C. Linn is supported by an NIH grant (NIH NEI EY022795).

Alle Verfahren tierischen Patienten verwendet haben in Übereinstimmung mit den Standards des Instituts für Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) an der Western Michigan University. 1. Tiere <ol><li> Verwenden männlichen und weiblichen Ratten Alter von 3 Monaten in dieser Studie. </li><li> Halten Sie Tiere in einem 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser. </li></ol> 2. Herstellung von KAX Cocktail für Tier Anesthesia <ol><li> Man löst 50 mg Xylazin (20 mg / ml) in 5 ml Ketamin (100 mg / ml) mit 1 ml Acepromazin (10 mg / ml) und 3 ml destilliertes Wasser. Gründlich durchmischen. </li><li> Sterilisieren mit einem Spritzenfilter und speichern diese Lösung in eine 10 ml Serumflasche. </li></ol> 3. KAX Injection <ol><li> Wiegen Tier (g) und zurück zum Käfig, bis sie bereit zur Injektion. </li><li> Injizieren von 0,1 ml KAX / 100 g Körpergewicht des Tieres intraperitoneal, eine 1 ml Insulinspritze mit einer 28 G Nadel. </li><li> Zulassenfür Tier zu werden bewusstlos. Überprüfen Reflexe durch die Füße und Schwanz einklemmen. </li><li> Bewahren Sie alle Tiere sicher im Labor für die Dauer der Operation. </li><li> Post-Chirurgie, ersetzen Tiere in ihren Käfigen und halten bequem in RT, bis das Bewusstsein wiedererlangt wird. Nur Rückkehr Tiere in die Tierhaltung, wenn die Tiere erwachen und ein normales Verhalten fortzusetzen. </li></ol> 4. Vorbereitung für Chirurgie und Microneedle Versammlung <ol><li> Machen Sie eine sterile 2 M NaCl-Lösung. </li><li> Verwenden Sie einen Mikroelektroden - Abzieher (1C) ein 0,86 mm Innendurchmesser schwer poliert Standard und dünnwandige Borosilikat Rohr zu ziehen , in zwei fein verjüngte Glasmikronadeln (1D, 1E). </li><li> Verfüllung eines microneedle aus dem vorhergehenden Schritt mit 2 M Kochsalzlösung eine Verfüllung Spritzennadel und einer 1 ml Spritze (1B). Tippen Sie aus Luftblasen aus der Spitze der Elektrode. </li><li> Füllen Sie eine zweite 1 ml Spritze mit 2 MNaCl. Schließen Sie eine 18 G - Nadel und legen dann eine Länge (etwa 10 Zoll) von Polyethylenschlauch (Abbildung 1A). Verwenden Sie den Spritzenkolben das Polyethylenschlauch mit Kochsalzlösung durch die Nadel zu füllen. </li><li> Wenn sowohl die Mikronadeln und Schläuche mit Kochsalzlösung gefüllt sind, sorgfältig die beiden verbinden. Beseitigen jegliche Luft in der Verbindung zwischen ihnen (Figur 2). </li><li> Fein Fase die Spitze des microneedle, indem sie es sehr leicht gegen den Strich eines Kurses Papiertuch Schaben. </li><li> Überprüfen Sie den Widerstand der Mikronadeln durch den Kolben vorsichtig auf die Spritze, bis ein feines Flüssigkeitsstrom drückt auf dem Papiertuch zu sehen. Der Strom der Flüssigkeit sollte nicht breiter als 0,5 mm sein. </li></ol> 5. Herstellung von Tier <ol><li> Tragen Sie 1-2 Tropfen Lokalanästhetikum zu Hornhaut (Proparacainhydrochlorid ophthalmische Lösung, USP, 0,5%). Warten Sie, bis kein Augenreflex auftritt. </li><li> Trim-Whisker mit einer Schere. </li><li> Saturate ein Wattestäbchen mit Betadin Lösung und Tupfer Bereich um den experimentellen Auge. </li><li> Mit Hilfe eines Mikroskops befestigen Sie eine hemostat den unteren Augenlid zu klemmen, um das Auge zu wölben, die episklerale Vene aussetzen und Augenbewegung beschränken. (Abbildung 3, Pfeilspitze) </li></ol> 6. Glaucoma auslösende Saline Injection <ol><li> Wenn die microneedle Montage und das Tier hergestellt werden, beginnen Injektionen. </li><li> Wenn das Tier zu Fuß / Schwanz Prise nicht mehr zu reagieren bestätigt wird, sorgfältig die episklerale Vene mit dem microneedle gewaltsam öffnen , indem sie zwischen 10 und 20 Grad zur Ader (Abbildung 3, weißer Pfeil) in einem niedrigen Winkel kommen. Eine erfolgreiche Einstich in die Vene ist offensichtlich , wenn Blut die Spitze der Mikronadeln (Abbildung 3, schwarzer Pfeil) eintritt. </li><li> Langsam und manuell ca. 50 &amp; mgr; l Kochsalzlösung in die Vene injiziert. Dies sollte etwa 10 Sekunden dauern. Die Venen werden blanch weiß wie das Salz zirkuliert throigitt das Gefäßsystem (Abbildung 4, Pfeilspitze). In einigen Regionen kann eine blutrot Aussehen (Abbildung 4, Pfeil) halten. <ol><li> Durchführen einer zweiten Injektion in die Vene, gegenüber dem Ort der ersten, gründliches retinale Schädigung des vollständigen retinalen Ganglienzellschicht zu gewährleisten. Hinweis: Innerhalb von Minuten, sollte man eine deutliche trübes Aussehen durch die Iris des Auges zu sehen, wie das Salz das Gefäßsystem zirkuliert durch. </li></ol></li><li> Lassen Sie das andere Auge unbehandelt für die Verwendung als interne Kontrolle. </li></ol> 7. Tierrettung <ol><li> Entfernen Sie die hemostat. </li><li> Verwenden Sie einen Wattedreifach antibiotische Salbe (Zink-Bacitracin, Neomycin-Sulfat, polymysin B Sulfat) auf die Website von der hemostat und an Injektionsstellen geklemmt anzuwenden. Gewebeschäden um das Auge tritt nicht auf die hemostat verwenden. </li><li> &gt; Platz narkotisierten Tieren auf einer zirkulierenden Warmwasserdecke in ihren Käfigen zu prevent Hypothermie. Halten Sie Tiere unter Beobachtung, bis das Bewusstsein und ein normales Verhalten wiedergewonnen werden. Transport wach Tiere zurück in die Tierkolonie. Tiere