs+derived+from+the+nuclei+of+single+somatic+cells.">Adult frogs derived from the nuclei of single somatic cells.</a> Developmental Biology. 4, 256-273 (1962).</li><li>Campbell, K. H., Alberio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+the+genome:+role+of+the+cell+cycle.">Reprogramming the genome: role of the cell cycle.</a> Reproduction Supplement. 61, 477-494 (2003).</li><li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-mediated+genetic+screening+in+mice+with+haploid+embryonic+stem+cells+carrying+a+guide+RNA+library.">CRISPR-Cas9-mediated genetic screening in mice with haploid embryonic stem cells carrying a guide RNA library.</a> Cell Stem Cell. 17 (2), 221-232 (2015).</li><li>Bai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genetic+screening+in+mice+through+haploid+embryonic+stem+cells+identifies+critical+genes+in+bone+development.">Targeted genetic screening in mice through haploid embryonic stem cells identifies critical genes in bone development.</a> PLoS Biology. 17 (7), 3000350 (2019).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-mediated+base-editing+screening+in+mice+identifies+DND1+amino+acids+that+are+critical+for+primordial+germ+cell+development.">CRISPR-Cas9-mediated base-editing screening in mice identifies DND1 amino acids that are critical for primordial germ cell development.</a> Nature Cell Biology. 20 (11), 1315-1325 (2018).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Memelilerin somatik hücre nükleer transferi (SCNT) ile klonlaması 1990'larda19,20,21'deöncü olmuştur. Bu gelişmeler amfibilerde 30 yıl önce yapılan klonlama çalışmalarının ardından22. Önemli gecikme, memelilerde embriyoloji ve genomik baskı zorliğini yansıtır. Memeli SCNT'nin gelişimi, bu protokolde ayrıntılı olarak açıklanan sperm yerine haESC uygulamasının temelidir.
Hücre döngüsü senkronizasyonu SCNT23'ünbaşarısı için önemli bir faktördür. Bu protokolde haESC enjeksiyonu için de durum böyledir. Bir alıcıya donör genomu sokulması, embriyo gelişimini bozacak kromozomal kırılmayı veya aneuploidileri önlemek için hücre döngüsü aşamalarının eşleşmesini gerektirir. Yarı klonlama, iki genom ve bir sitoplastın uyumlu olması gereken ek karmaşıklığa sahiptir. Daha önceki bir rapor, M fazlı tutuklanmış androgenetik hESC'lerin enjeksiyonunun, yarı klonlanmış embriyoların G1 fazlı hESC'lerin oositlere enjeksiyonundan daha iyi gelişimsel oranlar sağladığını göstermiştir7. Bu rapor, yarı klonlama için uygun bir eşitleme noktası olarak M fazı önermektedir. Buna göre, fakihler metatatozda demekolsin ile mitotik olarak tutuklandı ve doğal olarak meiosis II metafazında tutuklanan MII oositlerinin ooplazmına enjekte edildi. Daha da önemlisi, M fazlı arrest, donör ve alıcı hücre döngüleri arasında mükemmel senkronizasyon sağlayan yüksek verimli fare ESC'lerinde elde edilebilir.
Mitoz sırasında, nükleer zar parçalanır ve çoğaltılan kromozomların bağlandığı bir mil oluşur. M fazlı DKO-fadezlerin enjeksiyonundan sonra, kardeş kromatlar sahte bir kutup gövdesine ve zigot7'ye (Şekil 3E) ayrılmıştır. Sonuç olarak, bir DKO-phaESC'den tek bir kromozom kümesi yarı klonlanmış embriyoya katkıda bulunur. DKO-phaESC kromozomlarının kardeş kromatlarının enjeksiyondan sonra doğru bir şekilde ayrıştırılabilmesi önemlidir. Sağlam bir DKO-phaESC'nin plazma zarı, sahte bir kutup gövdesine ayrımı önler. DKO-fazesklerin plazma zarının yırtılmadığı ve embriyoların enjeksiyondan sonra ooplazmada bozulmamış DKO-fakESC'ler sergilediği nadir vakaları gözlemledik (Şekil 3D). Bu nedenle DKO-fazesklerin plazma zarının pipetleme ile çıkarılmasına özen gösterilmelidir. Enjeksiyon sırasında, kromozom ayrım kusurlarına yol açabilecek ve aneuploidiye de neden olabilecek oosit meiotik milinin bozulmasını önlemek eşit derecede önemlidir.
Memelilerde, genomik baskı sperm replasmanı olarak fadezlerin uygulanmasını sınırlar. Partenogenetik hemECC'ler genomik izlerin anne yapılandırmasına sahipken, sperm bir baba yapılandırmasına sahiptir. Bu nedenle, tam süreli yavruların üretimi, sperm replasmanı olarak wildtype faesklerin enjekte edildikten sonra gerçekleşmedi. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, IG- ve H19-DMR'lerin silinmesi faklarda tasarlanmıştır. Maternal Igf2-H19 ve Gtl2-Dlk1 loci'deki baskılı ifadenin değiştirilmesi, aktarılan 2 hücreli embriyolara dayanarak% 5,1'in üzerinde bir frekansa sahip yarı klonlanmış farelerin üretilmesine izin vermek için genomik baskıların yapılandırmasını değiştirmek için yeterlidir. Bu gözlemler, iki baskılı genin hedeflenmesi, fadeslerin genomunun farelerdeki spermlerin yerini alan işlevsel bir baba yapılandırmasına geçtiğini göstermektedir. Bununla birlikte, bu strateji için fadeslerin kalıcı bir genetik modifikasyonu gereklidir. Alternatif bir strateji olarak androgenetik haESC düşünülebilir. Androgenetik hESC'ler sperm genomundan türetilir ve baba izlerine sahiptir. Wildtype androgenetik hESC'lerin, transfer edilen embriyoların% 1.3 ila% 1.9'u arasında bir sıklıkta tam süreli yavrular üretmek için sperm replasmanı olarak katkıda bulunduğuna dair raporlar vardır4,7,24. Tam süreli yavrular ayrıca,transfer edilen 2 hücreli embriyoların% 20.2'si oranında IG ve H19-DMR'lerin silinmesi ile androgenetik hESC'lerin enjekte ederek elde edilmiştir24. Modifiye androgenetik hESC'ler kullanılarak yarı klonlamanın artan verimliliği, künyelerin kültürde kararsız hale gelebilmesinden muhtemeldir. Baskı kusurları kritik DMR'lerin genetik silmeleri ile düzeltilir.
Genetik modifikasyonların doğrudan oosit veya sperm genomlarına sokulmasındaki zorluk göz önüne alındığında, hESC'ler ebeveyn genomlarını ayrı ayrı manipüle etmek için değerli bir araçtır. Sperm yerine HESC'leri kullanmak, fare mikrop hattında genom düzenleme için olağanüstü bir avantaj sağlar. Yeni bir çalışma CRISPR/ Cas9 tabanlı genom düzenlemeyi embriyonik gelişim için kritik olan baskı bölgelerinin karakterizasyonu için HESK'lerin uygulanması ile birleştirdi12. Bu çalışma, Rasgrf1-DMR'nin bimaternal farelerin gelişiminde H19ve IG-DMR'lerle birlikte rolünü ve biipaternal farelerin gelişiminde 7 farklı DMR'nin işlevini analiz etti. Sperm için HESC'lerin ikame edilmesi yöntemi, ilkel mikrop hücresi gelişiminde DND1 proteini içindeki anahtar amino asitleri tanımlamak ve kemik gelişimindeki genleri tanımlamak için genetik tarama yaklaşımlarının temelini oluşturmuştur24,25,26. Embriyonik gelişimdeki temel faktörleri belirlemek için genomik baskı ve genetik tarama üzerine yapılan çalışmalar, HESC'lerin gametik genom olarak uygulanması için önemli yaklaşımlardır.

