C. Linn is supported by an NIH grant (NIH NEI EY022795).

Todos os procedimentos que utilizam indivíduos animais têm sido de acordo com as normas do Institute of Animal Care e Use Committee (IACUC) na Western Michigan University. 1. Os animais <ol><li> Utilizar ratos do sexo masculino e feminino de 3 meses de idade no presente estudo. </li><li> Manter os animais em um 12 hr ciclo de luz / escuro, com livre acesso a comida e água. </li></ol> 2. Preparação de KAX Cocktail para anestesia animal <ol><li> Dissolve-se 50 mg de xilazina (20 mg / ml) em 5 ml de cetamina (100 mg / ml) com 1 ml de acepromazina (10 mg / ml) e 3 ml de água destilada. Homogeneizar. </li><li> Esterilizar com um filtro de seringa e armazenar desta solução para um frasco de soro de 10 ml. </li></ol> 3. Injeção KAX <ol><li> Pesar animais (g) e de regresso ao compartimento até que esteja pronto para a injecção. </li><li> Injectar 0,1 mL KAX / 100 g de peso corporal do animal intraperitonealmente, utilizando uma seringa de insulina de 1 ml com uma agulha de 28 g. </li><li> Permitirpara animal a ficar inconsciente. Verifique reflexos por beliscar os pés e cauda. </li><li> Mantenha todos os animais de forma segura em laboratório para a duração da cirurgia. </li><li> Pós-cirurgia, substituir animais em suas jaulas e manter confortável em RT até que a consciência é recuperada. retornar apenas animais para a instalação de animal quando os animais despertar e retomar o comportamento normal. </li></ol> 4. Preparação para a cirurgia e Montagem Microneedle <ol><li> Adicione uma solução 2 M de NaCl estéril. </li><li> Use um extrator de microeletrodos (Figura 1C) para puxar um diâmetro interno de 0,86 mm padrão polido pesado e fino tubo de borosilicato murada em duas microagulhas de vidro finamente cônicos (Figura 1D, Figura 1E). </li><li> Backfill uma micro-agulha do passo anterior com 2 M de soro fisiológico usando uma agulha de seringa de aterro e uma seringa de 1 ml (Figura 1B). Toque as bolhas de ar a partir da ponta do eletrodo. </li><li> Encha uma segunda seringa de 1 ml com 2 MNaCl. Ligue uma agulha G 18 e, em seguida, anexar um comprimento (aproximadamente 10 polegadas) de tubo de polietileno (Figura 1A). Utilizar o êmbolo da seringa para encher o tubo de polietileno com uma solução salina através da agulha. </li><li> Quando tanto a micro-agulha e o tubo são cheios com uma solução salina, ligar cuidadosamente os dois. Eliminar qualquer ar na ligação entre os mesmos (figura 2). </li><li> Finamente bisel a ponta do microneedle raspando muito levemente contra o grão de uma toalha de papel claro. </li><li> Verificar a resistência da micro-agulha empurrando suavemente o êmbolo da seringa até um bom fluxo de líquido pode ser visto na toalha de papel. O fluxo de líquido não deve ser maior do que 0,5 mm. </li></ol> 5. Preparação de animais <ol><li> Aplicar 1 - 2 gotas de anestésico tópico à córnea (Anestalcon Solução Oftálmica, USP, 0,5%). Espere até que não ocorra nenhum reflexo ocular. </li><li> Aparar bigodes com uma tesoura. </li><li> Saturate um aplicador de ponta de algodão com solução de betadine e área de cotonete ao redor do olho experimental. </li><li> Usando um microscópio, anexar uma pinça hemostática para apertar a pálpebra inferior a protuberância do olho, expor a veia episcleral e restringir o movimento dos olhos. (Figura 3, seta) </li></ol> 6. Injecção salina de indução de glaucoma <ol><li> Quando o conjunto de microagulhas eo animal são preparados, começam injeções. </li><li> Quando o animal está confirmado para ser insensível à pitada pés / cauda, ​​perfurar cuidadosamente a veia episcleral com a micro-agulha, vindo em um ângulo baixo entre 10 e 20 graus para a veia (Figura 3, seta branca). Um punção de sucesso na veia é aparente quando o sangue entra na ponta da micro-agulha (Figura 3, seta preta). </li><li> Lenta e manualmente injetar cerca de 50 salinas ul na veia. Isso deve levar cerca de 10 segundos. As veias vai branco blanch como o sal circula through a vasculatura (Figura 4, ponta de seta). Algumas regiões podem manter uma aparência vermelhas do sangue (Figura 4, seta). <ol><li> Executar uma segunda injecção na veia, do lado oposto ao local da primeira, para assegurar a completa danos na retina para a camada de células ganglionares da retina completa. Nota: Dentro de minutos, deve-se ver um aspecto turvo distinta através da íris do olho como o sal circula através do sistema vascular. </li></ol></li><li> Deixar o olho contralateral não tratado para ser utilizado como um controlo interno. </li></ol> 7. Recuperação de Animais <ol><li> Remover a pinça hemostática. </li><li> Use um aplicador de algodão para aplicar pomada antibiótica tripla (bacitracina de zinco, sulfato de neomicina, B sulfato de polymysin) para o site preso pela pinça hemostática e locais de injecção. danos nos tecidos ao redor dos olhos não ocorre usando a pinça hemostática. </li><li> &gt; Place anestesiados animais em suas jaulas em um cobertor água morna de circulação para prevhipotermia ent. Manter os animais sob observação até que a consciência eo comportamento normal são recuperou. Transporte de animais acordados para a colônia animal. Animais permanecem na colônia até o