Name: glaucoma-inducing procedure in an in vivo rat model and whole-mount retina preparation
Uploaded: 2016-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation at JoVE.com

C. Linn is supported by an NIH grant (NIH NEI EY022795).

hayvan denekleri kullanan tüm işlemler Western Michigan Üniversitesi&#39;nde Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) Enstitüsü standartlarına uygun olmuştur. 1. Hayvanlar <ol><li> Bu çalışmada, erkek ve dişi sıçanlarda 3 aylık kullanın. </li><li> yiyecek ve suya serbest erişim ile 12 saat ışık / karanlık döngüsünde hayvanları tutun. </li></ol> Hayvan Anestezi için KAX Kokteyli 2. Hazırlık <ol><li> 1 mi asepromazin (10 mg / ml) damıtılmış su, 3 ml ile 5 mi, ketamin (100 mg / ml) içinde ksilazin (20 mg / ml), 50 mg eritin. İyice karıştırın. </li><li> bir şırınga filtresi ile sterilize ve 10 mi, serum şişeye bu çözüm saklayın. </li></ol> 3. KAX Enjeksiyon <ol><li> hayvan (g) tartılır ve enjeksiyon için hazır olana kadar kafesin geri dönün. </li><li> 28 G iğne ile 1 ml insülin şırıngası kullanılarak, intraperitonal 0.1 mi KAX / 100 g hayvan vücut ağırlığına enjekte edilir. </li><li> İzin vermekhayvan için bilinçsiz olmak. ayak ve kuyruk kısma refleksleri kontrol edin. </li><li> Ameliyat süresince güvenle laboratuarında tüm hayvanları tutun. </li><li> Post-cerrahi, kafeslerine hayvanlar yerine ve bilinç sağlanıncaya kadar RT rahat tutun. Sadece hayvanlar uyandırmak zaman hayvan tesisine hayvanları dönmek ve normal davranış devam edin. </li></ol> Cerrahi ve Microneedle Meclisi 4. Hazırlık <ol><li> Steril 2 M NaCl çözeltisi olun. </li><li> İki ince konik cam microneedles (Şekil 1D, Şekil 1E) içine bir 0.86 mm iç çap ağır cilalı standart ve ince duvarlı borosilikat tüp çekmek için bir mikroelektrot çektirmesi (Şekil 1C) kullanın. </li><li> 2 M tuz, bir dolgu şırınga iğnesi ve 1 ml şırınga (Şekil 1B) kullanılarak önceki adımda elde edilen bir mikroiğne Dolgu. elektrot ucu hava kabarcıklarını dışarı dokunun. </li><li> 2 M ile ikinci 1 ml şırınga doldurunNaCI ile yıkanmıştır. 18 G iğne bağlayın ve sonra polietilen boru (Şekil 1A) bir uzunluğa (yaklaşık 10 inç) ekleyin. iğne ile tuzlu su ile polietilen boru doldurmak için şırınga pistonu kullanın. </li><li> microneedle ve tüp hem de tuzlu su ile dolu olduğunda, dikkatli bir şekilde birbirine bağlamak. Aralarında bağlantı (Şekil 2) herhangi bir havayı ortadan kaldırın. </li><li> İnce bir ders kağıt havlu tahıl karşı çok hafifçe kazıyarak Mikroiğnenin ucu konik. </li><li> yavaşça sıvının ince bir dere kağıt havlu üzerine görülebilir kadar şırınga pistonu iterek Mikroiğnenin direncini kontrol ediniz. sıvı akıntısı 0.5 mm daha büyük olmalıdır. </li></ol> Animal 5. hazırlanması <ol><li> 2 damla kornea topikal anestetik (Proparakain hidroklorür Oftalmik Solüsyon USP,% 0.5) - 1 uygulayın. Hiçbir göz refleks oluşuncaya kadar bekleyin. </li><li> makasla bıyıkları kesin. </li><li> SDeneysel göz çevresinde betadin çözüm ve çubukla alanına sahip bir pamuk uçlu aplikatör aturate. </li><li> Bir mikroskop kullanarak, göz şişkinliği Episkleral ven ortaya çıkarmak ve göz hareketi kısıtlamak için alt göz kapağı kelepçe bir hemostat ekleyin. (Şekil 3, ok