Memelilerde, gametler genetik bilgileri bir sonraki nesle ileten tek hücrelerdir. Bir oosit ve spermatozonun füzyonu, yetişkin bir hayvana dönüşen bir diploid zigot oluşturur. Gametik genomlardaki mutasyonlar böylece yavrular tarafından kalıtsaldır ve türlerde genetik varyasyonu yönlendirmektedir1. Mikroptaki mutasyonların tanıtılması, gen fonksiyonunun karakterizasyonu ve hastalık modellemesi de dahil olmak üzere çeşitli biyolojik çalışmalar için genetiği değiştirilmiş hayvanlar üretmek için uygulanmıştır. Hem oositler hem de spermatozoa, çoğalma sona eren ölümcül farklılaşmış ve son derece uzmanlaşmış hücrelerdir. Bu nedenle, gametlerin doğrudan modifikasyonu teknik olarak zordur ve özel yaklaşımlar geliştirilmiştir. Genetik değişiklikler, genetiği değiştirilmiş ESC'lerin gelişmekte olan embriyoya entegre oldukları ve germline kolonileştikleri blastosistlere enjekte edilmesiyle fare germline sokulabilir. Ek olarak, CRISPR/ Cas9 sistemi de dahil olmak üzere genom düzenleme yaklaşımlarını kullanan zigotların genetik modifikasyonu yaygın olarak benimsenmiştir2.
Son zamanlarda, bir gametik genom 3 , 4,5,6,7,8yerine haESC'leri uygulayan olağanüstü bir yaklaşımbildirilmiştir. HESC'ler, partenogenetik veya androgenetik haploid blastosistlerin iç hücre kütlesinden elde edilen kök hücre hatlarıdır ve tek bir kromozom kümesine sahiptir4,7,9,10. Hem partenogenetik hem de androgenetik hemECC'lerin oositlere intrasitoplazmik enjeksiyondan sonra yarı klonlanmış farelerin genomuna katkıda bulunabileceği gösterilmiştir. Diğer yaklaşımların aksine, hemAC'lerin genomları, kendi kendini yenileme kapasiteleri nedeniyle kültürde doğrudan değiştirilebilir. Spermin yerine hemESK'ler konarak mikrop hattına genetik modifikasyonların getirilmesi biyolojik çalışmalar için önemli bir yöntemdir. Sırasıyla partenogenetik veya androgenetik hemECS'lerden türetilen anne veya baba genomlarını ayrı ayrı kültüre etme ve manipüle etme imkanı sağlar. Daha sonra HESC'ler, özellikle genomik baskı, alel özgü ifade ve ebeveyne özgü süreçler için avantajlı olan gametik genom replasmanı olarak kullanılabilir.
Farelerde normal embriyo gelişimi için hem anne hem de baba genomik bilgi gereklidir11. Bu nedenle, sperm genom5,8yerine vahşi tip partenogenetik hemECS (faESC) enjekte edildiğinde tam süreli yavrular elde edilemedi. Gelişimsel bloğun üstesinden gelmek için, partenogenetik hemECC'lerin maternal genomunun genomik baskısının bir baba yapılandırmasına düzeltilmesi gerekir. Bu, farklı metillenmiş bölgelerin (DMR' ler) manipülasyonu ile elde edilebilir. Bugüne kadar, H19-DMR, Gtl2-Dlk1 IG-DMR ve Rasgrf1-DMR'nin hedeflenen silmeleri, 3 ,5,8,12falclerinde doğumla ifade edilen genleri bastırmak için çalışılmıştır. Bu çalışmalar, hem H19-DMR hem de IG-DMR'nin silinmelerinin, bir anneyi sperm kromozomlarının yerini tutabilecek bir baba künyesi yapılandırmasına dönüştürmek için yeterli olduğunu göstermiştir. İki DMR delesyonlarını oositlere taşıyan fazEZ'lerin intrasitoplazmik enjeksiyonu, transfer edilen 2 hücreli embriyoların% 5.1 ila% 15.5'i arasında bir frekansa sahip yarı klonlanmış yavrular verdi.
Bu protokol, çift nakavtlı fadeskler (DKO-phaESC) olarak adlandırdığımız hem H19-DMR hem de IG-DMR silmeleri olan fakların uygulanmasına dayanmaktadır. DKO-phaESC hatları kurmak için faesklerde genomik baskı modifikasyonu, sperm genomunun yerine Oositlere DKO-faesk enjeksiyonu, yarı klonlanmış embriyoların blastosistlere kültürü ve yarı klonlanmış fareler elde etmek için ayrıntılı talimatlar sunuyoruz. Bu protokol, baba genomunun kesin ve doğrudan manipülasyonu ve yarı klonlanmış embriyo ve farelerin üretilmesini gerektiren araştırmacılar için bir referanstır.