momento do sacrifício. </li></ol> 8. O Sacrifício de Animais e Retina Remoção <ol><li> Um mês após o procedimento para induzir glaucoma, os animais são sacrificados por asfixia com CO2 e punção torácica secundária. <ol><li> Colocar o animal na câmara e colocar a tampa em forma segura. </li><li> Abrir as válvulas CO 2 e regulador de gás para permitir volume de 20% / min de CO 2 deslocamento de oxigênio na câmara. </li><li> Permitir que quatro a cinco minutos para que o animal a expirar. </li><li> Desligue ambas as válvulas. </li><li> Remover animal a partir da câmara e realizar uma punção torácica secundária com um bisturi estéril. </li></ol></li><li> Após a eutanásia, usar um bisturi para cortar o tecido conjuntivo no interior da cavidade orbital em torno do olho, being cuidado para não cortar na própria globo ocular. </li><li> Cuidadosamente utilize uma tesoura para cortar borda curva do nervo óptico e qualquer tecido restante para extrair o globo ocular intacta. Coloque globo ocular extraído em um x 15 mm placa de Petri estéril 60 milímetros descartável contendo PBS fresco. </li><li> Faça um ocular do globo ocular. Para fazer isso, fazer uma pequena incisão com o bisturi apenas posterior à fronteira entre a íris e esclera. Seguir esta incisão em torno da circunferência do olho com uma tesoura pequena mola para remover o hemisfério da córnea do globo ocular. O hemisfério ligado ao nervo óptico permanece. </li><li> Encontre a retina muito fina rosa / bege dentro da ocular do animal sacrificados. Segurar a camada pigmentado da retina com uma pinça embotadas para estabilizar a ocular. Use outro par de pinças fechadas de provocar muito suavemente toda a retina intacta fora da parte posterior do olho. Evite beliscar, puxar, ou puxando a retina diretamente. </li><li> Use pequenas tesouras para cortar a molaa área onde o nervo óptico ainda está ligado à retina. </li><li> Certifique-se de cortar qualquer epitélio pigmentar residual ou tecido escleral da retina. </li><li> Usando uma pipeta de transferência, muito gentilmente transferir a retina isolado a um Sylgard limpo revestido 35 milímetros x 10 mm placa de Petri contendo PBS fresco. </li></ol> 9. Retina Preparação Whole-Mount <ol><li> Uma vez no prato Sylgard, utilize uma pinça e uma agulha de cacto para fixar a retina no lugar. Manter a camada de células ganglionares da retina para cima e para baixo do nervo óptico. forma hemisférica da retina é notável, mesmo após a fixação. A curvatura da retina vai enrolar para o tecto, quando a camada de células ganglionares da retina é na orientação desejada. </li><li> Use pequenas tesouras para cortar a retina em quatro quadrantes, fazendo a forma de um trevo de quatro folhas irradiando a partir da cabeça do nervo óptico. </li><li> Pin os quadrantes da retina com agulhas de cactos adicionais para tornar a retina o mais plano possível withoUT alongamento (Figura 5). </li><li> Fixar as retinas fixados no prato Sylgard com 3 ml de paraformaldeído a 4% O / N à temperatura ambiente. </li></ol> 10. Coloração de anticorpos de Retina Nota: as retinas mancha fixas com anticorpos primários e secundários para a visualização de neurónios da retina (Figura 6). <ol><li> Lavar, retinas planas montadas fixas três vezes para 2 min cada em PBS. </li><li> Permeabilizar as retinas com 1% de Triton X-100 com soro bovino fetal a 1% em PBS durante 60 min. </li><li> Enxaguar retinas três vezes, 2 minutos cada, com PBS. </li><li> Lavar duas vezes com 0,1% de Triton X-100 em PBS, 5 minutos por lavagem. </li><li> Lavar duas vezes com PBS, 5 min por lavagem. </li><li> Incubar com 1% de Triton X-100 e soro fetal de bovino a 1% em PBS à temperatura ambiente durante 45 min. </li><li> Lavar duas vezes com 0,1% de Triton X-100 em PBS, 5 minutos por lavagem. </li><li> Lavar duas vezes com PBS, 5 min por lavagem. </li><li> Incubar cada retina em soro fetal bovino a 3 ml de 1% em PBScom rato purificada anti-rato CD90 / rato CD90.1 (diluição 1: 300) O / N à temperatura ambiente. </li><li> Lavar uma vez com retinas 0,1% de Triton X-100 em PBS durante 5 min. </li><li> Lavar duas vezes com PBS, 5 min por lavagem. </li><li> Incubar cada retina em 3 ml de PBS (sem FBS) com Alexa Fluor 594 anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho secundário (1: 300) O / N à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as retinas com PBS liberalmente. </li><li> Usando um microscópio de dissecação, remover cuidadosamente agulhas cacto da retina. </li><li> Gentilmente transferir retinas em lâminas de microscópio com uma pipeta de transferência. Certifique-se de manter a orientação com a camada de células ganglionares da retina de frente para o teto. forma hemisférica da retina é notável, mesmo após a fixação. A curvatura da retina vai enrolar para o tecto, quando a camada de células ganglionares da retina é na orientação desejada. </li><li> Absorve o excesso de PBS com Kimwipe ou outro material, tais absorvente. Tenha cuidado para não absorver a retina. </li><li> Adicione 5 gotas de ½ glicerol e ½ PBS em peso, como ammedia ONTAGEM. </li><li> Cubra retina com lamela, evitando bolhas de ar. </li><li> Seguro lamela usando clara polonês prego, cola, ou outro adesivo. </li></ol>