başı) </li></ol> 6. Glokom uyaran Tuzlu Enjeksiyon <ol><li> microneedle montaj ve hayvan hazırlandıkları zaman, enjeksiyon başlar. </li><li> Hayvan ayak / kuyruk tutam tepkisiz olması teyit edildiğinde, dikkatlice ven (Şekil 3, beyaz ok) 10 ve 20 derece arasında düşük bir açıda gelerek microneedle ile Episkleral ven delin. Kan mikroiğne (Şekil 3, siyah ok) ucu girer damar içine başarılı bir lastik belirgindir. </li><li> Yavaş ve el damar içine yaklaşık 50 ul tuzlu su enjekte edilir. Bu, yaklaşık 10 sn almalıdır. Damarlar olacak tuz uçtan bir uca dolaşır olarak mazur beyazugh damar (Şekil 4, ok başı). Bazı bölgeler kan kırmızı bir görünüm (Şekil 4, ok) muhafaza edebilir. <ol><li> tam retina ganglion hücre tabakası tam retina hasarı sağlamak için, karşısındaki ilk site, damar içine ikinci bir enjeksiyon gerçekleştirin. Not: Tuz damar sistemi aracılığıyla dolaşır olarak dakika içinde, bir gözün iris yoluyla ayrı bir bulutlu bir görünüm görmelisiniz. </li></ol></li><li> Bir iç kontrol olarak kullanılmak üzere muamele edilmemiş karşı gözü terk. </li></ol> 7. Hayvan Kurtarma <ol><li> hemostat çıkarın. </li><li> hemostatla tarafından ve enjeksiyon sitelere kenetlenmiş siteye üçlü antibiyotik merhem (basitrasin çinko, neomisin sülfat, polymysin B sülfat) uygulamak için bir pamuk aplikatör kullanın. Göz çevresinde doku hasarı hemostat kullanarak oluşmaz. </li><li> &gt; Bir dolaşan sıcak su battaniye kafeslerine Place anestezi hayvanların prev içinent hipotermi. bilinç ve normal bir davranış kazanmış kadar gözlem altında hayvanları tutun. geri hayvan koloniye uyanık hayvan taşıyın. Hayvanlar kurban zamanına kadar koloni kalır. </li></ol> 8. Hayvan Kurban ve Retina Kaldırma <ol><li> Glokom ikna etmek için prosedürü izleyerek Bir ay, hayvanlar CO 2 boğulma ve ikincil göğüs ponksiyon ile ötenazi. <ol><li> odasında hayvan koyun ve güvenli kapağı koydu. </li><li> % 20 hacmi / dk CO 2 deplasman izin CO 2 ve gaz regülatörü vanaları açın odasındaki oksijen. </li><li> Hayvan sona erecek dört ila 5 dakika bekleyin. </li><li> Her iki vanaları kapatın. </li><li> odasından gelen hayvan çıkarın ve steril bir bisturi ile ikincil göğüs delik gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Ötenazi sonra, göz, bei çevreleyen orbita boşluğuna bağ dokusu kesmek için bir neşter kullanabilirsinizng dikkatli küresi kendi içine kesmek için değil. </li><li> Dikkatle sağlam gözü ayıklamak için optik siniri ve kalan doku kesmek için kavisli kenar makas kullanın. Taze PBS içeren steril bir 60 mm x 15 mm atılabilir bir petri ekstre gözün yerleştirin. </li><li> göz küresi bir göz yuvasını yapın. Bunu yapmak için, neşter ile küçük bir kesi sadece iris ve sklera arasındaki sınır posterior olun. göz küresi kornea yarımkürede kaldırmak için küçük yaylı makas ile göz çevresine bu kesi izleyin. optik sinir bağlı hemisfer kalır. </li><li> ötenazi hayvandan Göz yuvası içinde çok ince pembe / bej retina bulun. Göz yuvası stabilize etmek için körleşmiş forseps ile retinanın pigmentli tabakası tutun. çok yavaşça gözün arka kapalı bütün dokunulmamış retina kızdırmak için kapalı forseps başka bir çift kullanın. , Kısma çekerek, ya da doğrudan retinaya asılarak