<table><tbody><tr><td>1.5 mLTube</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>15 ml Tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>150628</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>&amp;beta;-Mercaptoethanol</td><td>Merck</td><td>M6250</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>BSA fraction</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>CHIR 99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Demecolcine solution</td><td>Merck</td><td>D1925</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>DMEM / F-12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>DR4 mouse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>3208</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>E5134</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>FBS</td><td>biowest</td><td>S1810-500</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Freezing medium</td><td>amsbio</td><td>11897</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Merck</td><td>G1890</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Hepes solution</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Irradiated MEF</td><td>Gibco</td><td>A34966</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>LIF (Leukemia inhibitory factor)</td><td>(Homemade)</td><td>-</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Lipofection reagent</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>NDiff 227</td><td>Takara</td><td>Y40002</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>PD 0325901</td><td>Axon</td><td>1408</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>piggyBac plasmid carrying a CAG-EGFP transgene</td><td>Addgene</td><td>#40973</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>piggyBac transposase plasmid</td><td>System Biosciences</td><td>PB210PA-1</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>pX330 plasmid</td><td>Addgene</td><td>#42230</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>pX458 plasmid</td><td>Addgene</td><td>#48138</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>DNA polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F549S</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0192</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Merck</td><td>100317</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck</td><td>109634</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Axon</td><td>A3830</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Merck</td><td>71729</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Merck</td><td>106404</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Epeendorf</td><td>5384000012</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck</td><td>T1503</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>5 mL Tube</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>5 mL Tube with cell strainer cap</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>MoFlo Astrios EQ</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>Codan</td><td>62.1640</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>30-gauge 1/2 inch needle</td><td>Merck</td><td>Z192362-100EA</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>B6D2F1 mouse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>100006</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>hCG</td><td>MSD animal health</td><td>49451</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010015</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Avivasysbio</td><td>OPPA1037 5000 IU</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>10-cm dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>150350</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>4-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>179830</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>50 mL tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>6 cm dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>150288</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Center-well dish</td><td>Corning</td><td>3260</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Digital rocker</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880020</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>AppliChem</td><td>A0878</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Merck</td><td>H4272</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>KSOM</td><td>Merck</td><td>MR-020P-5F</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>M16 medium</td><td>Merck</td><td>M7292</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>M2 medium</td><td>Merck</td><td>M7167</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Merck</td><td>M8410</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>Merck</td><td>P1049-1PAK</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Strontium chloride</td><td>Merck</td><td>13909</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>5ml syringe</td><td>Codan</td><td>62.5607</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Borosilicate glass cappilary</td><td>Science product</td><td>GB100T-8P</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>CellTram 4r Oil</td><td>Eppendorf</td><td>5196000030</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Fluorinert FC-770</td><td>Merck</td><td>F3556</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Holding pipette</td><td>BioMedical Instruments</td><td>-</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-U</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Microinjection pipette</td><td>BioMedical Instruments</td><td>-</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Microlaoder tips</td><td>Eppendorf</td><td>5252 956.003</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Micromanipulaor arms</td><td>Narishige</td><td>NT-88-V3</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>PiezoXpert</td><td>Eppendorf</td><td>5194000016</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>PVP (Polyvinylpyrrolidine)</td><td>Merck</td><td>PVP360</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>SARSTEDT</td><td>83.1826.001</td><td>Microinjection</td></tr></tbody></table>

application of mouse parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute of sperm