bleiben in der Kolonie bis zum Zeitpunkt des Opfers. </li></ol> 8. Tieropfer und Retina Removal <ol><li> Einen Monat nach dem Verfahren zur Glaukom induzieren, Tiere werden durch CO 2 Ersticken und sekundäre Thorax - Stich eingeschläfert. <ol><li> Legen Sie das Tier in der Kammer und legte den Deckel auf sicher. </li><li> Öffnen Sie die CO 2 und Gasregelventile 20% Volumen / min CO 2 Verschiebung zu ermöglichen , Sauerstoff in der Kammer. </li><li> Lassen Sie vier bis fünf Minuten für das Tier zu verfallen. </li><li> Schalten Sie beide Ventile ab. </li><li> Entfernen Tier aus der Kammer und führen Sie eine sekundäre Thorax-Stich mit einem sterilen Skalpell. </li></ol></li><li> Nach Euthanasie, mit einem Skalpell das Bindegewebe in der Augenhöhle zu schneiden bei rund um das Auge,ng vorsichtig, nicht in den Augapfel selbst zu schneiden. </li><li> Verwenden Sie sorgfältig gekrümmten Rand Schere, um den Sehnerv und alle verbleibenden Gewebe zu schneiden die intakte Augapfel zu extrahieren. Legen Sie extrahiert Augapfel in einem sterilen 60 mm x 15 mm Einweg-Petrischale mit frischem PBS. </li><li> Machen Sie eine Okularmuschel vom Augapfel. Um dies zu tun, stellen ein kleiner Schnitt mit dem Skalpell posterior nur an der Grenze zwischen der Iris und der Sklera. Folgen Sie dieser Einschnitt um den Umfang des Auges mit kleinen Feder Schere, um die Hornhaut Hemisphäre aus dem Augapfel zu entfernen. Die Halbkugel mit dem Sehnerv verbunden bleibt. </li><li> Finden Sie die sehr dünne rosa / beige Retina innerhalb des Okulars vom eingeschläfert Tier. Halten Sie die pigmentierte Schicht der Netzhaut mit abgestumpften Pinzette die Augenmuschel zu stabilisieren. Verwenden Sie ein anderes Paar geschlossener Zange sehr sanft die ganze intakte Retina necken weg von der Rückseite des Auges. Vermeiden Sie Kneifen, ziehen, oder die Netzhaut direkt zerren. </li><li> Verwenden Sie kleine Feder Schere die zu schneidenBereich, in dem der Sehnerv noch an der Netzhaut angebracht wird. </li><li> Achten Sie darauf, restliche Pigmentepithel oder Skleralgewebe von der Retina wegzuschneiden. </li><li> Mit Hilfe einer Transferpipette, Transfer sehr sanft die isolierte Retina zu einem sauberen Sylgard beschichtet 35 mm x 10 mm Petrischale mit frischem PBS. </li></ol> 9. Whole-Mount-Retina-Vorbereitung <ol><li> Einmal in der Sylgard Schüssel, verwenden Pinzette und ein Kaktus Nadel, um die Netzhaut an Ort und Stelle zu fixieren. Halten Sie die retinalen Ganglienzellschicht nach oben und Sehnerv nach unten. Die hemisphärische Form der Netzhaut ist bemerkenswert, auch nach der Fixierung. Die Krümmung der Netzhaut wird zur Decke kräuseln, wenn die retinalen Ganglienzellschicht in der gewünschten Orientierung ist. </li><li> Verwenden Sie kleine Schere, um die Netzhaut in vier Quadranten zu schneiden, die Form eines vier Kleeblatt machen von dem Sehnervenkopf ausstrahlen. </li><li> Pin den Quadranten der Netzhaut mit zusätzlichen Kaktus Nadeln der Retina so flach wie möglich zu machen without Streckung (Abbildung 5). </li><li> Befestigen Sie die gemerkte Retinae in der Sylgard Schale mit 3 ml 4% Paraformaldehyd O / N bei RT. </li></ol> 10. Antikörper-Färbung von Retina Anmerkung: Stain fixiert Retinae mit primären und sekundären Antikörpern zur Betrachtung Neuronen in der Netzhaut (6). <ol><li> Spülen Sie fixiert, flach montierten Retinae dreimal für jeweils 2 Min in PBS. </li><li> Permeabilisieren die Retinas mit 1% Triton X-100 mit 1% fötalem Rinderserum in PBS für 60 min. </li><li> Rinse Retinae dreimal 2 min jeweils in PBS. </li><li> Spülen zweimal mit 0,1% Triton X-100 in PBS, 5 min pro Waschung. </li><li> Spülen Sie zweimal mit PBS, 5 min pro Wasch. </li><li> Inkubieren mit 1% Triton X-100 und 1% fötalem Rinderserum in PBS bei RT für 45 min. </li><li> Spülen zweimal mit 0,1% Triton X-100 in PBS, 5 min pro Waschung. </li><li> Spülen Sie zweimal mit PBS, 5 min pro Wasch. </li><li> Inkubieren jeder Netzhaut in 3 ml 1% fötalem Rinderserum in PBSmit gereinigtem Maus-anti-Ratte CD90 / Maus CD90.1 (1: 300 Verdünnung) O / N bei RT. </li><li> Spülen Retinae einmal mit 0,1% Triton X-100 in PBS für 5 min. </li><li> Spülen Sie zweimal mit PBS, 5 min pro Wasch. </li><li> Inkubieren jeder Netzhaut in 3 ml PBS (ohne FBS) mit sekundären Alexa Fluor 594 Ziege-Anti-Maus-IgG (1: 300), O / N bei RT. </li><li> Waschen Sie Retinae mit PBS liberal. </li><li> Mit einem Binokular, entfernen Sie vorsichtig Kaktus Nadeln von der Netzhaut. </li><li> übertragen vorsichtig Retinae auf Mikroskop-Objektträger mit einer Transferpipette. Achten Sie darauf, Orientierung mit retinalen Ganglienzellschicht zu halten an der Decke gegenüber. Die hemisphärische Form der Netzhaut ist bemerkenswert, auch nach der Fixierung. Die Krümmung der Netzhaut wird zur Decke kräuseln, wenn die retinalen Ganglienzellschicht in der gewünschten Orientierung ist. </li><li> Absorbieren überschüssiges PBS mit Kimwipe oder ein anderes derartiges Material aufnehmen. Achten Sie darauf, nicht auf die Netzhaut zu absorbieren. </li><li> 5 Tropfen ½ Glycerin und ½ PBS Gewichts als amontage Medien. </li><li> Decken Sie Retina mit Deckglas, Luftblasen vermeiden. </li><li> Sichere Deck mit klarem Nagellack, Klebstoff oder andere Kleber. </li></ol>