kaçının. </li><li> kesmek için küçük yaylı makas kullanınOptik sinir hala retinaya bağlı olduğu alan. </li><li> retinadan herhangi bir kalıntı pigment epitel ya da skleral doku kesip emin olun. </li><li> Bir transfer pipet kullanarak, çok yavaşça taze PBS içeren 35 mm x 10 mm petri kaplı temiz bir sylgard izole retina aktarın. </li></ol> 9. Tüm Montaj Retina Hazırlık <ol><li> Bir kez Sylgard çanak, yerinde retina pin forseps ve bir kaktüs iğne kullanın. yukarı bakacak şekilde retina ganglion hücre tabakası tutun ve aşağı optik sinir. retinanın yarım küre şekli bile tespit sonrasında dikkat çekicidir. retinal ganglion hücre tabakası arzu edilen bir doğrultuda olduğunda retina kavis tavana doğru kıvrılmasına olacaktır. </li><li> optik sinir başı yayılan dört yapraklı yonca şeklini verme, dört parçaya bölünür retina kesmek için küçük bir makas kullanın. </li><li> Mümkün witho olarak retina gibi düz hale getirmek için ek kaktüs iğne ile retina kadran pingerme ut (Şekil 5). </li><li> % 4 paraformaldehid O / oda sıcaklığında N 3 ml Sylgard çanak tutturulmuş retina sabitleyin. </li></ol> Retina 10. Antikor Boyama Not: Birincil ve ikincil antikorlar ile Leke sabit retina retina (Şekil 6) nöronların görüntüleme için. <ol><li> PBS içinde sabit, düz monte retina 2 dakika boyunca üç kez yıkayın. </li><li> 60 dakika boyunca PBS içinde% 1 fetal bovin serumu ile% 1 Triton X-100 ile retina geçirgenliği. </li><li> Durulama PBS içinde üç kez 2 dakika her biri, retina. </li><li> PBS içinde% 0.1 Triton X-100, yıkama başına 5 dakika ile iki kez yıkayın. </li><li> PBS yıkama başına 5 dakika ile iki kez yıkayın. </li><li> 45 dakika boyunca oda sıcaklığında PBS içinde% 1 Triton X-100 ve% 1 fetal inek serumu ile inkübe edin. </li><li> PBS içinde% 0.1 Triton X-100, yıkama başına 5 dakika ile iki kez yıkayın. </li><li> PBS yıkama başına 5 dakika ile iki kez yıkayın. </li><li> PBS içinde 3 mi% 1 fetal inek serumu, her retina inkübesaflaştırılmış fare anti-fare CD90 / fare CD90.1 (1: 300 seyreltme) O / oda sıcaklığında N. </li><li> 5 dakika boyunca PBS içinde% 0.1 Triton X-100 ile bir kez retina durulayın. </li><li> PBS yıkama başına 5 dakika ile iki kez yıkayın. </li><li> İkincil Alexa Fluor 594 keçi anti-fare IgG&#39;si ile 3 ml PBS (Resim FBS) her bir retina inkübe (1: 300) O / oda sıcaklığında N. </li><li> liberal PBS ile retina yıkayın. </li><li> Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak dikkatli bir şekilde retinanın kaktüs iğneleri çıkarın. </li><li> Yavaşça bir transfer pipet yardımıyla mikroskop lamı üzerine retina aktarın. tavana bakacak şekilde retina ganglion hücre tabakası ile yönünü korumak için emin olun. retinanın yarım küre şekli bile tespit sonrasında dikkat çekicidir. retinal ganglion hücre tabakası arzu edilen bir doğrultuda olduğunda retina kavis tavana doğru kıvrılmasına olacaktır. </li><li> KimWipe ya da diğer emici madde ile herhangi bir aşırı PBS emer. retina emmek için dikkatli olun. </li><li> ½ gliserol 5 damla ilave edin ve am ağırlık olarak PBS ½tutarlı medya. </li><li> hava kabarcıkları kaçınarak, lamel ile retina örtün. </li><li> net oje, tutkal veya başka bir yapıştırıcı kullanarak güvenli lamel. </li></ol>

