C. Linn is supported by an NIH grant (NIH NEI EY022795).

hayvan denekleri kullanan tüm işlemler Western Michigan Üniversitesi&#39;nde Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) Enstitüsü standartlarına uygun olmuştur. 1. Hayvanlar <ol><li> Bu çalışmada, erkek ve dişi sıçanlarda 3 aylık kullanın. </li><li> yiyecek ve suya serbest erişim ile 12 saat ışık / karanlık döngüsünde hayvanları tutun. </li></ol> Hayvan Anestezi için KAX Kokteyli 2. Hazırlık <ol><li> 1 mi asepromazin (10 mg / ml) damıtılmış su, 3 ml ile 5 mi, ketamin (100 mg / ml) içinde ksilazin (20 mg / ml), 50 mg eritin. İyice karıştırın. </li><li> bir şırınga filtresi ile sterilize ve 10 mi, serum şişeye bu çözüm saklayın. </li></ol> 3. KAX Enjeksiyon <ol><li> hayvan (g) tartılır ve enjeksiyon için hazır olana kadar kafesin geri dönün. </li><li> 28 G iğne ile 1 ml insülin şırıngası kullanılarak, intraperitonal 0.1 mi KAX / 100 g hayvan vücut ağırlığına enjekte edilir. </li><li> İzin vermekhayvan için bilinçsiz olmak. ayak ve kuyruk kısma refleksleri kontrol edin. </li><li> Ameliyat süresince güvenle laboratuarında tüm hayvanları tutun. </li><li> Post-cerrahi, kafeslerine hayvanlar yerine ve bilinç sağlanıncaya kadar RT rahat tutun. Sadece hayvanlar uyandırmak zaman hayvan tesisine hayvanları dönmek ve normal davranış devam edin. </li></ol> Cerrahi ve Microneedle Meclisi 4. Hazırlık <ol><li> Steril 2 M NaCl çözeltisi olun. </li><li> İki ince konik cam microneedles (Şekil 1D, Şekil 1E) içine bir 0.86 mm iç çap ağır cilalı standart ve ince duvarlı borosilikat tüp çekmek için bir mikroelektrot çektirmesi (Şekil 1C) kullanın. </li><li> 2 M tuz, bir dolgu şırınga iğnesi ve 1 ml şırınga (Şekil 1B) kullanılarak önceki adımda elde edilen bir mikroiğne Dolgu. elektrot ucu hava kabarcıklarını dışarı dokunun. </li><li> 2 M ile ikinci 1 ml şırınga doldurunNaCI ile yıkanmıştır. 18 G iğne bağlayın ve sonra polietilen boru (Şekil 1A) bir uzunluğa (yaklaşık 10 inç) ekleyin. iğne ile tuzlu su ile polietilen boru doldurmak için şırınga pistonu kullanın. </li><li> microneedle ve tüp hem de tuzlu su ile dolu olduğunda, dikkatli bir şekilde birbirine bağlamak. Aralarında bağlantı (Şekil 2) herhangi bir havayı ortadan kaldırın. </li><li> İnce bir ders kağıt havlu tahıl karşı çok hafifçe kazıyarak Mikroiğnenin ucu konik. </li><li> yavaşça sıvının ince bir dere kağıt havlu üzerine görülebilir kadar şırınga pistonu iterek Mikroiğnenin direncini kontrol ediniz. sıvı akıntısı 0.5 mm daha büyük olmalıdır. </li></ol> Animal 5. hazırlanması <ol><li> 2 damla kornea topikal anestetik (Proparakain hidroklorür Oftalmik Solüsyon USP,% 0.5) - 1 uygulayın. Hiçbir göz refleks oluşuncaya kadar bekleyin. </li><li> makasla bıyıkları kesin. </li><li> SDeneysel göz çevresinde betadin çözüm ve çubukla alanına sahip bir pamuk uçlu aplikatör aturate. </li><li> Bir mikroskop kullanarak, göz şişkinliği Episkleral ven ortaya çıkarmak ve göz hareketi kısıtlamak için alt göz kapağı kelepçe bir hemostat ekleyin. (Şekil 3, ok başı) </li></ol> 6. Glokom uyaran Tuzlu Enjeksiyon <ol><li> microneedle montaj ve hayvan hazırlandıkları zaman, enjeksiyon