The authors have no conflicting or competing interests to disclose.

Este protocolo descreve um método de induzir condições de glaucoma semelhante em um modelo de rato in vivo em. Este procedimento utiliza uma injecção de solução salina hipertónica para induzir a formação de cicatrizes na malha trabecular 29, 32. O desenvolvimento de tecido de cicatriz oclui o escoamento do humor aquoso, que aumenta a pressão na câmara anterior. Com a diminuição da vazão e pressão construir, a lente suspensa por ligamentos elásticos empurra de volta para a câmara ví...

O glaucoma é um grupo de doenças dos olhos que afectam os neurónios da retina, em particular, as células ganglionares da retina 1-2. Os axónios dessas células convergem para tornar-se o nervo óptico que transporta a informação visual para o cérebro onde a visão é percebida. Danos para CGR e seus axónios, por conseguinte, provoca defeitos visuais. As principais características associadas a distúrbios de glaucoma são degeneração RGC e da morte, aumento da pressão intra-ocular (PIO) e escavação do disco óptico e atrofia. Estas características levam a perda de campo visual ou completa, cegueira irreversível. Atualmente, o glaucoma tem causado cegueira em 70 milhões de pessoas em todo o mundo 3. Como tal, é a terceira maior causa mundial de cegueira 4. O mecanismo exato da morte RGC em glaucoma permanece desconhecida. Muita investigação tem sido feito para desvendar o mistério. Sabe-se, no entanto, que o factor de risco primário de glaucoma é um aumento iN pressão intra-ocular devido à circulação irregular de humor aquoso (AH) na câmara anterior do olho. AH actua como um substituto transparente e incolor para o sangue na câmara anterior avascular do olho. Ela alimenta as células vizinhas, remove os resíduos segregadas a partir de processos metabólicos, transporta neurotransmissores, e permite a circulação de drogas e células inflamatórias dentro do olho durante estados patológicos 1. A manutenção da circulação de humor aquoso envolve o corpo ciliar e a malha trabecular. O humor aquoso é produzido pelo corpo ciliar. Em seguida, flui para a câmara anterior para manter a saúde geral do tecido ocular. 75-80% do fluxo de humor aquoso é segregado activamente através do epitélio ciliar não pigmentada, quando o fluido é filtrado através de três camadas de tecido esponjoso no músculo ciliar. As saídas de fluido através da malha trabecular e através do canal de Schlemm que apropriaçãos para o sistema sanguíneo 5 .A restantes 20 - 25% do escoamento ignora a malha trabecular e é passivamente segregada por ultrafiltração e a difusão através da via uveo-escleral. Esta via parece ser relativamente independente da pressão intra-ocular 1. Quando a produção de humor aquoso e saída estão fora de equilíbrio, a pressão aumenta dentro do olho. Como foi dito, este aumento na pressão intra-ocular é o principal factor de risco no desenvolvimento do glaucoma. Essa pressão faz com que dano para as camadas intrincadas de neurónios na retina na parte posterior do olho. Danos aos axônios de células ganglionares da retina do nervo óptico leva o cérebro a não receber mais informação visual precisa. Como resultado, a percepção de visão é perdida e pode ocorrer cegueira completa. Até à data, não existe cura para o glaucoma. Existem métodos de tratamento diferentes que visam principalmente para reduzir a pressão intra-ocular. Estes incluem tópicaclasses de medicamentos, tais como bloqueadores do receptor beta 1-adrenérgicos, ou análogos de prostaglandinas tópicos. Bloqueadores beta reduzem a pressão intra-ocular através da diminuição da produção de humor aquoso 7. Prostaglandinas funcionar para reduzir a pressão intra-ocular através do aumento da drenagem do humor aquoso 8-14. agonistas adrenérgicos alfa e inibidores da anidrase carbónica, também são utilizados como métodos de tratamento secundário. Alfa agonistas adrenérgicos aumentar a vazão através da via uveoscleral 15-17. Inibidores da anidrase carbónica reduzem a produção de AH por inibição enzimática 18. Muito mais procedimentos invasivos, também estão a ser usadas para tratar o glaucoma. Trabeculoplastia a laser é usado para aumentar a drenagem do humor aquoso a 19. Outra terapia cirúrgica, chamada trabeculectomia, cria um local de drenagem alternativa para filtrar AH quando a via trabecular tradicional está bloqueada 20-21. Estas opções de tratamento têm sido conhecida a EFFectively reduzir a PIO. No entanto, até 40% dos pacientes de glaucoma mostram níveis normais de PIO que indica uma necessidade para métodos terapêuticos mais completos. 22,23 Além disso, de células ganglionares da retina morte visto no glaucoma é irreversível uma vez que começa e tratamentos actuais não parar a progressão da doença 24-28. Este pôs em evidência a necessidade de terapias neuroprotetoras eficazes que visam a sobrevivência dos próprios neurônios. Desenvolvimento de modelos de glaucoma é fundamental para esse desenvolvimento. Neste estudo, estão a demonstrar um método de induzir efeitos glaucoma semelhante em ratos Long Evans adultos utilizando um procedimento modificado descrito originalmente por Morrison 29. Neste procedimento, as injecções de 2 M de solução salina hipertónica no plexo venoso episcleral induz condições glaucoma semelhante por tecido cicatricial para reduzir a saída de humor aquoso na malha trabecular que conduz a um aumento na pressão intra-ocular e uma significativa perda de CGR Within de um mês após o procedimento 30-31. procedimentos de indução de glaucoma, como o aqui descrito, pode ser a chave para desvendar novos desenvolvimentos em tratamentos de glaucoma.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="982">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:299px;">Xylazine hydrochloride, Minimum 99%</td>