The authors have no conflicting or competing interests to disclose.

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Glaukom-ähnlichen Bedingungen in einem in vivo Rattenmodell induzieren. Dieses Verfahren verwendet eine Injektion von hypertonischer Kochsalzlösung Vernarbung in das Trabekelwerk zu induzieren 29, 32. Die Entwicklung Gewebenarben den Abfluss von Kammerwasser okkludiert , die Druck in der vorderen Kammer erhöht. Mit verminderten Abfluss und Druck aufzubauen, wird die Linse durch elastische Bänder suspendiert schiebt wieder in den Glaskörperraum. Vitreous Humor gilt dann Druck auf die Netzhaut die empfindlichen Netzhautneuronen zu beschädigen. Unsere Ergebnisse mit diesem Verfahren zeigen, dass retinalen Ganglienzellzahlen beginnen nach 2 Wochen mit erheblichen Verlust von Ganglionzellen Verlust nach 1 Monat nach dem Eingriff zu schwinden. Dieses Protokoll ist nur ein Verfahren des Glaukoms bei Nagetieren induziert. Es gibt viele andere experimentelle Modelle, bei denen eine Beschädigung retinalen Ganglionzellen erfolgt entweder durch eine Erhöhung des intraokularen Drucks oder durch direkte daMagier auf den Sehnerv 30. Oft haben diese Verfahren wurden in 33 größeren Tieren und modifiziert für Anwendung an Mäuse und Ratten entwickelt. Intraokulare Injektionen von Toxinen wie Staurosporin 34 und NMDA, die nicht hydrolysierbaren Glutamat analog 35 schnellen Tod retinaler Ganglionzellen induzieren. Studien haben jedoch gezeigt, dass solche Toxine eine Dosis-Wirkungs-Kurve in Mäusen und Wirkung anderen Zellen als den Ziel Ganglionzellen 35 folgen. Zudem ist der Schaden an retinalen Ganglionzellen in diesem Modell sehr viel direkter als die allmähliche Fortschreiten der menschlichen Glaukomen. Die direkten Schäden des Sehnervs können auch zugefügt werden. Laser Axotomie ist ein gemeinsamer Weg die Axone zu durchtrennen 36 den Sehnerven bei Mäusen bilden. Jedoch stellt dieses Verfahren einige Komplikationen. Die geringe Größe von Nagetieren Bahnen macht es schwierig, genau den Sehnerv beschädigen, ohne den Blutfluss durch die zentrale Netzhautarterie zu beeinflussenund Vene. Um dies zu überwinden, nutzen einige Forscher eine invasive Ansatz , der die Entfernung eines kleinen Teils des Gehirns , um 37 einen besseren Zugang zu den Sehnerv zu liefern. Optic Nervenquetschung Modelle zugreifen den Sehnerv intraorbital als auch. In diesem Modell wird der Nerv durch selbstschließenden Zange gequetscht und Augenblutung nicht beeinträchtigt wird. Dieses Verfahren führt zu einer sofortigen Beleidigung und synchronen Tod von retinalen Ganglienzellen. Studien dieses Modell zeigen einen signifikanten Verlust von RGCs 38. Jedoch argumentieren einige, dass es , dass mehr Schaden verursachen können , als durch erhöhten IOP allein 39 verursacht. Zusätzlich Glaukom wird durch eine langsame, chronische, asynchrone Verlust von retinalen Ganglienzellen 33, gekennzeichnet 39-42 .Daher der zeitliche Verlauf und die zugrunde liegenden Mechanismus der Schaden mit Sehnerv Crush zugefügt ganz anders sein könnte als die in der menschlichen Glaukom auftritt. Im Gegensatz dazu vermeidet das Modell in diesem Papier die Notwendigkeit einer direkten Zubess an den Sehnerv, beseitigt jede Präparation von Hirngewebe und ermöglicht eine allmähliche retinaler Ganglionzellen Schäden. Microbead Okklusion Modelle von Glaukom Verwendung Polystyrol oder magnetische in den vorderen Kammern von Ratten oder Mäuse injiziert Perlen zu IOP erhöhen. Die meisten dieser Arbeiten wurde in Mäusen durchgeführt , und sie zeigen nur eine geringe bis mäßige Höhe des Schadens im Sehnerven mit großen Unterschiede in den Ergebnissen und inkonsistente Daten 43-50. Bei Ratten verwendet wurde, wurde die Dauer der erhöhten IOP 48 zu kurz genug , Schäden an Zellen zu verursachen. Auch bei Änderungen an dem Verfahren, das Modell verursacht noch schwere Schäden in kurzer Dauer eine akute neuropathische Modell darstellt und nicht als chronische Glaukom Modell 51. Smedowski et al 43 haben eine weitere modifizierte Mikrobead Verfahren unter Verwendung eines zusätzlichen anfänglichen &quot;Hochdruck - Verletzung&quot; vor kurzem entwickelt länger anhaltende IOP Erhebung mit chronischen Schäden zu erreichen , die Hirschkuhs sind vielversprechend. Weitere Studien mit dieser Technik sind notwendig, um weiter dieses Modell zu validieren. Modelle der chronischen Augenüberdruck Ziel wässrigen Abflusses zu behindern. Laser - Photokoagulation der episklerale und Limbus Adern 52 und episklerale Venenverschluss 53 sind zwei solche Methoden. Es hat sich aber auch , dass Laserablationstechniken 36, nur transient IOP Ansicht und eine moderate Level der tatsächlichen Zellverlust 54-55 erzeugen gezeigt. Das Glaukom ist eine chronische Erkrankung, die durch Beschädigung und Verlust von retinalen Ganglienzellen, deren Axone den Sehnerv bilden. Der Mechanismus dieser Verlust ist nicht bekannt. Während eine Erhöhung des intraokularen Drucks das Markenzeichen Risikofaktor ist, haben einige die Beteiligung anderer Faktoren vorgeschlagen. Zu diesen Faktoren zählen entzündliche Prozesse, oxidativer Stress, Stoffwechselstörungen, oder Durchblutungsstörungen 56-58. Um den genauen Mechanismus von cel aufzudeckenl Tod bei dieser Krankheit, brauchen die Forscher einfach, wiederholbar und funktionelle Möglichkeiten, um genau Bedingungen Mimik in menschlichen Glaukom erscheinen. Erst dann können die Forscher hoffen, einen Weg zu finden, vor dem Absterben retinaler Ganglienzellen zu schützen. Das Verfahren in dieser Veröffentlichung beschrieben wird, verwendet eine künstlich induzierte Erhöhung des IOP eine graduelle, irreversible Verlust von retinalen Ganglionzellen zu erzeugen ähnlich zu 31 in Glaukom - Patienten gesehen. Das Verfahren ist minimal-invasiv. Signifikante retinaler Ganglionzellen Verlust wird innerhalb eines Monats nach der Operation gemessen. Dieses Verfahren ist ein wichtiges Werkzeug für die Untersuchung des Glaukoms. Eine potentielle Beschränkung dieses Verfahrens ist die manuelle Injektion von hypertonischer Salzlösung. Aufgrund dieser manuellen Methode ist es möglich, eine große Variabilität in Ergebnisse zu erwarten. Jedoch haben wir die Wirkung Blanchierens in der Vene identifiziert ein kritischer Schritt. Wenn Blanchierung auftritt, retinaler Ganglionzellen Verlust immer zwischen 18 und 29%. Um dies zu unterstützen, werden alle zukünftigen Studien könnte modify die Prozedur Routine IOP - Messungen umfassen , um sicherzustellen , dass diese Injektionen zu einer messbaren Erhöhung des IOD führen. 29,31. Vielleicht ist dieses Modell von RGC Tod wird zur Entwicklung einer vollständigeren neuroprotektive Behandlung führen, die die verheerenden Sehverlust bekämpft weltweit Millionen von Menschen betreffen.