başlar. </li><li> Hayvan ayak / kuyruk tutam tepkisiz olması teyit edildiğinde, dikkatlice ven (Şekil 3, beyaz ok) 10 ve 20 derece arasında düşük bir açıda gelerek microneedle ile Episkleral ven delin. Kan mikroiğne (Şekil 3, siyah ok) ucu girer damar içine başarılı bir lastik belirgindir. </li><li> Yavaş ve el damar içine yaklaşık 50 ul tuzlu su enjekte edilir. Bu, yaklaşık 10 sn almalıdır. Damarlar olacak tuz uçtan bir uca dolaşır olarak mazur beyazugh damar (Şekil 4, ok başı). Bazı bölgeler kan kırmızı bir görünüm (Şekil 4, ok) muhafaza edebilir. <ol><li> tam retina ganglion hücre tabakası tam retina hasarı sağlamak için, karşısındaki ilk site, damar içine ikinci bir enjeksiyon gerçekleştirin. Not: Tuz damar sistemi aracılığıyla dolaşır olarak dakika içinde, bir gözün iris yoluyla ayrı bir bulutlu bir görünüm görmelisiniz. </li></ol></li><li> Bir iç kontrol olarak kullanılmak üzere muamele edilmemiş karşı gözü terk. </li></ol> 7. Hayvan Kurtarma <ol><li> hemostat çıkarın. </li><li> hemostatla tarafından ve enjeksiyon sitelere kenetlenmiş siteye üçlü antibiyotik merhem (basitrasin çinko, neomisin sülfat, polymysin B sülfat) uygulamak için bir pamuk aplikatör kullanın. Göz çevresinde doku hasarı hemostat kullanarak oluşmaz. </li><li> &gt; Bir dolaşan sıcak su battaniye kafeslerine Place anestezi hayvanların prev içinent hipotermi. bilinç ve normal bir davranış kazanmış kadar gözlem altında hayvanları tutun. geri hayvan koloniye uyanık hayvan taşıyın. Hayvanlar kurban zamanına kadar koloni kalır. </li></ol> 8. Hayvan Kurban ve Retina Kaldırma <ol><li> Glokom ikna etmek için prosedürü izleyerek Bir ay, hayvanlar CO 2 boğulma ve ikincil göğüs ponksiyon ile ötenazi. <ol><li> odasında hayvan koyun ve güvenli kapağı koydu. </li><li> % 20 hacmi / dk CO 2 deplasman izin CO 2 ve gaz regülatörü vanaları açın odasındaki oksijen. </li><li> Hayvan sona erecek dört ila 5 dakika bekleyin. </li><li> Her iki vanaları kapatın. </li><li> odasından gelen hayvan çıkarın ve steril bir bisturi ile ikincil göğüs delik gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Ötenazi sonra, göz, bei çevreleyen orbita boşluğuna bağ dokusu kesmek için bir neşter kullanabilirsinizng dikkatli küresi kendi içine kesmek için değil. </li><li> Dikkatle sağlam gözü ayıklamak için optik siniri ve kalan doku kesmek için kavisli kenar makas kullanın. Taze PBS içeren steril bir 60 mm x 15 mm atılabilir bir petri ekstre gözün yerleştirin. </li><li> göz küresi bir göz yuvasını yapın. Bunu yapmak için, neşter ile küçük bir kesi sadece iris ve sklera arasındaki sınır posterior olun. göz küresi kornea yarımkürede kaldırmak için küçük yaylı makas ile göz çevresine bu kesi izleyin. optik sinir bağlı hemisfer kalır. </li><li> ötenazi hayvandan Göz yuvası içinde çok ince pembe / bej retina bulun. Göz yuvası stabilize etmek için körleşmiş forseps ile retinanın pigmentli tabakası tutun. çok yavaşça gözün arka kapalı bütün dokunulmamış retina kızdırmak için kapalı forseps başka bir çift kullanın. , Kısma çekerek, ya da doğrudan retinaya asılarak kaçının. </li><li> kesmek için küçük yaylı makas kullanınOptik