			<td style="width:156px;">Sigma, Life Science</td>
			<td style="width:200px;">X1251-1G</td>
			<td style="width:327px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/mL&#160;</td>
			<td>Putney, Inc</td>
			<td>NDC 26637-411-01</td>
			<td>10 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Acepromazine Maleate, 10mg/mL</td>
			<td>Phoenix Pharmaceutical, Inc</td>
			<td>NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408</td>
			<td>50 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Serum bottle, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16171319</td>
			<td>Borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">1 mL insulin syringe&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD329410</td>
			<td>28 gauge needle&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>S7653</td>
			<td>2 M Solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Microelectrode Puller&#160;</td>
			<td>Narishige Group</td>
			<td>PP-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>B150-86-10HP</td>
			<td>without filament, 0.86 mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Microfil syringe needle for filling micropipettes</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc</td>
			<td>MF28G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">18 gauge Luer-Lock needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1130421</td>
			<td>Syringe needle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Flexible Polyethylene Tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22046941</td>
			<td>0.034 inch diameter, approximately 10 inches&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5%</td>
			<td>Akorn, Inc</td>
			<td>NDC 17478-263-12</td>
			<td>15 mL&#160; sterile bottle&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Curved Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Microscope</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>StereoZoom 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Hemostat Clamp&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>1310912</td>
			<td>curved edge</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Triple Antibiotic Ointment&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0664481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>10004-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Scalpel blade # 11</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>10011-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate</td>
			<td>Sigma, Life Science&#160;</td>
			<td>P7059-1L</td>
			<td>1x dilution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>15009-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Forceps (2), Dumont # 5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">3 mL Transfer Pipets, polyethylene, non sterile</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>357524 or 52947-948</td>
			<td>1 and 2 mL graduations</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Sylgard 184</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102092-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Cactus Needles</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>EMD Millipore&#160;</td>
			<td>PX0055-3 or 818715.0100</td>
			<td>Made into a 4% solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>T9284-100 mL</td>
			<td>Made into both a 1% and 0.1% solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Atlanta Biological</td>
			<td>S11150</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>Cat 554892</td>
			<td>1:300 dilution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Alexa Fluor 594 goat anti-mouse&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>A11005</td>
			<td>1:300 dilution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Microscope Slides</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>2948-75x25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Glycerol&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>G5516-100 mL&#160;</td>
			<td>50% glycerol to 50% PBS, by weight&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Coverglass&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>2975-225</td>
			<td>Thickness 1 22 x 50 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>C2 Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glaucoma-inducing procedure in an in vivo rat model and whole-mount retina preparation