Cinsel üremeye sahip organizmalarda, mikrop hücreleri yeni bireylere dönüşen totipotent hücrelerin kaynağıdır. Farelerde, bir oositin bir spermatozoon tarafından döllenmesi totipotent bir zigot oluşturur. Son zamanlarda, birkaç yayın haploid embriyonik kök hücrelerin (hemECS) gametik genomların yerini tutabileceğini ve farelere dönüşen embriyolara katkıda bulunabileceğini bildirmektedir. Burada, oositlere intrasitoplazmik enjeksiyon ile embriyo oluşturmak için sperm yerine partenogenetik hemECC'lerin uygulanması için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, haESC'lerin sperm replasmanı olarak hazırlanması, haESC kromozomlarının oositlere enjeksiyonu ve yarı klonlanmış embriyo kültürü için adımlardan oluşur. Embriyolar embriyo transferinden sonra verimli yarı klonlanmış fareler verebilir. Sperm replasmanı olarak HESC'lerin kullanılması mikrop hattında genom düzenlemesini, embriyonik gelişim çalışmalarını ve genomik baskıların araştırılmasını kolaylaştırır.

Bu protokolün amacı, yarı klonlanmış embriyo ve fare elde etmek için sperm yerine HESK'leri uygulamaktır. Bu amaçla, CAG-EGFP transgene taşıyan bir DKO-phaESC hattı üretildi ve MII oositlerine intrasitoplazmik enjeksiyon için kullanıldı. Baba künye konfigürasyonu ile uygun bir fazESC hattı elde etmek için Cas9 çekirdeklerini kullanarak genetik mühendisliği gerçekleştirdik. Bir haploid ESC hattı, diploidizasyon için haploid ESC'lerin doğal eğilimi nedeniyle ortaya çıkan haploid ve diploid hücreleri içerir10. Haploid kromozom seti, sperm genomunun başarılı bir şekilde değiştirilmesi için bir ön koşuldur. Akış sitometrisine göre DNA içerik analizi, haploid ve diploid hücrelerin G0/G1-, S-ve G2/M fazlarındaki dağılımını göstermektedir (Şekil 2A).
DKO-phaESC hatlarını kurmak için, wildtype phaESC hatları stabil transgenik EGFP ekspresyonu için piggyBac transposon yapıları ve H19ve IG-DMR'lerin silinmesi için CRISPR / Cas9 plazmidleri ile trans enfekte edildi. Diploid ESC'leri dışlamak ve sadece EGFP'yi ifade eden haploid ESC'leri izole etmek için belirli bir sıralama kapısı tanımlanmıştır (Şekil 2A). Tek haploid EGFP pozitif hücreler daha sonra alt klonlar elde etmek için 96 kuyu plakalı bireysel kuyulara kaplandı. MEF besleyiciler, transfected fakların kaplama verimliliğini ve hayatta kalmasını artırmak için kullanıldı. Kültürlerin genişlemesinden sonra, pcr tarafından her iki DMR'nin silinmelerini taşıyan alt klonları tanımlamak için ilk genotipleme turu gerçekleştirildi. MEF besleyiciler kültürlerden çıkarıldıktan sonra, H19ve IG-DMR'lerde wildtype alellerinin yokluğunu doğrulamak için ikinci bir genotipleme yapıldı (Şekil 2B). Toplam 135 alt klondan, silinen alelleri taşıyan ve hem H19-DMR hem de IG-DMR'nin wildtype alellerinden arındırılmış 5 haploid DKO-phESC hattı elde ettik.
Mikroskop altında yeşil floresan görselleştirmesi yapılarak yarı klonlanmış embriyolara katkılarını incelemek üzere DKO-fazlere cag-EGFP transjeni sokuldu (Şekil 3A). İntrasitoplazmik enjeksiyon için, DKO-fakeskler M fazında tutuklanmaları için demekolsin ile tedavi edildi. Böylece, DKO-fazEZ'lerin hücre döngüsü MII oositlerininkiyle senkronize edildi. Akış sitometrisi analizi, demekolin ile tedaviden sonra G2/M fazı tutuklu haploid (2n) ve diploid hücrelere (4n) karşılık gelen 2 popülasyon göstermiştir (Şekil 3B). 1n haploid zirvesinin yokluğu, hücre döngüsü durmasının büyük ölçüde tamamlandığını gösterdi. M fazlı haploid ESC'ler daha sonra sıralandı ve oositlere enjekte edildi. Bunun için, mikroenjeksiyon pipetine tek bir DKO-phaESC yüklendi ve bir MII oosit sitoplazmına enjekte edildi (Şekil 3C). DKO-phaESC'nin plazma zarı mikroenjeksiyon pipetinin ucuna pipetle sokularak yırtıldı.
Enjeksiyondan sonra, DKO-phaESC'lerin sitoplazma oositin büyük sitoplazmında dağıldığı için, inşa edilen yarı klonlanmış embriyolarda EGFP ekspresyolü nadiren tespit edildi (Şekil 3D). Nadir durumlarda, ooplazm içinde yoğun EGFP ekspresyonunun yuvarlak bir noktası gözlenebilir. Bu gözlem muhtemelen bozulmamış DKO-fazların yanlışlıkla enjektelenmesinden kaynaklanmıştır. DKO-phaESC hücre zarın yırtılmaması muhtemelen daha fazla embriyo gelişimi ile uyumlu değildir ve kaçınılmalıdır. Enjeksiyondan bir saat sonra, embriyolar stronsiyum klorür18ile tedavi ile aktive edildi. Aktivasyonun başlatılmasından altı saat sonra, mikroskop altında en fazla 3 kutup cisimleri gözlenmiştir (Şekil 3E). Bu kutup cisimleri, oositlerin birinci ve ikinci kutup gövdelerine ve DKO-phaESC7'densahte bir kutup gövdesine karşılık gelir. Ek olarak, sperm ile normal döllenmeden sonra zigotların pronükleer aşamasına benzeyen diferansiyel girişim kontrast mikroskobu altında iki pronüklei gözlendi.
Gelişimsel yeterliliği göstermek için yarı klonlanmış embriyolar blastosist aşamasına kültürlendi (Şekil 5A). Ayrıca, yarı klonlanmış 2 hücreli evre embriyoların alıcı bir dişinin yumurtalıklarına aktarılmasından sonra tam süreli bir fare elde edildi (Şekil 5B). Beklendiği gibi, yarı klonlanmış bir embriyodan elde edilen fare, ne oositler ne de oosit türevi faklar Y kromozomu taşımazken dişiydi. Yarı klonlanmış fare aşırı derecede normaldi ve vahşi bir İsviçre Webster erkeğiyle çiftleştiğinde sağlıklı yavrular üretti. Şimdiye kadar, yarı klonlanmış fare 600 günden fazla bir süredir belirgin bir sağlık sorunu olmadan hayattaydı.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig01v3.jpg"> Şekil 1: DKO-fakesklerin sperm replasmanı olarak uygulanmasına genel bakış. (A) Protokolün prosedürlerinin bir zaman dilimi. (B) Şema, DKO-phaESC hatları oluşturma adımlarını gösterir (adım 1-6). (C) Şema, bir DKO-phaESC'nin mii oosit içine intrasitoplazmik enjeksiyonu ile yarı klonlanmış embriyoları oluşturma adımlarını gösterir (adım 7-14). Kısaltmalar: DKO = çift nakavt; phaESC = parthogenetik haploid embriyonik kök hücre; FACS = floresanla etkinleştirilen hücre sıralama; MEF = fare embriyonik fibroblast. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig02v2.jpg"> Şekil 2: H19ve IG-DMR'ların CRISPR/Cas9 aracılı silmeleri ile DKO-phaESC hatlarının kurulması. (A) Stabil EGFP ekspresyonu için piggyBac plazmidleri ve 4 CRISPR/Cas9 plazmidleri ile transfeksiyondan sonra fadeklerin akış sitometri analizi. Transfected olmayan fades'ler kontrol olarak gösterilir. DNA profili (üstte) haploid ve diploid hücrelerin hücre döngüsü dağılımını gösterir. EGFP'yi ifade eden G1/S fazlı haploid hücreler yeşil kapı (alt, sağ) ile gösterilir. (B) MEF'lerde yetişen phaESC alt klonlarının genotiplenimi (ilk genotipleme) ve MOF'ların çıkarılmasından sonra (ikinci genotipleme). Alt klonlanmış fazESC çizgileri 1, 2, 3 ve 4, sırasıyla wildtype hücrelerini, H19-DMR silmeli hücreleri, IG-DMR silme ve birleşik H19- ve IG-DMR silmeleri ile temsil eder. 5–8 DKO-phaESC hatları hem H19-DMR hem de IG-DMR silmelerine sahiptir ve wildtype alellerinden arındırılmıştır. Kısaltmalar: DKO = çift nakavt; phaESC = parthogenetik haploid embriyonik kök hücre; DMR = diferansiyel metillenmiş bölge; MEF = fare embriyonik fibroblast; EGFP = gelişmiş yeşil floresan protein; WT = wildtype. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig03v3.jpg"> Şekil 3: Miyotik olarak tutuklanan DKO-phaESC'lerin MII oositlerine enjeksiyonu. (A) H19 ve IG-DMR'lerin CAG-EGFP transgene ve silmelerini taşıyan bir DKO-phaESCkültürünün morfolojisi; ölçek çubuğu = 50 μm. (B) DKO-fazezlerin 8 saat boyunca demecolcine ile tutuklandıktan sonra temsili akış sitometri analizi, demekolsin tedavisi olmayan DKO-fazler kontrol olarak gösterilmiştir. (C) Mikroenjeksiyon pipetinde DKO-fadezlerin morfolojisi. Plazma zarını pipetleme ile yırtmadan önce (solda) ve sonra (sağda) tek bir bozulmamış DKO-phaESC gösterilir; ölçek çubuğu = 20 μm. (D) MII oositlerine DKO-phaESC enjekte edildikten sonra 1 saat içinde embriyolar inşa edildi. EGFP floresan ve parlak alanın birleştirilmiş görüntüsü gösterilmiştir. Siyah ok uçları, kaçınılması gereken sağlam DKO-phaESC enjeksiyonundan sonra yoğun EGFP ekspresyonunun yuvarlak noktalarını gösterir; ölçek çubuğu = 50 μm. (E) Stronsiyum klorür ile aktivasyonun başlatılmasından 6 saat sonra yarı klonlanmış embriyoların diferansiyel girişim kontrast görüntüsü gösterilmiştir. Beyaz ok uçları, enjekte edilen DKO-phaESC'den bir sahte kutup gövdesi de dahil olmak üzere 3 kutup gövdesine sahip embriyoları gösterir; ölçek çubuğu = 50 μm. Kısaltmalar: DKO = çift nakavt; phaESC = parthogenetik haploid embriyonik kök hücre; EGFP = gelişmiş yeşil floresan protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig04.jpg"> Şekil 4: DKO-phaESC'lerin oositlere intrasitoplazmik enjeksiyonu için kurulumun şeması. (A) Enjeksiyon odasında bir enjeksiyon pipeti, bir tutma pipeti ve bir oosit düzenlenmesi gösterilmiştir. α, mikroenjeksiyon pipetinin büküm açısı. (B) İntrasitoplazmik enjeksiyon için mikromanipülasyon kabındaki damlaların düzeni. Kısaltmalar: DKO = çift nakavt; phaESC = parthogenetik haploid embriyonik kök hücre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig05.jpg"> Şekil 5: Yarı klonlanmış embriyoların gelişimi. (A) Yarı klonlanmış embriyoların in vitro preimplantasyon gelişimi. EGFP ekspresyasyonu ilk olarak intrasitoplazmik enjeksiyondan sonra 2. günde dört hücreli embriyolarda gözlenir. 4. günde, blastosistlerde yoğun EGFP ekspresyolü görülebilir; ölçek çubuğu = 100 μm. (B) Alıcı bir kadına 2 hücreli embriyo transferinden sonra elde edilen yarı klonlanmış bir fare. 74 dpp'de, yarı klonlanmış fare (ok ucu), vahşi bir İsviçre Webster erkeğiyle çiftleştikten sonra ilk yavrularını (yıldız işareti) doğal doğumla teslim etti. Yarı klonlanmış embriyolar ve bu şekilde gösterilen yarı klonlanmış fare, Aizawa ve ark.3'te bildirilenlerle aynıdır. Kısaltmalar: EGFP = gelişmiş yeşil floresan protein; .dpp, doğum sonrası günler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4">Jelatin çözeltisi</td>
		</tr><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Hacim / ağırlık</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>Su</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Jelatin</td>
			<td>-</td>
			<td>1 g</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Haploid embriyonik kök hücre (HaESC) ortamı</td>
		</tr><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Hacim / ağırlık</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>NDiff 227</td>
			<td>-</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>CHIR 99021</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>3 μL</td>
			<td>3 μM</td>
		</tr><tr><td>PD 0325901</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>1 μM</td>
		</tr><tr><td>Lıf</td>
			<td>1 x 106 IU/mL</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>1.000 IU/mL</td>
		</tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td>
			<td>100x</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">HaESC bakım tamponu</td>
		</tr><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Hacim / ağırlık</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>HaESC ortamı</td>
			<td>-</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>HEPES çözümü</td>
			<td>1 M</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Yıkama arabelleği</td>
		</tr><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Hacim / ağırlık</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>DMEM / F-12</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>BSA kesir</td>