sinir hala retinaya bağlı olduğu alan. </li><li> retinadan herhangi bir kalıntı pigment epitel ya da skleral doku kesip emin olun. </li><li> Bir transfer pipet kullanarak, çok yavaşça taze PBS içeren 35 mm x 10 mm petri kaplı temiz bir sylgard izole retina aktarın. </li></ol> 9. Tüm Montaj Retina Hazırlık <ol><li> Bir kez Sylgard çanak, yerinde retina pin forseps ve bir kaktüs iğne kullanın. yukarı bakacak şekilde retina ganglion hücre tabakası tutun ve aşağı optik sinir. retinanın yarım küre şekli bile tespit sonrasında dikkat çekicidir. retinal ganglion hücre tabakası arzu edilen bir doğrultuda olduğunda retina kavis tavana doğru kıvrılmasına olacaktır. </li><li> optik sinir başı yayılan dört yapraklı yonca şeklini verme, dört parçaya bölünür retina kesmek için küçük bir makas kullanın. </li><li> Mümkün witho olarak retina gibi düz hale getirmek için ek kaktüs iğne ile retina kadran pingerme ut (Şekil 5). </li><li> % 4 paraformaldehid O / oda sıcaklığında N 3 ml Sylgard çanak tutturulmuş retina sabitleyin. </li></ol> Retina 10. Antikor Boyama Not: Birincil ve ikincil antikorlar ile Leke sabit retina retina (Şekil 6) nöronların görüntüleme için. <ol><li> PBS içinde sabit, düz monte retina 2 dakika boyunca üç kez yıkayın. </li><li> 60 dakika boyunca PBS içinde% 1 fetal bovin serumu ile% 1 Triton X-100 ile retina geçirgenliği. </li><li> Durulama PBS içinde üç kez 2 dakika her biri, retina. </li><li> PBS içinde% 0.1 Triton X-100, yıkama başına 5 dakika ile iki kez yıkayın. </li><li> PBS yıkama başına 5 dakika ile iki kez yıkayın. </li><li> 45 dakika boyunca oda sıcaklığında PBS içinde% 1 Triton X-100 ve% 1 fetal inek serumu ile inkübe edin. </li><li> PBS içinde% 0.1 Triton X-100, yıkama başına 5 dakika ile iki kez yıkayın. </li><li> PBS yıkama başına 5 dakika ile iki kez yıkayın. </li><li> PBS içinde 3 mi% 1 fetal inek serumu, her retina inkübesaflaştırılmış fare anti-fare CD90 / fare CD90.1 (1: 300 seyreltme) O / oda sıcaklığında N. </li><li> 5 dakika boyunca PBS içinde% 0.1 Triton X-100 ile bir kez retina durulayın. </li><li> PBS yıkama başına 5 dakika ile iki kez yıkayın. </li><li> İkincil Alexa Fluor 594 keçi anti-fare IgG&#39;si ile 3 ml PBS (Resim FBS) her bir retina inkübe (1: 300) O / oda sıcaklığında N. </li><li> liberal PBS ile retina yıkayın. </li><li> Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak dikkatli bir şekilde retinanın kaktüs iğneleri çıkarın. </li><li> Yavaşça bir transfer pipet yardımıyla mikroskop lamı üzerine retina aktarın. tavana bakacak şekilde retina ganglion hücre tabakası ile yönünü korumak için emin olun. retinanın yarım küre şekli bile tespit sonrasında dikkat çekicidir. retinal ganglion hücre tabakası arzu edilen bir doğrultuda olduğunda retina kavis tavana doğru kıvrılmasına olacaktır. </li><li> KimWipe ya da diğer emici madde ile herhangi bir aşırı PBS emer. retina emmek için dikkatli olun. </li><li> ½ gliserol 5 damla ilave edin ve am ağırlık olarak PBS ½tutarlı medya. </li><li> hava kabarcıkları kaçınarak, lamel ile retina örtün. </li><li> net oje, tutkal veya başka bir yapıştırıcı kullanarak güvenli lamel. </li></ol>