O glaucoma é uma doença do sistema nervoso central que actua nas células ganglionares da retina (RGCs). axônios RGC que compõem o nervo óptico carregam informação visual ao cérebro para a percepção visual. Danos para CGR e seus axónios leva a perda de visão e / ou cegueira. Embora a causa específica do glaucoma é desconhecida, o factor de risco principal para a doença é uma pressão intra-ocular elevada. procedimentos de indução de glaucoma em modelos animais são uma ferramenta valiosa para os investigadores que estudam o mecanismo da morte das CGR. Tal informação pode levar ao desenvolvimento de tratamentos neuroprotectores eficazes que podem auxiliar na prevenção da perda de visão. O protocolo no presente documento descreve um método de indução de glaucoma - como condições em um modelo de rato in vivo, onde 50 ul de 2 M solução salina hipertônica é injetado na plexo venoso episcleral. Descascamento dos vasos indica injecção bem sucedida. Este procedimento causa a perda de CGR para simular o glaucoma. Um mês seguinteinjecção, os animais são sacrificados e os olhos são removidos. Em seguida, a córnea, lente, e são removidos do vítreo para fazer uma ocular. A retina é então desenrolada a partir da parte posterior do olho e fixado em placas de Sylgard utilizando agulhas cacto. Nesta altura, os neurónios da retina pode ser corada para análise. Os resultados deste laboratório mostram que aproximadamente 25% dos RGCs são perdidos dentro de um mês do procedimento em relação aos controles internos. Este procedimento permite a análise quantitativa da morte das células ganglionares retinais num modelo de glaucoma em ratos in vivo.