Glaukom ist eine Gruppe von Augenkrankheiten , Nervenzellen in der Netzhaut zu beeinflussen, insbesondere die retinalen Ganglionzellen 1-2. Die Axone dieser Zellen konvergieren der Sehnerv visuelle Information tragenden zum Gehirn zu werden, wo die Sicht wahrgenommen wird. Schäden an RGCs und ihre Axone führt daher zu Sehfehler. Die primären Merkmale im Zusammenhang mit Glaukom-Erkrankungen sind RGC Degeneration und Tod, erhöhter Augeninnendruck (IOP) und Papille Schröpfen und Atrophie. Diese Eigenschaften führen zu Gesichtsfeldausfällen oder vollständige, irreversible Blindheit. Derzeit hat 3 Blindheit in 70 Millionen Menschen weltweit Glaukom verursacht. Als solches ist es die drittgrößte Ursache für Erblindung 4 der Welt. Der genaue Mechanismus der RGC Tod in Glaukom bleibt unbekannt. Viel Forschung wurde das Geheimnis zu entsperren getan. Es ist jedoch bekannt, dass der primäre Risikofaktor für Glaukom ist eine Zunahme in intraokularen Drucks aufgrund unregelmäßiger Zirkulation von wässrigem Humor (AH) in der Vorderkammer des Auges. AH dient als transparent und farblos Ersatz für Blut in der avaskulären Vorderkammer des Auges. Es nährt die umliegenden Zellen, entfernt sekretiertes Abfallprodukte aus Stoffwechselprozesse, transportiert Neurotransmitter und ermöglicht die Verbreitung von Drogen und Entzündungszellen innerhalb des Auges während der pathologischen Zustände 1. Die Aufrechterhaltung der wässrigen Humor Zirkulation beinhaltet die Ziliarkörper und das Trabekelwerk. Wässrige Humor wird durch den Ziliarkörper produziert. Es fließt dann in die vordere Kammer, die allgemeine Gesundheit des Augengewebes zu halten. 75-80% der wässrigen Abflusses wird aktiv durch nichtpigmentären Ciliarepithel sezerniert, wenn die Flüssigkeit durch drei Schichten des schwammigen Gewebe im Ziliarmuskel gefiltert wird. Das Fluid tritt durch das Trabekelwerk und durch den Schlemmschen Kanal, empties in das Blutsystem 5 .Die restlichen 20 - 25% der Abfluss umgeht das Trabekelwerk und wird passiv durch Ultrafiltration und Diffusion durch die uveo-skleralen Weg abgesondert. Dieser Weg scheint relativ unabhängig von den intraokularen Druck 1 zu sein. Wenn Kammerwasserproduktion und Abfluss aus dem Gleichgewicht geraten sind, baut den Druck im Auge. Wie bereits erwähnt, diese Erhöhung des intraokularen Drucks ist der primäre Risikofaktor bei der Entwicklung von Glaukom. Ein solcher Druck bewirkt, dass eine Beschädigung der komplizierten Schichten von Neuronen in der Netzhaut auf der Rückseite des Auges. Eine Schädigung der retinalen Ganglienzellen Axone des Sehnervs verursacht das Gehirn nicht mehr präzise visuelle Informationen zu erhalten. Als Ergebnis ist die Wahrnehmung des Sehvermögens verloren und vollständige Blindheit auftreten können. Bis heute gibt es keine Heilung für Glaukom. Verschiedene Behandlungsmethoden gibt, die in erster Linie den intraokularen Druck zu reduzieren wollen. Dazu gehören die topischeMedikamente Klassen wie Beta1-Rezeptorenblocker oder topische Prostaglandin-Analoga. Betablocker reduzieren die intraokulare Druck durch die Produktion von Kammerwasser 7 abnimmt. Prostaglandine fungieren IOP zu reduzieren , indem der Abfluss von Humor aquosus 8-14 erhöhen. Alpha-adrenergen Agonisten und Carboanhydrasehemmer sind auch als sekundäre Behandlungsmethoden verwendet werden. Alpha - adrenergen Agonisten erhöhen Abfluss durch den uveosklerale Weg 15-17. Carboanhydrasehemmer reduzieren die Produktion von AH durch enzymatische Hemmung 18. Viel mehr invasive Verfahren werden auch zur Behandlung von Glaukom verwendet wird. Lasertrabekuloplastik wird verwendet , 19 , um den Abfluss des Kammerwassers zu erhöhen. Eine weitere chirurgische Therapie, die so genannte Trabekulektomie schafft eine alternative Entwässerung Website AH zu filtern , wenn der traditionelle trabekulären Weg wird 20-21 blockiert. Diese Behandlungsoptionen wurden zu eff bekanntektiv IOP verringern. Jedoch bis zu 40% der Glaukompatienten für vollständigere therapeutischen Verfahren eine Notwendigkeit , den normalen IOP Ebenen zeigen anzeigt. 22,23 Zusätzlich ist Retinal Ganglion Zelltod in Glaukom gesehen irreversible sobald es und aktuellen Behandlungen beginnt nicht das Fortschreiten der Krankheit zu stoppen 24-28. Dies hat die Notwendigkeit einer wirksamen neuroprotektiven Therapien hervorgehoben, dass das Überleben der Neuronen selbst ausrichten. Entwicklung von Glaukom-Modelle ist für diese Entwicklung entscheidend. In dieser Studie zeigen wir ein Verfahren zur Induzierung von Glaukom-ähnliche Effekte in erwachsenen Long Evans - Ratten mit einem modifizierten Verfahren unter Verwendung von ursprünglich umrissenen von Morrison 29. In diesem Verfahren werden Injektionen von 2 M hypertonen Kochsalzlösung in dem episkleralen venösen Plexus induziert Glaukom ähnlichen Bedingungen durch Gewebe Vernarbung wässrigen Abflusses in das Trabekelwerk zu einem Anstieg des intraokularen Drucks und einem signifikanten Verlust an RGCs was zu reduzieren within eines Monats nach dem Verfahren 30-31. Glaucoma-induzierenden Verfahren, wie das hier beschrieben ist, kann der Schlüssel zur Erschließung neuer Entwicklungen in Glaukombehandlung.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="982">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:299px;">Xylazine hydrochloride, Minimum 99%</td>