The authors have no conflicting or competing interests to disclose.

Bu protokol, bir in vivo sıçan modelinde glokom gibi koşulların oluşturulması için bir yöntem tarif eder. Bu prosedür 29, 32. Skar dokusu geliştirilmesi ön kamarada basıncı artar sulu mizah çıkışı tıkar trabeküler ağda yara izi ikna etmek için hipertonik salin enjeksiyonu kullanır. azalmış çıkış ve basınç kurmak ile, elastik ligaman tarafından askıya objektif geri vitreus odasına iter. Vitreus mizah sonra kırılgan retina nöronlar zarar retina üzerine basınç uyg...

Glokom özel olarak ise, retinal ganglion hücre 1-2, retina nöronlarını etkileyenler göz hastalıklarının grubudur. Bu hücrelerin aksonları vizyon algılanan beyine görsel bilgileri taşıyan optik sinir olmaya birleşir. RGCs ve akson hasar dolayısıyla görsel kusurları neden olur. glokom bozuklukları ile ilişkili birincil özellikler RGC dejenerasyonu ve ölümü, artan göz içi basıncı (GİB) ve optik diskin çukurluğu ve atrofi vardır. Bu özellikler görme alanı kaybı ya da tam geri dönüşü olmayan körlüğe yol açar. Şu anda, glokom, dünya çapında 70 milyon insanın 3 körlük neden olmuştur. Bunun gibi, körlük 4 dünyanın en büyük üçüncü nedenidir. Glokom RGC kesin ölüm mekanizması bilinmemektedir. Çok araştırma gizem kilidini açmak için yapılmıştır. Glokom birincil risk faktörü bir artış i Bununla birlikte, bilinennedeniyle gözün ön kamarasında sulu mizah (AH) düzensiz dolaşımına n göz içi basıncı. AH gözün avasküler ön kamara kan saydam ve renksiz bir yedek olarak işlev görür. Bu, çevredeki hücreleri besler metabolik süreçler salgılanan atık ürünler kaldırır, nörotransmitter nakil ve patolojik devletlerin 1 sırasında uyuşturucu ve gözün içinde inflamatuar hücrelerin dolaşımını sağlar. Sulu mizah dolaşım bakım siliyer cisim ve trabeküler ağı içerir. Sulu mizah siliyer cisim tarafından üretilir. Daha sonra göz dokusunun genel sağlığını korumak için ön kamaraya akar. 75 - Sıvı siliyer kasta süngerimsi doku üç katmandan süzülür zaman sulu mizah çıkışı% 80 aktif olmayan pigment siliyer epitel içinden salgılanır. trabeküler ağ yoluyla ve hangi satınalmada öncelikli Schlemm Kanalı aracılığıyla sıvı çıkar20 Kalan kan sistemi 5 hayranlarıyla içine ler - çıkışı% 25 trabeküler ağı atlar ve pasif uveo-skleral yolu ile ultrafiltrasyon ve difüzyon tarafından salgılanır. Bu yol göz içi basıncı 1 nispeten bağımsız olduğu görülmektedir. aköz üretimi ve çıkış dengesi olduğunda, basınç gözün içindeki kurar. Belirtildiği gibi, göz içi basıncının bu artış glokom gelişiminde en önemli risk faktörüdür. Bu baskı, gözün arkasındaki retina nöronlarının karmaşık tabakalar hasara neden olur. optik sinir retina ganglion hücre aksonları hasar artık doğru bir görsel bilgi almak için beyin neden olur. Bunun bir sonucu olarak, görüş algılama kaybolur ve tam körlük olabilir. Bugüne kadar, glokom için tedavisi yoktur. Farklı tedavi yöntemleri öncelikle göz içi basıncını azaltmak amacı vardır. Bu harici,Bu beta1-adrenerjik reseptör blokerleri, ya da topik prostaglandin analogları olarak ilaç sınıfları. Beta blokerler sulu mizah 7 üretimini azaltarak göz içi basıncını azaltır. Prostaglandinler sulu mizah 8-14 akışını artırarak GİB&#39;in azaltmak için çalışır. Alfa adrenerjik agonistler, karbonik anhidraz inhibitörleri, aynı zamanda tedavi ikincil yöntem olarak kullanılmaktadır. Alfa adrenerjik agonistler uveoskleral yolunun 15-17 ile çıkışı artar. Karbonik anhidraz inhibitörleri enzimatik inhibisyon 18 ile AH üretimini azaltır. Çok daha invaziv girişimler aynı zamanda glokom tedavisinde kullanılmaktadır. Lazer trabeküloplasti sulu mizah 19 çıkış artırmak için kullanılır. Trabekülektomi adlı başka bir cerrahi tedavi, geleneksel trabeküler yolu 20-21 bloke olduğunda AH filtrelemek için alternatif bir drenaj sitesi oluşturur. Bu tedavi seçenekleri eff bilinmektedirectively Göz içi basıncını düşürmek. Ancak, glokom hastalarının% 40&#39;a varan daha tam tedavi yöntemleri için bir ihtiyaç gösteren, normal GİB göstermektedir. 22,23 Ek olarak başlar ve güncel tedaviler hastalığın ilerlemesini bitmiyor kez glokom görülen retina ganglion hücre ölümü geri döndürülemez 24-28. Bu nöronların kendilerini hayatta hedefleyen etkili nöroprotektif tedaviler gerekliliğini göstermiştir. glokom modellerinin geliştirilmesi, bu gelişimi için çok önemlidir. Bu çalışmada, ilk olarak Morrison 29 ile belirtilen bir tadil edilmiş bir prosedür kullanılarak, yetişkin Long Evans sıçanlarda glokom gibi etkileri başlatmak için bir yöntem gösteriyorlar. Bu prosedürde, episkleral venöz pleksus içine 2 M hipertonik salin enjeksiyonları göz içi basınç artışı ve RGCs önemli bir kayıp w yol açan trabeküler ağda sulu mizah çıkışı azaltmak için doku yara izi ile glokom gibi koşullar indüklerprosedür 30-31 bir ay ithin. Böyle Burada anlatılan biri olarak Glokom uyaran prosedürleri, glokom tedavisinde yeni gelişmeler çözmenin anahtarı olabilir.