Esta seção ilustra os componentes do aparelho e procedimento utilizados para induzir condições de glaucoma-like em um modelo de glaucoma in vivo de ratos. Mostramos as ferramentas individuais e o equipamento usado para realizar uma injecção de solução salina hipertónica, que provoca um aumento na pressão intra-ocular. Mostramos a injecção no plexo venoso episcleral com o seu efeito de branqueamento característica e o aspecto turvo do que resulta da câmara anterior....

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Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Glaucoma de indução de Procedimento em um<em&gt; In Vivo</em&gt; Modelo de Rato e Whole mount-Retina Preparação

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

glaucoma-inducing-procedure-an-vivo-rat-model-whole-mount-retina

Research

JoVE Journal

Medicine

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

12.9K visualizações.  Western Michigan University. Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis. 

Vídeo: Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

Multi-modal de imagem de angiogênese em um modelo de rato nu de Câncer de mama utilizando a ressonância magnética, tomografia computadorizada volumétrica e ultra-som

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Medicina

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

Descolamento de Retina modelo em roedores por injeção sub-retiniana de hialuronato de sódio

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo 19 F MRI para Rastreamento celular

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these diseases. Chronic retinal diseases such as retinal oedema or neovascularization usually require multiple intraocular injections to effectively treat the condition. However, the risks associated with these injections increase with repeated delivery of the drug. Therefore, alternative delivery methods need to be established in order to minimize the risks of reinjection. Several other investigations have developed methods to deliver drugs over extended time, through materials capable of releasing chemicals slowly into the eye. In this investigation, we outline the use of Elvax 40W, a copolymer resin, to act as a vehicle for drug delivery to the adult rat retina. The resin is made and loaded with the drug. The drug-resin complex is then implanted into the vitreous cavity, where it will slowly release the drug over time. This method was tested using 2-amino-4-phosphonobutyrate (APB), a glutamate analogue that blocks the light response of the retina. It was demonstrated that the APB was slowly released from the resin, and was able to block the retinal response by 7 days after implantation. This indicates that slow-release drug delivery using this copolymer resin is effective for treating the retina, and could be used therapeutically with further testing.

This paper details how Elvax 40W can be used as a slow-release method for drug delivery to the adult rat retina. The protocol for preparing, loading, and delivering the drug-resin complex to the eye is described.

De liberação lenta Drug Delivery através Elvax 40W para o Rat Retina: implicações para o tratamento de condições crônicas

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

Telemetria Intrauterine medir Rato contrátil Pressão<em&gt; In Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

Depleção de células do rato de xenoenxertos de tumor humano Melhora Significativamente Análise Downstream de células alvo

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No current animal models of diabetes and oxygen-induced retinopathy develop the full-range progressive changes manifested in human proliferative diabetic retinopathy (PDR). Therefore, understanding of the disease pathogenesis and pathophysiology has relied largely on the use of histological sections and vitreous samples in approaches that only provide steady-state information on the involved pathogenic factors. Increasing evidence indicates that dynamic cell-cell and cell-extracellular matrix (ECM) interactions in the context of three-dimensional (3D) microenvironments are essential for the mechanistic and functional studies towards the development of new treatment strategies. Therefore, we hypothesized that the pathological fibrovascular tissue surgically excised from eyes with PDR could be utilized to reliably unravel the cellular and molecular mechanisms of this devastating disease and to test the potential for novel clinical interventions. Towards this end, we developed a novel method for 3D ex vivo culture of surgically-excised patient-derived fibrovascular tissue (FT), which will serve as a relevant model of human PDR pathophysiology. The FTs are dissected into explants and embedded in fibrin matrix for ex vivo culture and 3D characterization. Whole-mount immunofluorescence of the native FTs and end-point cultures allows thorough investigation of tissue composition and multicellular processes, highlighting the importance of 3D tissue-level characterization for uncovering relevant features of PDR pathophysiology. This model will allow the simultaneous assessment of molecular mechanisms, cellular/tissue processes and treatment responses in the complex context of dynamic biochemical and physical interactions within the PDR tissue architecture and microenvironment. Since this model recapitulates PDR pathophysiology, it will also be amenable for testing or developing new treatments.