			<td style="width:156px;">Sigma, Life Science</td>
			<td style="width:200px;">X1251-1G</td>
			<td style="width:327px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/mL&#160;</td>
			<td>Putney, Inc</td>
			<td>NDC 26637-411-01</td>
			<td>10 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Acepromazine Maleate, 10mg/mL</td>
			<td>Phoenix Pharmaceutical, Inc</td>
			<td>NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408</td>
			<td>50 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Serum bottle, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16171319</td>
			<td>Borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">1 mL insulin syringe&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD329410</td>
			<td>28 gauge needle&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>S7653</td>
			<td>2 M Solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Microelectrode Puller&#160;</td>
			<td>Narishige Group</td>
			<td>PP-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>B150-86-10HP</td>
			<td>without filament, 0.86 mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Microfil syringe needle for filling micropipettes</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc</td>
			<td>MF28G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">18 gauge Luer-Lock needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1130421</td>
			<td>Syringe needle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Flexible Polyethylene Tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22046941</td>
			<td>0.034 inch diameter, approximately 10 inches&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5%</td>
			<td>Akorn, Inc</td>
			<td>NDC 17478-263-12</td>
			<td>15 mL&#160; sterile bottle&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Curved Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Microscope</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>StereoZoom 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Hemostat Clamp&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>1310912</td>
			<td>curved edge</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Triple Antibiotic Ointment&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0664481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>10004-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Scalpel blade # 11</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>10011-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate</td>
			<td>Sigma, Life Science&#160;</td>
			<td>P7059-1L</td>
			<td>1x dilution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>15009-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Forceps (2), Dumont # 5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">3 mL Transfer Pipets, polyethylene, non sterile</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>357524 or 52947-948</td>
			<td>1 and 2 mL graduations</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Sylgard 184</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102092-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Cactus Needles</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>EMD Millipore&#160;</td>
			<td>PX0055-3 or 818715.0100</td>
			<td>Made into a 4% solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>T9284-100 mL</td>
			<td>Made into both a 1% and 0.1% solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Atlanta Biological</td>
			<td>S11150</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>Cat 554892</td>
			<td>1:300 dilution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Alexa Fluor 594 goat anti-mouse&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>A11005</td>
			<td>1:300 dilution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Microscope Slides</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>2948-75x25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Glycerol&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>G5516-100 mL&#160;</td>
			<td>50% glycerol to 50% PBS, by weight&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Coverglass&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>2975-225</td>
			<td>Thickness 1 22 x 50 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>C2 Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glaucoma-inducing procedure in an in vivo rat model and whole-mount retina preparation