The authors have no conflicting or competing interests to disclose.

Bu protokol, bir in vivo sıçan modelinde glokom gibi koşulların oluşturulması için bir yöntem tarif eder. Bu prosedür 29, 32. Skar dokusu geliştirilmesi ön kamarada basıncı artar sulu mizah çıkışı tıkar trabeküler ağda yara izi ikna etmek için hipertonik salin enjeksiyonu kullanır. azalmış çıkış ve basınç kurmak ile, elastik ligaman tarafından askıya objektif geri vitreus odasına iter. Vitreus mizah sonra kırılgan retina nöronlar zarar retina üzerine basınç uyg...

Glokom özel olarak ise, retinal ganglion hücre 1-2, retina nöronlarını etkileyenler göz hastalıklarının grubudur. Bu hücrelerin aksonları vizyon algılanan beyine görsel bilgileri taşıyan optik sinir olmaya birleşir. RGCs ve akson hasar dolayısıyla görsel kusurları neden olur. glokom bozuklukları ile ilişkili birincil özellikler RGC dejenerasyonu ve ölümü, artan göz içi basıncı (GİB) ve optik diskin çukurluğu ve atrofi vardır. Bu özellikler görme alanı kaybı ya da tam geri dönüşü olmayan körlüğe yol açar. Şu anda, glokom, dünya çapında 70 milyon insanın 3 körlük neden olmuştur. Bunun gibi, körlük 4 dünyanın en büyük üçüncü nedenidir. Glokom RGC kesin ölüm mekanizması bilinmemektedir. Çok araştırma gizem kilidini açmak için yapılmıştır. Glokom birincil risk faktörü bir artış i Bununla birlikte, bilinennedeniyle gözün ön kamarasında sulu mizah (AH) düzensiz dolaşımına n göz içi basıncı. AH gözün avasküler ön kamara kan saydam ve renksiz bir yedek olarak işlev görür. Bu, çevredeki hücreleri besler metabolik süreçler salgılanan atık ürünler kaldırır, nörotransmitter nakil ve patolojik devletlerin 1 sırasında uyuşturucu ve gözün içinde inflamatuar hücrelerin dolaşımını sağlar. Sulu mizah dolaşım bakım siliyer cisim ve trabeküler ağı içerir. Sulu mizah siliyer cisim tarafından üretilir. Daha sonra göz dokusunun genel sağlığını korumak için ön kamaraya akar. 75 - Sıvı siliyer kasta süngerimsi doku üç katmandan süzülür zaman sulu mizah çıkışı% 80 aktif olmayan pigment siliyer epitel içinden salgılanır. trabeküler ağ yoluyla ve hangi satınalmada öncelikli Schlemm Kanalı aracılığıyla sıvı çıkar20 Kalan kan sistemi 5 hayranlarıyla içine ler - çıkışı% 25 trabeküler ağı atlar ve pasif uveo-skleral yolu ile ultrafiltrasyon ve difüzyon tarafından salgılanır. Bu yol göz içi basıncı 1 nispeten bağımsız olduğu görülmektedir. aköz üretimi ve çıkış dengesi olduğunda, basınç gözün içindeki kurar. Belirtildiği gibi, göz içi basıncının bu artış glokom gelişiminde en önemli risk faktörüdür. Bu baskı, gözün arkasındaki retina nöronlarının karmaşık tabakalar hasara neden olur. optik sinir retina ganglion hücre aksonları hasar artık doğru bir görsel bilgi almak için beyin neden olur. Bunun bir sonucu olarak, görüş algılama kaybolur ve tam körlük olabilir. Bugüne kadar, glokom için tedavisi yoktur. Farklı tedavi yöntemleri öncelikle göz içi basıncını azaltmak amacı vardır. Bu harici,Bu beta1-adrenerjik reseptör blokerleri, ya da topik prostaglandin analogları olarak ilaç sınıfları. Beta blokerler sulu mizah 7 üretimini azaltarak göz içi basıncını azaltır. Prostaglandinler sulu mizah 8-14 akışını artırarak GİB&#39;in azaltmak için çalışır. Alfa adrenerjik agonistler, karbonik anhidraz inhibitörleri, aynı zamanda tedavi ikincil yöntem olarak kullanılmaktadır. Alfa adrenerjik agonistler uveoskleral yolunun 15-17 ile çıkışı artar. Karbonik anhidraz inhibitörleri enzimatik inhibisyon 18 ile AH üretimini azaltır. Çok daha invaziv girişimler aynı zamanda glokom tedavisinde kullanılmaktadır. Lazer trabeküloplasti sulu mizah 19 çıkış artırmak için kullanılır. Trabekülektomi adlı başka bir cerrahi tedavi, geleneksel trabeküler yolu 20-21 bloke olduğunda AH filtrelemek için alternatif bir drenaj sitesi oluşturur. Bu tedavi seçenekleri eff bilinmektedirectively Göz içi basıncını düşürmek. Ancak, glokom hastalarının% 40&#39;a varan daha tam tedavi yöntemleri için bir ihtiyaç gösteren, normal GİB göstermektedir. 22,23 Ek olarak başlar ve güncel tedaviler hastalığın ilerlemesini bitmiyor kez glokom görülen retina ganglion hücre ölümü geri döndürülemez 24-28. Bu nöronların kendilerini hayatta hedefleyen etkili nöroprotektif tedaviler gerekliliğini göstermiştir. glokom modellerinin geliştirilmesi, bu gelişimi için çok önemlidir. Bu çalışmada, ilk olarak Morrison 29 ile belirtilen bir tadil edilmiş bir prosedür kullanılarak, yetişkin Long Evans sıçanlarda glokom gibi etkileri başlatmak için bir yöntem gösteriyorlar. Bu prosedürde, episkleral venöz pleksus içine 2 M hipertonik salin enjeksiyonları göz içi basınç artışı ve RGCs önemli bir kayıp w yol açan trabeküler ağda sulu mizah çıkışı azaltmak için doku yara izi ile glokom gibi koşullar indüklerprosedür 30-31 bir ay ithin. Böyle Burada anlatılan biri olarak Glokom uyaran prosedürleri, glokom tedavisinde yeni gelişmeler çözmenin anahtarı olabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="982">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:299px;">Xylazine hydrochloride, Minimum 99%</td>