<table><tbody><tr><td>Xylazine hydrochloride, Minimum 99%</td><td>Sigma, Life Science</td><td>X1251-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/ml&amp;nbsp;</td><td>Putney, Inc</td><td>NDC 26637-411-01</td><td>10 ml bottle</td></tr><tr><td>Acepromazine Maleate, 10mg/ml</td><td>Phoenix Pharmaceutical, Inc</td><td>NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408</td><td>50 ml bottle</td></tr><tr><td>Serum bottle, 10 ml</td><td>VWR</td><td>16171319</td><td>Borosilicate glass</td></tr><tr><td>1 ml insulin syringe&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>BD329410</td><td>28 G needle&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>S7653</td><td>2 M Solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microelectrode Puller&amp;nbsp;</td><td>Narishige Group</td><td>PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-86-10HP</td><td>without filament, 0.86 mm</td></tr><tr><td>Microfil syringe needle for filling micropipettes</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>MF28G</td><td></td></tr><tr><td>18 gauge Luer-Lock needle</td><td>Fisher Scientific</td><td>1130421</td><td>Syringe needle</td></tr><tr><td>Flexible Polyethylene Tubing</td><td>Fisher Scientific</td><td>22046941</td><td>0.034 inch diameter, approximately 10 inches&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5%</td><td>Akorn, Inc</td><td>NDC 17478-263-12</td><td>15 ml&amp;nbsp; sterile bottle&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Curved Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>StereoZoom 4</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat Clamp&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>1310912</td><td>curved edge</td></tr><tr><td>Triple Antibiotic Ointment&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0664481</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel handle</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blade #11</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish</td><td>VWR</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate</td><td>Sigma, Life Science&amp;nbsp;</td><td>P7059-1L</td><td>1x dilution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>Forceps (2), Dumont # 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Transfer Pipets, polyethylene, non sterile</td><td>BD Biosciences</td><td>357524 or 52947-948</td><td>1 and 2 ml graduations</td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td></td></tr><tr><td>Cactus Needles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>EMD Millipore&amp;nbsp;</td><td>PX0055-3 or 818715.0100</td><td>Made into a 4% solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>T9284-100 ml</td><td>Made into both a 1% and 0.1% solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Atlanta Biological</td><td>S11150</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1</td><td>BD Pharmingen</td><td>Cat 554892</td><td>1:300 dilution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 goat anti-mouse&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>A11005</td><td>1:300 dilution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>G5516-100 ml&amp;nbsp;</td><td>50% glycerol to 50% PBS, by weight&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Coverglass&amp;nbsp;</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>2975-225</td><td>Thickness 1 22 x 50 mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>C2 Eclipse Ti</td><td></td></tr></tbody></table>

glaucoma-inducing procedure in an in vivo rat model and whole-mount retina preparation

Glokom, retinal bez hücrelerin (RGCs) etki eden, merkezi sinir sisteminin bir hastalığıdır. optik sinir oluşturan RGC aksonlar görsel algı için beyne görsel girdi taşırlar. RGCs ve akson hasar görme kaybı ve / veya körlüğe yol açar. glokom spesifik nedeni bilinmemekle birlikte, hastalığın birincil risk faktörü yüksek bir göz içi basıncı. hayvan modellerinde Glokom uyaran prosedürler RGC ölüm mekanizmasını çalışan araştırmacılar için değerli bir araçtır. Bu tür bilgiler görme kaybının önlenmesinde yardımcı olabilir etkili bir nöro-koruyucu tedavilerin geliştirilmesine yol açabilir. 2 M hipertonik salin 50 ul episkleral venöz pleksus enjekte edilir, bir in vivo sıçan modelinde koşulları gibi - bu yazıda protokolü glokom teşvik etmek için bir yöntem tarif eder. damarların Ağartma başarılı bir enjeksiyon gösterir. Bu prosedür glokom simüle etmek için RGCs kaybına neden olur. takip eden bir ayenjeksiyonu, hayvanlar kurban edilmiş ve gözler uzaklaştırılır. Sonraki, kornea, lens ve vitreus bir göz yuvasını yapmak için kaldırılır. Retina sonra gözün arka soyulmuş ve kaktüs iğneler kullanılarak Sylgard yemekleri üzerine tutturulmuş. Bu noktada, retina nöronlarının analizi için boyandı. Bu laboratuvarda elde edilen sonuçlar iç kontroller ile karşılaştırıldığında RGCs yaklaşık% 25&#39;i prosedürü bir ay içinde kaybolur olduğunu göstermektedir. Bu prosedür, bir in vivo sıçan glokom modelinde retinal ganglion hücresi ölümü kantitatif analizi sağlar.