Das Glaukom ist eine Erkrankung des zentralen Nervensystems retinale Ganglionzellen (RGCs). RGC Axone des Sehnervs führen für die visuelle Wahrnehmung an das Gehirn visuelle Eingabe bilden. Schäden an RGCs und ihre Axone führt zu Verlust der Sehkraft und / oder Blindheit. Obwohl die spezifische Ursache des Glaukoms nicht bekannt ist, ist der Hauptrisikofaktor für die Erkrankung ein erhöhter Augeninnendruck. Glaucoma-induzierende Verfahren in Tiermodellen sind ein wertvolles Werkzeug für Forscher, den Mechanismus der RGC Tod studieren. Diese Informationen können zur Entwicklung von wirksamen neuroprotektiven Behandlungen führen, die bei der Prävention von Verlust der Sehkraft unterstützen könnte. Das Protokoll in diesem Dokument beschreibt ein Verfahren Glaukom induzieren - ähnlichen Bedingungen in einem in vivo Rattenmodell , bei dem 50 ul von 2 M hypertonen Kochsalzlösung in das episkleralen venösen Plexus injiziert. Blanchieren der Gefäße zeigt die erfolgreiche Injektion. Dieses Verfahren führt zu einem Verlust von RGCs Glaukom zu simulieren. Einen Monat nachInjektion werden die Tiere getötet und die Augen entfernt. Als nächstes werden die Hornhaut, Linse und Glaskörper entfernt, um eine Okularmuschel zu machen. Die Netzhaut wird dann von der Rückseite des Auges geschält und auf Sylgard Gerichte mit Kaktus Nadeln festgesteckt. An diesem Punkt Neuronen in der Netzhaut kann zur Analyse gefärbt werden. Die Ergebnisse aus diesem Labor zeigen, dass etwa 25% der RGCs innerhalb eines Monats nach dem Verfahren, wenn die interne Kontrolle im Vergleich verloren. Dieses Verfahren ermöglicht die quantitative Analyse von Retinal Ganglion Zelltod in einem in vivo Rattenmodell Glaukoms.