			<td style="width:156px;">Sigma, Life Science</td>
			<td style="width:200px;">X1251-1G</td>
			<td style="width:327px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/mL&#160;</td>
			<td>Putney, Inc</td>
			<td>NDC 26637-411-01</td>
			<td>10 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Acepromazine Maleate, 10mg/mL</td>
			<td>Phoenix Pharmaceutical, Inc</td>
			<td>NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408</td>
			<td>50 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Serum bottle, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16171319</td>
			<td>Borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">1 mL insulin syringe&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD329410</td>
			<td>28 gauge needle&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>S7653</td>
			<td>2 M Solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Microelectrode Puller&#160;</td>
			<td>Narishige Group</td>
			<td>PP-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>B150-86-10HP</td>
			<td>without filament, 0.86 mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Microfil syringe needle for filling micropipettes</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc</td>
			<td>MF28G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">18 gauge Luer-Lock needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1130421</td>
			<td>Syringe needle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Flexible Polyethylene Tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22046941</td>
			<td>0.034 inch diameter, approximately 10 inches&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5%</td>
			<td>Akorn, Inc</td>
			<td>NDC 17478-263-12</td>
			<td>15 mL&#160; sterile bottle&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Curved Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Microscope</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>StereoZoom 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Hemostat Clamp&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>1310912</td>
			<td>curved edge</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Triple Antibiotic Ointment&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0664481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>10004-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Scalpel blade # 11</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>10011-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate</td>
			<td>Sigma, Life Science&#160;</td>
			<td>P7059-1L</td>
			<td>1x dilution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>15009-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Forceps (2), Dumont # 5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">3 mL Transfer Pipets, polyethylene, non sterile</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>357524 or 52947-948</td>
			<td>1 and 2 mL graduations</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Sylgard 184</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102092-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Cactus Needles</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>EMD Millipore&#160;</td>
			<td>PX0055-3 or 818715.0100</td>
			<td>Made into a 4% solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>T9284-100 mL</td>
			<td>Made into both a 1% and 0.1% solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Atlanta Biological</td>
			<td>S11150</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>Cat 554892</td>
			<td>1:300 dilution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Alexa Fluor 594 goat anti-mouse&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>A11005</td>
			<td>1:300 dilution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Microscope Slides</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>2948-75x25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Glycerol&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>G5516-100 mL&#160;</td>
			<td>50% glycerol to 50% PBS, by weight&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Coverglass&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>2975-225</td>
			<td>Thickness 1 22 x 50 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>C2 Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glaucoma-inducing procedure in an in vivo rat model and whole-mount retina preparation