			<td>7.5%</td>
			<td>7,1 mL</td>
			<td>0.5%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">MEF ortamı</td>
		</tr><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Hacim / ağırlık</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>DMEM</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Fbs</td>
			<td>-</td>
			<td>56 mL</td>
			<td>10%</td>
		</tr><tr><td>β-Mercaptoethanol</td>
			<td>14.3 mol/L</td>
			<td>3,9 μL</td>
			<td>100 μM</td>
		</tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td>
			<td>100x</td>
			<td>5,6 mL</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Lizis arabelleği</td>
		</tr><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Hacim / ağırlık</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>Su</td>
			<td>-</td>
			<td>8,25 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Tris-HCl (pH 8.5)</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>100mm</td>
		</tr><tr><td>Edta</td>
			<td>0,5 M</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>SDS çözümü</td>
			<td>10%</td>
			<td>200 μL</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr><tr><td>Nacl</td>
			<td>5 M</td>
			<td>400 μL</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr><tr><td>Proteinaz K</td>
			<td>20 mg/mL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>100 μg/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Etkinleştirme ortamı</td>
		</tr><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Hacim / ağırlık</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>KSOM</td>
			<td>-</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Stronsiyum klorür</td>
			<td>1 M</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>EGTA</td>
			<td>0,5 M, pH 8,0</td>
			<td>4 μL</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">PVP çözümü</td>
		</tr><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Hacim / ağırlık</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>M2 orta</td>
			<td>-</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Pvp</td>
			<td>-</td>
			<td>0,6 g</td>
			<td>12%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">PMSG çözümü</td>
		</tr><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Hacim / ağırlık</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>Pbs</td>
			<td>-</td>
			<td>450 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>PMSG</td>
			<td>500 IU/mL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>50 IU/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">hCG çözümü</td>
		</tr><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Hacim / ağırlık</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>Pbs</td>
			<td>-</td>
			<td>450 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Hcg</td>
			<td>500 IU/mL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>50 IU/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Hyaluronidaz ortamı</td>
		</tr><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Hacim / ağırlık</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>M2 orta</td>
			<td>-</td>
			<td>380 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Hyaluronidaz</td>
			<td>10 mg/mL</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>0,5 mg/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Kısaltmalar: LIF = lösemi inhibitör faktörü; MEF = fare embriyonik fibroblast;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">FBS = fetal sığır serumu; DMEM = Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortası; BSA = sığır serum albümin;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">EDTA = etileniamintetraasetik asit; SDS = sodyum dodecylsulfate; EGTA = etilen-bis(oksitilennitrilo)tetraasetik asit;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">PBS = fosfat tamponlu salin; PVP = poliviniliptirolidon; hCG = insan koryonik gonadotropin;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">PMSG = hamile kısrak serum gonadotropin.</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Orta, tampon ve çözelti tarifi.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Adı</td>
			<td colspan="2">Sıra (5' ila 3')</td>
			<td>Uygulama</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">GTG GTT AGT TCT ATA TGG GG</td>
			<td>Genotipleme</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">AGA TGG GGT CAT TCT TTT CC</td>
			<td>Genotipleme</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">TCT TAC AGT CTG GTC TTG GT</td>
			<td>Genotipleme</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">TGT GCA GCA GCA AAG CTA AG</td>
			<td>Genotipleme</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">CCA CAA AAA CCT CCC TTT CA</td>
			<td>Genotipleme</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">ATA CGA TAC GGC AAC CAA CG</td>
			<td>Genotipleme</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCA TGA ACT CAG AAG AGA CTG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCA GTC TCT TCT GAG TTC ATG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CAG GTG AGA ACC ACT GCT GAG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCT CAG CAG TGG TTC TCA CCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCG TAC AGA GCT CCA TGG CAC</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CGT GCC ATG GAG CTC TGT ACG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCT GCT ETIKETI AGG TAC TAC GCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CAG CGT AGT ACC TCT AAG CAG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Oligonükleotidlerin listesi.