Dieser Abschnitt stellt die Gerätekomponenten und Verfahren verwendet , um Glaukom ähnlichen Bedingungen in einem in vivo Ratten Glaukom Modell induzieren. Wir zeigen die einzelnen Werkzeuge und Geräte mit einer hypertonen Kochsalzlösung-Injektion auszuführen verwendet, die eine Erhöhung des intraokularen Druckes bewirkt. Wir zeigen die Injektion in den episkleralen venösen Plexus mit seinen charakteristischen Blanchierung Effekt und die trübes Aussehen der vorderen Kammer, der sich ergibt. Wir beschreiben auch den Prozess der Retina Entfernung und Flachmontage für die Analyse der verlorenen RGCs. Schließlich zeigen wir die Auswirkungen der Einspritzung auf das Überleben retinaler Ganglionzellen. Da die Verteilung von RGCs in den verschiedenen Regionen der Ratte Retina uneben ist, werden die Bilder von vier 200 &amp; mgr; m - 2 - Regionen in jeder Netzhaut erhalten, 4 mm von der Mitte des Sehnervenkopfes entfernt. Die Gesamtzahl der Thy 1.1 markierten RGCs in jedem Abschnitt gezählt werden, gemittelt und verglichen in experimentellen und contr<html> ol Retinae 31. Unter Verwendung dieses Verfahrens verändert RGC Zählwerte von durchschnittlich 225 in einem Bild der unbehandelten Kontrollbedingungen 168 einen Monat nach dem Verfahren Glaukom ähnlichen Bedingungen (N = 30) zu induzieren. Zusammengenommen können die hier beschriebenen Verfahren kann Schritt für Schritt verfolgt werden, um den Tod von retinalen Ganglienzellkörper und Axone zu analysieren. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53831/53831fig1.jpg" /> Abbildung 1. Microneedle Komponenten. (A) Die Spritze mit Polyethylenschlauch für Salz Injektion verwendet. (B) Verfüllung Spritze verwendet , um die Borosilikat microneedle zu verfüllen. (C) Narishige Elektrode Abzieher verwendet Borosilikat - Mikronadeln zu machen. (D) Borosilikat - Glaselektroden vor und nach dem in der Elektrode gezogen wird Puller. (E) Ansicht von Mikroelektroden Nadelspitze Vergrößerte nach gezogen wird.ftp_upload / 53831 / 53831fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53831/53831fig2.jpg" /> Abbildung 2. Vollständige Microneedle Montage. Microneedle an Polyethylenschlauch angebracht angebracht mit hypertonen Kochsalzlösung auf die Spritze. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53831/53831fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53831/53831fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53831/53831fig3.jpg" /> Abbildung 3. Glaucoma auslösenden Saline Injektion in die Episklerale Venenplexus. Das Bild von Salzinjektion in die episklerale Vene eines lebenden, narkotisierten Ratten Long Evans. Die Pfeilspitze gibt die Position des hemostat verwendet, um das Auge wölben und ihre Bewegung zu verhindern. Der weiße Pfeil zeigt die<html> Lage der injizierten vein. Der schwarze Pfeil zeigt Blut zurück in die microneedle Spitze fließt , über die erfolgreiche Venenpunktion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53831/53831fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53831/53831fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53831/53831fig4.jpg" /> Abbildung 4. Blanchieren Wirkung von Hypertone Saline Injektion. Das Bild von Rattenauge mit hypertonen Kochsalzlösung injiziert. Die Pfeilspitze zeigt die charakteristische Abblassen Wirkung von Kochsalzlösung in den episklerale Venenplexus. Der Pfeil zeigt einen Teil des episklerale Venenplexus, der noch nicht blanchiert hat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53831/53831fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53831/53831fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 31 / 53831fig5.jpg &quot;/&gt; Abbildung 5. Flach Berg der Ratte Retina. Das Bild der ganze Berg Netzhaut von der Ratte Auge entfernt und merken Wohnung in einem Sylgard Gericht mit Kaktus Nadeln. Der schwarze Pfeil zeigt den Sehnervenkopf. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53831/53831fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53831/53831fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/53831/53831fig6.jpg" /> Abbildung 6. Schäden an retinalen Ganglienzellen nach Glaucoma auslösende Chirurgie. Vergleich von unbehandelten Kontroll Auge (A) zu experimentellen Auge (B) einen Monat nach Glaukom Empfang Kochsalzinjektion induziert wird . Retinae wurden mit einem Antikörper gegen das RGC Marker markiert, Thy 1.1 (CD90). Dünne Pfeile zeigen einzelne RGCs sowohl in der Kontroll- und experimentellen Bedingungen. Das Verfahren führt zu einer Reduktion in der Anzahl von RGCs, defasciculation der Axone aus den wichtigsten Axon-Bundles und Verzerrung der Zirkularität der verbleibenden RGCs. Blockpfeile zeigen die charakteristischen defasciculating Axone aus der Salzinjektion führt. Die Pfeilspitze zeigt ein Blutgefäß in der Netzhaut. Doppelpfeile Label Axon - Bundles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53831/53831fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53831/53831fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Glaucoma auslösende Verfahren in ein<em&gt; In Vivo</em&gt; Rat Modell und Whole-mount Retina Vorbereitung

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

glaucoma-inducing-procedure-an-vivo-rat-model-whole-mount-retina

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

12.9K Aufrufe.  Western Michigan University. Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis. 

Serie: Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

Multimodale Bildgebung von Angiogenese in einem Nude Rattenmodell der Brustkrebs Knochenmetastasen mittels Magnetresonanztomographie, volumetrische Computertomographie und Ultraschall

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Forschung

Medizin

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

Modell Netzhautablösung in Nagetiere durch subretinale Injektion von Natriumhyaluronat

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In-vivo-19 F-MRT für die Zellverfolgung

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these diseases. Chronic retinal diseases such as retinal oedema or neovascularization usually require multiple intraocular injections to effectively treat the condition. However, the risks associated with these injections increase with repeated delivery of the drug. Therefore, alternative delivery methods need to be established in order to minimize the risks of reinjection. Several other investigations have developed methods to deliver drugs over extended time, through materials capable of releasing chemicals slowly into the eye. In this investigation, we outline the use of Elvax 40W, a copolymer resin, to act as a vehicle for drug delivery to the adult rat retina. The resin is made and loaded with the drug. The drug-resin complex is then implanted into the vitreous cavity, where it will slowly release the drug over time. This method was tested using 2-amino-4-phosphonobutyrate (APB), a glutamate analogue that blocks the light response of the retina. It was demonstrated that the APB was slowly released from the resin, and was able to block the retinal response by 7 days after implantation. This indicates that slow-release drug delivery using this copolymer resin is effective for treating the retina, and could be used therapeutically with further testing.

This paper details how Elvax 40W can be used as a slow-release method for drug delivery to the adult rat retina. The protocol for preparing, loading, and delivering the drug-resin complex to the eye is described.