Glokom, retinal bez hücrelerin (RGCs) etki eden, merkezi sinir sisteminin bir hastalığıdır. optik sinir oluşturan RGC aksonlar görsel algı için beyne görsel girdi taşırlar. RGCs ve akson hasar görme kaybı ve / veya körlüğe yol açar. glokom spesifik nedeni bilinmemekle birlikte, hastalığın birincil risk faktörü yüksek bir göz içi basıncı. hayvan modellerinde Glokom uyaran prosedürler RGC ölüm mekanizmasını çalışan araştırmacılar için değerli bir araçtır. Bu tür bilgiler görme kaybının önlenmesinde yardımcı olabilir etkili bir nöro-koruyucu tedavilerin geliştirilmesine yol açabilir. 2 M hipertonik salin 50 ul episkleral venöz pleksus enjekte edilir, bir in vivo sıçan modelinde koşulları gibi - bu yazıda protokolü glokom teşvik etmek için bir yöntem tarif eder. damarların Ağartma başarılı bir enjeksiyon gösterir. Bu prosedür glokom simüle etmek için RGCs kaybına neden olur. takip eden bir ayenjeksiyonu, hayvanlar kurban edilmiş ve gözler uzaklaştırılır. Sonraki, kornea, lens ve vitreus bir göz yuvasını yapmak için kaldırılır. Retina sonra gözün arka soyulmuş ve kaktüs iğneler kullanılarak Sylgard yemekleri üzerine tutturulmuş. Bu noktada, retina nöronlarının analizi için boyandı. Bu laboratuvarda elde edilen sonuçlar iç kontroller ile karşılaştırıldığında RGCs yaklaşık% 25&#39;i prosedürü bir ay içinde kaybolur olduğunu göstermektedir. Bu prosedür, bir in vivo sıçan glokom modelinde retinal ganglion hücresi ölümü kantitatif analizi sağlar.

Bu bölüm, bir in vivo sıçan glokom modelinde glokom gibi koşullar uyarılması için kullanılan aygıt bileşenlerini ve prosedürü görüntülemektedir. Biz göz içi basıncı bir artışa neden bir hipertonik salin enjeksiyonu gerçekleştirmek için kullanılan bireysel araç ve gereçleri gösterir. Biz onun karakteristik haşlama etkisi ve sonuçları ön kamara bulutlu görünümü ile episkleral venöz pleksus içine enjeksiyon göstermektedir. Biz de retina kald?...

Watch this Scientific Journal Video about Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation at JoVE.com

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Glokom uyaran bir de Prosedürü<em&gt; İn Vivo</em&gt; Rat Modeli ve Tüm montaj Retina Hazırlık

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

glaucoma-inducing-procedure-an-vivo-rat-model-whole-mount-retina

Research

JoVE Journal

Medicine

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

12.9K Görüntüleme.  Western Michigan University. Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis. 