Watch this Scientific Journal Video about Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm at JoVE.com

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

Bu makale, yarı klonlanmış embriyoların yapımında sperm yerine partenogenetik haploid embriyonik kök hücrelerin kullanımını göstermeyi amaçlamaktadır.

Sperm Yerine Fare Partenogenetik Haploid Embriyonik Kök Hücrelerin Uygulanması

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

application-mouse-parthenogenetic-haploid-embryonic-stem-cells-as

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

4.5K Görüntüleme.  ETH Zurich. Bu makale, yarı klonlanmış embriyoların yapımında sperm yerine partenogenetik haploid embriyonik kök hücrelerin kullanımını göstermeyi amaçlamaktadır.

Video: Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. The CRISPR/Cas9 system allows researchers to modify the genome with unprecedented efficiency, fidelity, and simplicity. Harnessing this technology, researchers are seeking a rapid, efficient, and easy protocol for generating GM mice. Here we introduce an improved method for cryopreservation of one-cell embryos that leads to a higher developmental rate of the freeze-thawed embryos. By combining it with optimized electroporation conditions, this protocol allows for the generation of knockout and knock-in mice with high efficiency and low mosaic rates within a short time. Furthermore, we show a step-by-step explanation of our optimized protocol, covering CRISPR reagent preparation, in vitro fertilization, cryopreservation and thawing of one-cell embryos, electroporation of CRISPR reagents, mouse generation, and genotyping of the founders. Using this protocol, researchers should be able to prepare GM mice with unparalleled ease, speed, and efficiency.

Here, we present a modified method for cryopreservation of one-cell embryos as well as a protocol that couples the use of freeze-thawed embryos and electroporation for the efficient generation of genetically modified mice.

Genetiği Değiştirilmiş Farelerin Yüksek Verimli Üretimi için Dondurulmuş Çözülmüş Embriyoların Kullanımı

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. ...

Genetik

CRISPR/Cas9-Mediated Highly Efficient Gene Targeting in Embryonic Stem Cells for Developing Gene-Manipulated Mouse Models

The CRISPR/Cas9 system has made it possible to develop genetically modified mice by direct genome editing using fertilized zygotes. However, although the efficiency in developing gene-knockout mice by inducing small indel mutation would be sufficient enough, the efficiency of embryo genome editing for making large-size DNA knock-in (KI) is still low. Therefore, in contrast to the direct KI method in embryos, gene targeting using embryonic stem cells (ESCs) followed by embryo injection to develop chimera mice still has several advantages (e.g., high throughput targeting in vitro, multi-allele manipulation, and Cre and flox gene manipulation can be carried out in a short period). In addition, strains with difficult-to-handle embryos in vitro, such as BALB/c, can also be used for ESC targeting. This protocol describes the optimized method for large-size DNA (several kb) KI in ESCs by applying CRISPR/Cas9-mediated genome editing followed by chimera mice production to develop gene-manipulated mouse models.

Here we present a protocol for developing genetically modified mouse models using embryonic stem cells, especially for large DNA knock-in (KI). This protocol is tuned up using CRISPR/Cas9 genome editing, resulting in significantly improved KI efficiency compared with the conventional homologous recombination-mediated linearized DNA targeting method.

Genle Manipüle Edilmiş Fare Modelleri Geliştirmek için Embriyonik Kök Hücrelerde CRISPR / Cas9 Aracılı Yüksek Verimli Gen Hedefleme

The CRISPR/Cas9 system has made it possible to develop genetically modified mice by direct genome editing using fertilized zygotes. However, although the ...