Bu bölüm, bir in vivo sıçan glokom modelinde glokom gibi koşullar uyarılması için kullanılan aygıt bileşenlerini ve prosedürü görüntülemektedir. Biz göz içi basıncı bir artışa neden bir hipertonik salin enjeksiyonu gerçekleştirmek için kullanılan bireysel araç ve gereçleri gösterir. Biz onun karakteristik haşlama etkisi ve sonuçları ön kamara bulutlu görünümü ile episkleral venöz pleksus içine enjeksiyon göstermektedir. Biz de retina kald?...

Watch this Scientific Journal Video about Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation at JoVE.com

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Glokom uyaran bir de Prosedürü<em&gt; İn Vivo</em&gt; Rat Modeli ve Tüm montaj Retina Hazırlık

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

glaucoma-inducing-procedure-an-vivo-rat-model-whole-mount-retina

Research

JoVE Journal

Medicine

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

13.0K Görüntüleme.  Western Michigan University. Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis. 

Video: Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for immunohistochemistry and, 2) calcium imaging for the study of voltage gated calcium channel (VGCC) mediated calcium signaling in retinal ganglion cells. The calcium imaging method we describe circumvents issues concerning non-specific loading of displaced amacrine cells in the ganglion cell layer.

Immunohistochemistry protocols are used to study the localization of a specific protein in the retina. Calcium imaging techniques are employed to study calcium dynamics in retinal ganglion cells and their axons.

Wholemount Sıçan Retina Immunohistochemical ve Kalsiyum Görüntüleme Yöntemleri

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

Nörobilim

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are an emerging treatment for photoreceptor degenerative diseases that seek to restore vision by artificially stimulating the surviving retinal neurons in the hope of eliciting comprehensible visual perception in patients. Current retinal prostheses have demonstrated success in restoring limited vision to patients using an array of electrodes to electrically stimulate the retina but face substantial physical barriers in restoring high acuity, natural vision to patients. Chemical neurostimulation using native neurotransmitters is a biomimetic alternative to electrical stimulation and could bypass the fundamental limitations associated with retinal prostheses using electrical neurostimulation. Specifically, chemical neurostimulation has the potential to restore more natural vision with comparable or better visual acuities to patients by injecting very small quantities of neurotransmitters, the same natural agents of communication used by retinal chemical synapses, at much finer resolution than current electrical prostheses. However, as a relatively unexplored stimulation paradigm, there is no established protocol for achieving chemical stimulation of the retina in vitro. The purpose of this work is to provide a detailed framework for accomplishing chemical stimulation of the retina for investigators who wish to study the potential of chemical neuromodulation of the retina or similar neural tissues in vitro. In this work, we describe the experimental setup and methodology for eliciting retinal ganglion cell (RGC) spike responses similar to visual light responses in wild-type and photoreceptor-degenerated wholemount rat retinas by injecting controlled volumes of the neurotransmitter glutamate into the subretinal space using glass micropipettes and a custom multiport microfluidic device. This methodology and protocol are general enough to be adapted for neuromodulation using other neurotransmitters or even other neural tissues.

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

This protocol describes a novel method for investigating a form of chemical neurostimulation of wholemount rat retinas in vitro with the neurotransmitter glutamate. Chemical neurostimulation is a promising alternative to the conventional electrical neurostimulation of retinal neurons for treating irreversible blindness caused by photoreceptor degenerative diseases.

Biomimetic kimyasal Neuromodulation, sıçan retina nörotransmitter Glutamat Vitro ile için metodoloji

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are ...