Video: Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

Manyetik Rezonans Görüntüleme, Volumetrik Bilgisayarlı Tomografi ve Ultrason Kullanımı Meme Kanseri Kemik metastazı bir Nude Rat Model Angiogenezis Multi-modal Görüntüleme

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Tıp

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

Sodyum Hyaluronat subretinal Enjeksiyon Kemirgenler Retina Dekolmanı Modeli

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

Hücre Takip için vivo 19 F MRG

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these diseases. Chronic retinal diseases such as retinal oedema or neovascularization usually require multiple intraocular injections to effectively treat the condition. However, the risks associated with these injections increase with repeated delivery of the drug. Therefore, alternative delivery methods need to be established in order to minimize the risks of reinjection. Several other investigations have developed methods to deliver drugs over extended time, through materials capable of releasing chemicals slowly into the eye. In this investigation, we outline the use of Elvax 40W, a copolymer resin, to act as a vehicle for drug delivery to the adult rat retina. The resin is made and loaded with the drug. The drug-resin complex is then implanted into the vitreous cavity, where it will slowly release the drug over time. This method was tested using 2-amino-4-phosphonobutyrate (APB), a glutamate analogue that blocks the light response of the retina. It was demonstrated that the APB was slowly released from the resin, and was able to block the retinal response by 7 days after implantation. This indicates that slow-release drug delivery using this copolymer resin is effective for treating the retina, and could be used therapeutically with further testing.

This paper details how Elvax 40W can be used as a slow-release method for drug delivery to the adult rat retina. The protocol for preparing, loading, and delivering the drug-resin complex to the eye is described.

Rat Retina için Elvax 40W ile yavaş salınımlı İlaç Dağıtım: Kronik Koşullar Tedavisinde Etkileri

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

Rahim içi Telemetri Fare Kontraktil Basıncını Ölçmek<em&gt; İn Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

İnsan Tümör ksenogratflarının gelen Fare Hücrelerinin tükenmesi Anlamlı Hedef Hücre Alt Analizi geliştirir

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No current animal models of diabetes and oxygen-induced retinopathy develop the full-range progressive changes manifested in human proliferative diabetic retinopathy (PDR). Therefore, understanding of the disease pathogenesis and pathophysiology has relied largely on the use of histological sections and vitreous samples in approaches that only provide steady-state information on the involved pathogenic factors. Increasing evidence indicates that dynamic cell-cell and cell-extracellular matrix (ECM) interactions in the context of three-dimensional (3D) microenvironments are essential for the mechanistic and functional studies towards the development of new treatment strategies. Therefore, we hypothesized that the pathological fibrovascular tissue surgically excised from eyes with PDR could be utilized to reliably unravel the cellular and molecular mechanisms of this devastating disease and to test the potential for novel clinical interventions. Towards this end, we developed a novel method for 3D ex vivo culture of surgically-excised patient-derived fibrovascular tissue (FT), which will serve as a relevant model of human PDR pathophysiology. The FTs are dissected into explants and embedded in fibrin matrix for ex vivo culture and 3D characterization. Whole-mount immunofluorescence of the native FTs and end-point cultures allows thorough investigation of tissue composition and multicellular processes, highlighting the importance of 3D tissue-level characterization for uncovering relevant features of PDR pathophysiology. This model will allow the simultaneous assessment of molecular mechanisms, cellular/tissue processes and treatment responses in the complex context of dynamic biochemical and physical interactions within the PDR tissue architecture and microenvironment. Since this model recapitulates PDR pathophysiology, it will also be amenable for testing or developing new treatments.

Here, we present a protocol to study the pathophysiology of proliferative diabetic retinopathy by using patient-derived, surgically-excised, fibrovascular tissues for three-dimensional native tissue characterization and ex vivo culture. This ex vivo culture model is also amenable for testing or developing new treatments.

Bir Ex Vivo doku kültürü modeli Fibrovascular komplikasyon proliferatif diyabetik retinopati

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

Preparation Of Gushukang (GSK) Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

Traditional Chinese herbal medicine plays a role as an alternative method in treating many diseases, such as postmenopausal osteoporosis (POP). Gushukang (GSK) granules, a marketed prescription in China, have bone-protective effects in treating POP. Before administration to the body, one standard preparation procedure is commonly required, which aims to promote the release of active constituents from raw herbs and enhance the pharmacological effects as well as therapeutic outcomes. This study proposes a detailed protocol for using GSK granules in in vivo and in vitro experimental assays. The authors first provide a detailed protocol to calculate the animal-appropriate dosages of granules for in vivo investigation: weighing, dissolving, storage, and administration. Second, this article describes protocols for micro-CT scanning and the measurement of bone parameters. Sample preparation, protocols for running the micro-CT machine and quantification of bone parameters were evaluated. Third, serum-containing GSK granules are prepared, and drug-containing serum is extracted for in vitro osteoclastogenesis and osteoblastogenesis. GSK granules were intragastrically administered twice per day to rats for three consecutive days. Blood was then collected, centrifuged, inactivated, and filtered. Finally, serum was diluted and used for performing osteoclastogenesis and osteoblastogenesis. The protocol described here can be considered a reference for pharmacological investigations of herbal prescription medicines, such as granules.

Preparation Of Gushukang GSK Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

This article provides a detailed protocol for preparing a working solution of Gushukang granules for animal studies and GSK granule containing serum for in vitro experiments. This protocol can be applied to pharmacological investigations of herbal medicines as well as prescriptions for both in vivo and in vitro experiments.

In vivo ve In vitro deneyler için Gushukang (GSK) granül hazırlanması

Traditional Chinese herbal medicine plays a role as an alternative method in treating many diseases, such as postmenopausal osteoporosis (POP). Gushukang ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic fatty liver disease, metabolic liver disease, and liver cancer) requires experimental manipulation of animal models and in vitro cell cultures. Both techniques have limitations, such as the requirement of large numbers of animals for in vivo manipulation. However, in vitro cell cultures do not reproduce the structure and function of the multicellular hepatic environment. The use of precision-cut liver slices is a technique in which uniform slices of viable mouse liver are maintained in laboratory tissue culture for experimental manipulation. This technique occupies an experimental niche that exists between animal studies and in vitro cell culture methods. The presented protocol describes a straightforward and reliable method to isolate and culture precision-cut liver slices from mice. As an application of this technique, ex vivo liver slices are treated with bile acids to simulate cholestatic liver injury and ultimately assess the mechanisms of hepatic fibrogenesis.

This protocol provides a simple and reliable method for the production of viable precision-cut liver slices from mice. The ex vivo tissue samples can be maintained under laboratory tissue culture conditions for multiple days, providing a flexible model to examine liver pathobiology.

Karaciğer Biyolojisi Ex Vivo Modeli olarak Murine Precision-Cut Karaciğer Dilimleri

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

Standardized Rat Coronary Ring Preparation and Real-Time Recording of Dynamic Tension Changes Along Vessel Diameter

As a key event of cardiovascular system diseases, coronary artery disease (CAD) has been widely regarded as the main culprit of atherosclerosis, myocardial infarction, and angina pectoris, which seriously threaten the life and health of people all over the world. However, how to record the dynamic biomechanical characteristics of isolated blood vessels has long puzzled people. Meanwhile, precise positioning and isolation of coronary arteries to measure in vitro dynamic vascular tension changes have become a trend in CAD drug development. The present protocol describes the macroscopic identification and microscopic separation of rat coronary arteries. The contraction and dilation function of the coronary artery ring along the vessel diameter was monitored using the established multi myograph system. The standardized and programmed protocols of coronary ring tension measurement, from sampling to data acquisition, tremendously improve the repeatability of the experimental data, which ensures the authenticity of vascular tension records after physiological, pathological, and drug intervention.

The present protocol describes the wire myograph technique for measuring vascular reactivity of the rat coronary artery.