Gelişim Biyolojisi

<meta charset="utf8"></head><body>Embriyonik Gelişimi İncelemek için Murin Round Spermatid Enjeksiyon Prosedürü

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>Fare Yuvarlak Spermatid Enjeksiyonu

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

Fare Yuvarlak Spermatid Enjeksiyonu

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

<meta charset="utf8"></head><body>Glikoz metabolizması üzerindeki uzun vadeli etkileri incelemek için ICSI-ET fare modeli

Monitoring Blood Glucose in Mouse Offspring After Intracytoplasmic Sperm Injection

Human lifespan is considerably long, while mouse models can simulate the entire human lifespan in a relatively short period, with one year of mouse life roughly equivalent to 40 human years. Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is a commonly used assisted reproductive technology in clinical practice. However, given its relatively recent emergence about 30 years ago, the long-term effects of this technique on human development remain unclear. In this study, we established the ICSI combined with embryo transfer (ET) method using a mouse model. The results demonstrated that normal mouse sperm, after undergoing in vitro culture and subsequent ICSI, exhibited a fertilization rate of 89.57% and a two-cell rate of 87.38%. Following ET, the birth rate of offspring was approximately 42.50%. Furthermore, as the mice aged, fluctuations in glucose metabolism levels were observed, which may be associated with the application of the ICSI technique. These findings signify that the mouse ICSI-ET technique provides a valuable platform for evaluating the impact of sperm abnormalities on embryo development and their long-term effects on offspring health, particularly concerning glucose metabolism. This study provides important insights for further research on the potential effects of the ICSI technique on human development, emphasizing the necessity for in-depth investigation into the long-term implications of this technology.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: İntrasitoplazmik Sperm Enjeksiyonunun Yavrular Üzerindeki Uzun Vadeli Sağlık Etkilerini Keşfetmek

Here, we present a protocol to establish an intracytoplasmic sperm injection (ICSI)-embryo transfer (ET) mouse model, allowing us to observe age-related changes in glucose metabolism that may be attributed to ICSI, providing insights into its potential long-term impacts on human development.

İntrasitoplazmik Sperm Enjeksiyonu Sonrası Fare Yavrularında Kan Şekerinin İzlenmesi

Human lifespan is considerably long, while mouse models can simulate the entire human lifespan in a relatively short period, with one year of mouse life ...

Tek Hücreli Dizileme için Gastrolama Fare Embriyosunun İzolasyonu ve Genotiplemesi

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states within samples. Before single-cell advances, the feasibility of capturing the dynamic cellular landscape and rapid cell transitions during early development was limited. In this paper, a robust pipeline was designed to perform single-cell and nuclei analysis on mouse embryos from embryonic day E6.5 to E8, corresponding to the onset and completion of gastrulation. Gastrulation is a fundamental process during development that establishes the three germinal layers: mesoderm, ectoderm, and endoderm, which are essential for organogenesis. Extensive literature is available on single-cell omics applied to wild-type perigastrulating embryos. However, single-cell analysis of mutant embryos is still scarce and often limited to FACS-sorted populations. This is partially due to the technical constraints associated with the need for genotyping, timed pregnancies, the count of embryos with desired genotypes per pregnancy, and the number of cells per embryo at these stages. Here, a methodology is presented designed to overcome these limitations. This method establishes breeding and timed pregnancy guidelines to achieve a higher chance of synchronized pregnancies with desired genotypes. Optimization steps in the embryo isolation process coupled with a same-day genotyping protocol (3 h) allow for microdroplet-based single-cell to be performed on the same day, ensuring the high viability of cells and robust results. This method further includes guidelines for optimal nuclei isolations from embryos. Thus, these approaches increase the feasibility of single-cell approaches of mutant embryos at the gastrulation stage. We anticipate that this method will facilitate the analysis of how mutations shape the cellular landscape of the gastrula.

Yazar Spotlight: Tek Hücre Çözünürlüğünde Soya Özgü Mutant Embriyoları Analiz Etmek İçin Bir Boru Hattı

This paper establishes a pipeline for high-quality single-cell and nuclei suspensions of gastrulating mouse embryos for sequencing of single cells and nuclei.

Mutant Bütün Fare Embriyolarının Tek Hücreli RNA Dizilimi: Epiblasttan Gastrulasyonun Sonuna Kadar

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states ...

Sperm Yerine Fare Partenogenetik Haploid Embriyonik Kök Hücrelerin Uygulanması

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Genetiği Değiştirilmiş Farelerin Yüksek Verimli Üretimi için Dondurulmuş Çözülmüş Embriyoların Kullanımı

Genle Manipüle Edilmiş Fare Modelleri Geliştirmek için Embriyonik Kök Hücrelerde CRISPR / Cas9 Aracılı Yüksek Verimli Gen Hedefleme

Fare Yuvarlak Spermatid Enjeksiyonu

Fare Yuvarlak Spermatid Enjeksiyonu

Fare Yuvarlak Spermatid Enjeksiyonu

İntrasitoplazmik Sperm Enjeksiyonu Sonrası Fare Yavrularında Kan Şekerinin İzlenmesi

İntrasitoplazmik Sperm Enjeksiyonu Sonrası Fare Yavrularında Kan Şekerinin İzlenmesi

İntrasitoplazmik Sperm Enjeksiyonu Sonrası Fare Yavrularında Kan Şekerinin İzlenmesi

Mutant Bütün Fare Embriyolarının Tek Hücreli RNA Dizilimi: Epiblasttan Gastrulasyonun Sonuna Kadar

Mutant Bütün Fare Embriyolarının Tek Hücreli RNA Dizilimi: Epiblasttan Gastrulasyonun Sonuna Kadar