Here, we present a protocol to study the pathophysiology of proliferative diabetic retinopathy by using patient-derived, surgically-excised, fibrovascular tissues for three-dimensional native tissue characterization and ex vivo culture. This ex vivo culture model is also amenable for testing or developing new treatments.

Um modelo de cultura de tecidos de Ex Vivo para fibrovasculares complicações retinopatia diabética proliferativa

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

Preparation Of Gushukang (GSK) Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

Traditional Chinese herbal medicine plays a role as an alternative method in treating many diseases, such as postmenopausal osteoporosis (POP). Gushukang (GSK) granules, a marketed prescription in China, have bone-protective effects in treating POP. Before administration to the body, one standard preparation procedure is commonly required, which aims to promote the release of active constituents from raw herbs and enhance the pharmacological effects as well as therapeutic outcomes. This study proposes a detailed protocol for using GSK granules in in vivo and in vitro experimental assays. The authors first provide a detailed protocol to calculate the animal-appropriate dosages of granules for in vivo investigation: weighing, dissolving, storage, and administration. Second, this article describes protocols for micro-CT scanning and the measurement of bone parameters. Sample preparation, protocols for running the micro-CT machine and quantification of bone parameters were evaluated. Third, serum-containing GSK granules are prepared, and drug-containing serum is extracted for in vitro osteoclastogenesis and osteoblastogenesis. GSK granules were intragastrically administered twice per day to rats for three consecutive days. Blood was then collected, centrifuged, inactivated, and filtered. Finally, serum was diluted and used for performing osteoclastogenesis and osteoblastogenesis. The protocol described here can be considered a reference for pharmacological investigations of herbal prescription medicines, such as granules.

Preparation Of Gushukang GSK Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

This article provides a detailed protocol for preparing a working solution of Gushukang granules for animal studies and GSK granule containing serum for in vitro experiments. This protocol can be applied to pharmacological investigations of herbal medicines as well as prescriptions for both in vivo and in vitro experiments.

Preparação de grânulos de Gushukang (GSK) para experimentos in vivo e in vitro

Traditional Chinese herbal medicine plays a role as an alternative method in treating many diseases, such as postmenopausal osteoporosis (POP). Gushukang ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic fatty liver disease, metabolic liver disease, and liver cancer) requires experimental manipulation of animal models and in vitro cell cultures. Both techniques have limitations, such as the requirement of large numbers of animals for in vivo manipulation. However, in vitro cell cultures do not reproduce the structure and function of the multicellular hepatic environment. The use of precision-cut liver slices is a technique in which uniform slices of viable mouse liver are maintained in laboratory tissue culture for experimental manipulation. This technique occupies an experimental niche that exists between animal studies and in vitro cell culture methods. The presented protocol describes a straightforward and reliable method to isolate and culture precision-cut liver slices from mice. As an application of this technique, ex vivo liver slices are treated with bile acids to simulate cholestatic liver injury and ultimately assess the mechanisms of hepatic fibrogenesis.

This protocol provides a simple and reliable method for the production of viable precision-cut liver slices from mice. The ex vivo tissue samples can be maintained under laboratory tissue culture conditions for multiple days, providing a flexible model to examine liver pathobiology.

Murine Precision-Cut Liver Slices como um modelo ex vivo de biologia hepática

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

Standardized Rat Coronary Ring Preparation and Real-Time Recording of Dynamic Tension Changes Along Vessel Diameter

As a key event of cardiovascular system diseases, coronary artery disease (CAD) has been widely regarded as the main culprit of atherosclerosis, myocardial infarction, and angina pectoris, which seriously threaten the life and health of people all over the world. However, how to record the dynamic biomechanical characteristics of isolated blood vessels has long puzzled people. Meanwhile, precise positioning and isolation of coronary arteries to measure in vitro dynamic vascular tension changes have become a trend in CAD drug development. The present protocol describes the macroscopic identification and microscopic separation of rat coronary arteries. The contraction and dilation function of the coronary artery ring along the vessel diameter was monitored using the established multi myograph system. The standardized and programmed protocols of coronary ring tension measurement, from sampling to data acquisition, tremendously improve the repeatability of the experimental data, which ensures the authenticity of vascular tension records after physiological, pathological, and drug intervention.

The present protocol describes the wire myograph technique for measuring vascular reactivity of the rat coronary artery.