Slow-Release-Drug Delivery durch Elvax 40W, um die Ratte Retina: Implikationen für die Behandlung von chronischen Erkrankungen

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

Intrauterine Telemetrie zur Maus Kontraktionsdruck messen<em&gt; In-vivo-</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

Depletion von Maus-Zellen aus menschlichem Tumorxenografte deutlich verbessert Downstream-Analyse von Zielzellen

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No current animal models of diabetes and oxygen-induced retinopathy develop the full-range progressive changes manifested in human proliferative diabetic retinopathy (PDR). Therefore, understanding of the disease pathogenesis and pathophysiology has relied largely on the use of histological sections and vitreous samples in approaches that only provide steady-state information on the involved pathogenic factors. Increasing evidence indicates that dynamic cell-cell and cell-extracellular matrix (ECM) interactions in the context of three-dimensional (3D) microenvironments are essential for the mechanistic and functional studies towards the development of new treatment strategies. Therefore, we hypothesized that the pathological fibrovascular tissue surgically excised from eyes with PDR could be utilized to reliably unravel the cellular and molecular mechanisms of this devastating disease and to test the potential for novel clinical interventions. Towards this end, we developed a novel method for 3D ex vivo culture of surgically-excised patient-derived fibrovascular tissue (FT), which will serve as a relevant model of human PDR pathophysiology. The FTs are dissected into explants and embedded in fibrin matrix for ex vivo culture and 3D characterization. Whole-mount immunofluorescence of the native FTs and end-point cultures allows thorough investigation of tissue composition and multicellular processes, highlighting the importance of 3D tissue-level characterization for uncovering relevant features of PDR pathophysiology. This model will allow the simultaneous assessment of molecular mechanisms, cellular/tissue processes and treatment responses in the complex context of dynamic biochemical and physical interactions within the PDR tissue architecture and microenvironment. Since this model recapitulates PDR pathophysiology, it will also be amenable for testing or developing new treatments.

Here, we present a protocol to study the pathophysiology of proliferative diabetic retinopathy by using patient-derived, surgically-excised, fibrovascular tissues for three-dimensional native tissue characterization and ex vivo culture. This ex vivo culture model is also amenable for testing or developing new treatments.

Ein Ex-Vivo-Gewebekultur-Modell für fibrovaskulärem Komplikationen bei proliferativer diabetischer Retinopathie

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

Preparation Of Gushukang (GSK) Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

Traditional Chinese herbal medicine plays a role as an alternative method in treating many diseases, such as postmenopausal osteoporosis (POP). Gushukang (GSK) granules, a marketed prescription in China, have bone-protective effects in treating POP. Before administration to the body, one standard preparation procedure is commonly required, which aims to promote the release of active constituents from raw herbs and enhance the pharmacological effects as well as therapeutic outcomes. This study proposes a detailed protocol for using GSK granules in in vivo and in vitro experimental assays. The authors first provide a detailed protocol to calculate the animal-appropriate dosages of granules for in vivo investigation: weighing, dissolving, storage, and administration. Second, this article describes protocols for micro-CT scanning and the measurement of bone parameters. Sample preparation, protocols for running the micro-CT machine and quantification of bone parameters were evaluated. Third, serum-containing GSK granules are prepared, and drug-containing serum is extracted for in vitro osteoclastogenesis and osteoblastogenesis. GSK granules were intragastrically administered twice per day to rats for three consecutive days. Blood was then collected, centrifuged, inactivated, and filtered. Finally, serum was diluted and used for performing osteoclastogenesis and osteoblastogenesis. The protocol described here can be considered a reference for pharmacological investigations of herbal prescription medicines, such as granules.

Preparation Of Gushukang GSK Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

This article provides a detailed protocol for preparing a working solution of Gushukang granules for animal studies and GSK granule containing serum for in vitro experiments. This protocol can be applied to pharmacological investigations of herbal medicines as well as prescriptions for both in vivo and in vitro experiments.

Vorbereitung von Gushukang (GSK) Granulat en for In Vivo und In Vitro Experiments

Traditional Chinese herbal medicine plays a role as an alternative method in treating many diseases, such as postmenopausal osteoporosis (POP). Gushukang ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic fatty liver disease, metabolic liver disease, and liver cancer) requires experimental manipulation of animal models and in vitro cell cultures. Both techniques have limitations, such as the requirement of large numbers of animals for in vivo manipulation. However, in vitro cell cultures do not reproduce the structure and function of the multicellular hepatic environment. The use of precision-cut liver slices is a technique in which uniform slices of viable mouse liver are maintained in laboratory tissue culture for experimental manipulation. This technique occupies an experimental niche that exists between animal studies and in vitro cell culture methods. The presented protocol describes a straightforward and reliable method to isolate and culture precision-cut liver slices from mice. As an application of this technique, ex vivo liver slices are treated with bile acids to simulate cholestatic liver injury and ultimately assess the mechanisms of hepatic fibrogenesis.

This protocol provides a simple and reliable method for the production of viable precision-cut liver slices from mice. The ex vivo tissue samples can be maintained under laboratory tissue culture conditions for multiple days, providing a flexible model to examine liver pathobiology.

Murine Präzisionsgeschnittene Leberscheiben als Ex-Vivo-Modell der Leberbiologie

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

Standardized Rat Coronary Ring Preparation and Real-Time Recording of Dynamic Tension Changes Along Vessel Diameter

As a key event of cardiovascular system diseases, coronary artery disease (CAD) has been widely regarded as the main culprit of atherosclerosis, myocardial infarction, and angina pectoris, which seriously threaten the life and health of people all over the world. However, how to record the dynamic biomechanical characteristics of isolated blood vessels has long puzzled people. Meanwhile, precise positioning and isolation of coronary arteries to measure in vitro dynamic vascular tension changes have become a trend in CAD drug development. The present protocol describes the macroscopic identification and microscopic separation of rat coronary arteries. The contraction and dilation function of the coronary artery ring along the vessel diameter was monitored using the established multi myograph system. The standardized and programmed protocols of coronary ring tension measurement, from sampling to data acquisition, tremendously improve the repeatability of the experimental data, which ensures the authenticity of vascular tension records after physiological, pathological, and drug intervention.

The present protocol describes the wire myograph technique for measuring vascular reactivity of the rat coronary artery.