Biyomühendislik

A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial neurodegenerative disease. With the advent of numerous transgenic mouse lines, there is increasing interest in inducible murine models of ocular hypertension. Here, we present an occlusion model of glaucoma based on the injection of magnetic microbeads into the anterior chamber of the eye using a modified microneedle with a facetted bevel. The magnetic microbeads are attracted to the iridocorneal angle using a handheld magnet to block the drainage of aqueous humour from the anterior chamber. This disruption in aqueous dynamics results in a steady elevation of intraocular pressure, which subsequently leads to the loss of retinal ganglion cells, as observed in human glaucoma patients. The microbead occlusion model presented in this manuscript is simple compared to other inducible models of glaucoma and also highly effective and reproducible. Importantly, the modifications presented here minimize common issues that often arise in occlusion models. First, the use of a bevelled glass microneedle prevents backflow of microbeads and ensures that minimal damage occurs to the cornea during the injection, thus reducing injury-related effects. Second, the use of magnetic microbeads ensures the ability to attract most beads to the iridocorneal angle, effectively reducing the number of beads floating in the anterior chamber avoiding contact with other structures (e.g., iris, lens). Lastly, the use of a handheld magnet allows flexibility when handling the small mouse eye to efficiently direct the magnetic microbeads and ensure that there is little reflux of the microbeads from the eye when the microneedle is withdrawn. In summary, the microbead occlusion mouse model presented here is a powerful investigative tool to study neurodegenerative changes that occur during the onset and progression of glaucoma.

Here, we present a protocol to induce ocular hypertension in the murine eye that results in the loss of retinal ganglion cells as observed in glaucoma. Magnetic microbeads are injected into the anterior chamber and attracted to the iridocorneal angle using a magnet to block the outflow of aqueous humour.

Bir Manyetik microbead Oklüzyon Modeli Farelerde Glokom Oküler Hipertansiyon Bağımlı tetikleyebilecek

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial ...

Tıp

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy (rNAION)

Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) is a focal ischemic lesion of the optic nerve that affects 1/700 individuals throughout their lifetime. NAION results in optic nerve edema, selective loss of the retinal ganglion cell neurons (RGCs) and atrophy of the optic nerve. A rodent model of NAION that expresses most NAION features and sequelae has been developed, which is applicable to both rats and mice. This model utilizes a focal laser application of 532 nm wavelength to illuminate a photoactive dye, Rose Bengal (RB), to cause capillary damage and leakage at the targeted anterior optic nerve (the laminar region). After rNAION induction, there is an early optic nerve ischemia, optic nerve edema, and intraneural inflammation, followed by selective RGC and axonal loss. Since the optic nerve is a CNS white matter tract, the rNAION model is applicable to mechanistic studies of selective white matter ischemia, as well as neuroprotective analyses and short and long-term mechanisms of glial and neuronal response to ischemia.

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy rNAION

The following report describes how to replicate the rodent model of nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (rNAION), using the appropriate dye, contact lens and laser parameters. We also reveal the appropriate steps for evaluating the rNAION lesion in vivo.

Nonarteritik Anterior İskemik Optik Nöropati Kemirgen Modeli (rNAION)

Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) is a focal ischemic lesion of the optic nerve that affects 1/700 individuals throughout their ...

A Model of Glaucoma Induced by Circumlimbal Suture in Rats and Mice

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known risk factor for glaucoma. This protocol demonstrates a step-by-step guide on this technique in Long Evans rats and C57BL/6 mice. Under general anesthesia, a "purse-string" suture is applied on the conjunctiva, around the equator and behind the limbus of the eye. The fellow eye serves as an untreated control. Over the duration of our study, which was a period of 8 weeks for rats and 12 weeks for mice, IOP remained elevated, as measured regularly by rebound tonometry in conscious animals without topical anesthesia. In both species, the sutured eyes showed electroretinogram features consistent with preferential inner retinal dysfunction. Optical coherence tomography showed selective thinning of the retinal nerve fiber layer. Histology of the rat retina in cross-section found reduced cell density in the ganglion cell layer, but no change in other cellular layers. Staining of flat-mounted mouse retinae with a ganglion cell specific marker (RBPMS) confirmed ganglion cell loss. The circumlimbal suture is a simple, minimally invasive and cost-effective way to induce ocular hypertension that leads to ganglion cell injury in both rats and mice.

Chronic ocular hypertension is induced by applying a circumlimbal suture in rats and mice, leading to functional and structural deterioration of the retinal ganglion cells consistent with glaucoma.

Manken Circumlimbal dikiş sıçanlar ve fareler tarafından indüklenen glokom

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known ...

Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic nerve and retinal ganglion cell (RGC) degeneration, resulting in visual dysfunction by interrupting the transmission of visual information from the eye to the brain. Elevated intraocular pressure is the most important risk factor; thus, several models of ocular hypertension have been developed in rodents by either genetic or experimental approaches to investigate the causes and effects of the disease. Among those, some limitations have been reported such as surgical invasiveness, inadequate functional assessment, requirement of extensive training, and highly variable extension of retinal damage. The present work characterizes a simple, low-cost, and efficient method to induce ocular hypertension in rodents, based on low-temperature, full-circle cauterization of the limbal vascular plexus, a major component of aqueous humor drainage. The new model provides a technically easy, noninvasive, and reproducible subacute ocular hypertension, associated with progressive RGC and optic nerve degeneration, and a unique post-operative clinical recovery rate that allows in vivo functional studies by both electrophysiological and behavioral methods.

The goal of this protocol is to characterize a novel model of glaucomatous neurodegeneration based on 360&#176; thermic cauterization of limbal vascular plexus, inducing subacute ocular hypertension.

Kemirgenlerde Cerrahi Olarak İndüklenen Glokom için Limbal Vasküler Pleksusun Tam Daire Koterizasyonu

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic ...

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal detachment, breakdown of the blood-retinal barrier (BRB), and retinal angiogenesis. An in vivo rat model is a valuable experimental tool to examine the changes in the structure and function of the retina. We propose three different experimental techniques in the rat model to identify morphological changes of retinal cells, retinal vasculature, and compromised BRB. Retinal histology is used to study the morphology of various retinal cells. Also, quantitative measurement is performed by retinal cell count and thickness measurement of different retinal layers. A BRB breakdown assay is used to determine the leakage of extraocular proteins from the plasma to vitreous tissue due to the breakdown of BRB. Fluorescence angiography is used to study angiogenesis and leakage of blood vessels by visualizing retinal vasculature using FITC-dextran dye.

Diabetic retinopathy is one of the leading causes of blindness. Histology, blood-retinal barrier breakdown assay, and fluorescence angiography are valuable techniques to understand the pathophysiology of the retina, which could further enhance the efficient drug screening against diabetic retinopathy.

Sıçan Modelinde Retinal Patofizyolojik Değerlendirme

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular pericytes are central to ophthalmological research. It is vital to choose an appropriate method of visualizing the microvascular pericytes. We describe retinal microvascular pericyte immunohistochemical staining in cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature using antibodies for platelet-derived growth factor receptor &#946; (PDGFR&#946;) and nerve/glial antigen 2 (NG2). This allows us to highlight advantages and shortcomings of each of the three tissue preparations for the visualization of the retinal microvascular pericytes. Cryo-sections provide transsectional visualization of all retinal layers but contain only a few occasional transverse cuts of the microvasculature. Whole-mount provides an overview of the entire retinal vasculature, but visualization of the microvasculature can be troublesome. Hypotonic isolation provides a method to visualize the entire retinal vasculature by the removal of neuronal cells, but this makes the tissue very fragile.

We demonstrate three different tissue preparation techniques for immunohistochemical visualization of rat retinal microvascular pericytes, i.e., cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolation of the vascular network.

Retina Cryo-kesitler, Bütün bağlar ve mikrovasküler perisitlerden immunohistokimyasal görselleştirme hipotonik izole damarlara hazırlıkları

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular ...

Biyoloji

Transconjunctival Approach for Injection into the Rat Optic Nerve

The rat serves as an important model for studying disorders of the optic nerve, including heritable, traumatic, neoplastic, and autoimmune conditions. Accessing the rat optic nerve for experimental manipulations and injections is challenging due to the small size of the orbit and the vascularity of the surrounding orbital tissues. Previous techniques have involved a cutaneous incision, which carries a higher risk of infection and requires wound closure. This study aims to describe a unique, less invasive, and potentially more efficient approach to accessing the rat optic nerve. A transconjunctival incision, along with a rat spinal cord hook, is used to isolate the optic nerve for experimental injections. In these experiments, an adenoviral vector is injected into the optic nerve with the goal of using this technique for direct gene therapy delivery in the future. This technique can also be applied by investigators requiring access to the rat optic nerve for other experimental studies, including drug delivery and optic nerve injury research.

This protocol describes a unique technique using a transconjunctival approach to access the rat optic nerve for injections.

Sıçan Optik Sinirine Enjeksiyon için Transkonjonktival Yaklaşım

The rat serves as an important model for studying disorders of the optic nerve, including heritable, traumatic, neoplastic, and autoimmune conditions. ...

A Hypertonic Saline Injection Technique for Inducing Glaucoma in Rats

Source: Gossman, C. A. et al. <a href="https://app.jove.com/v/53831">Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates glaucoma induction in an anesthetized rat by injecting hypertonic saline into the episcleral vein. The saline enters the trabecular meshwork via Schlemm&#39;s canal, causing tissue scarring, which blocks aqueous humor outflow and raises intraocular pressure. The elevated pressure damages retinal ganglion cells, leading to glaucoma.

Sıçanlarda Glokomu İndüklemek için Hipertonik Salin Enjeksiyon Tekniği

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

Glokom uyaran bir de Prosedürü

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler