C. Linn is supported by an NIH grant (NIH NEI EY022795).

Tutte le procedure che utilizzano soggetti animali sono stati in conformità con gli standard dell&#39;Istituto di cura degli animali e del Comitato uso (IACUC) alla Western Michigan University. 1. Gli animali <ol><li> Utilizzare i ratti maschi e femmine 3 mesi di età in questo studio. </li><li> Mantenere gli animali in un ciclo di 12 ore luce / buio con libero accesso a cibo e acqua. </li></ol> 2. Preparazione di KAX Cocktail per anestesia degli animali <ol><li> Sciogliere 50 mg di xilazina (20 mg / ml) in 5 ml di ketamina (100 mg / ml) con 1 ml acepromazine (10 mg / ml) e 3 ml di acqua distillata. Mescolare accuratamente. </li><li> Sterilizzazione con un filtro a siringa e conservare questa soluzione in un flacone di siero 10 ml. </li></ol> 3. KAX Iniezione <ol><li> Pesare animale (g) e ritornare alla gabbia fino pronta per l&#39;iniezione. </li><li> Iniettare 0,1 ml KAX / 100 g di peso corporeo degli animali per via intraperitoneale, utilizzando una siringa da insulina da 1 ml con un ago 28 G. </li><li> consentireper animali a perdere conoscenza. Controllare riflessi pizzicare i piedi e la coda. </li><li> Mantenere tutti gli animali in modo sicuro in laboratorio per la durata dell&#39;intervento. </li><li> Post-operatorio, sostituire gli animali nelle loro gabbie e mantenere confortevole a RT finché non viene ripreso conoscenza. Solo tornare animali per l&#39;impianto degli animali quando gli animali si svegliano e riprendere un comportamento normale. </li></ol> 4. preparazione per la chirurgia e montaggio Microneedle <ol><li> Fare uno sterile 2 soluzione M NaCl. </li><li> Utilizzare un estrattore microelettrodo (Figura 1C) per tirare uno 0,86 millimetri di diametro interno pesante standard di lucido e tubo borosilicato a parete sottile in due microaghi di vetro finemente conici (Figura 1D, 1E Figura). </li><li> Backfill un microago dal passaggio precedente con 2 M soluzione salina con un ago riempimento siringa e una siringa da 1 ml (Figura 1B). Toccare le bolle d&#39;aria dalla punta dell&#39;elettrodo. </li><li> Riempire una seconda siringa da 1 ml con 2 MNaCl. Collegare un ago G 18 e quindi collegare una lunghezza (circa 10 pollici) di tubo in polietilene (Figura 1A). Utilizzare lo stantuffo della siringa per riempire il tubo di polietilene con soluzione fisiologica attraverso l&#39;ago. </li><li> Quando sia il microago e tubetti sono riempite con soluzione salina, collegare accuratamente i due. Eliminare eventuale aria nella connessione tra loro (figura 2). </li><li> Finemente smussare la punta del microago raschiandola molto leggermente contro il grano di un tovagliolo di carta corso. </li><li> Controllare la resistenza del microago spingendo delicatamente lo stantuffo della siringa fino a quando un bel flusso di liquido può essere visto sul tovagliolo di carta. Il flusso di liquido deve essere più largo 0,5 mm. </li></ol> 5. Preparazione di Animal <ol><li> Applicare 1 - 2 gocce di anestetico topico per cornea (proparacaina cloridrato soluzione oftalmica, USP, 0,5%). Attendere fino a quando non si verifica alcun riflesso oculare. </li><li> Trim baffi con le forbici. </li><li> Saturate un cotton-fioc con la soluzione betadine e zona tampone intorno all&#39;occhio sperimentale. </li><li> Utilizzando un microscopio, allegare un emostatico per bloccare la palpebra inferiore a gonfiarsi l&#39;occhio, esporre la vena episclerale e limitare il movimento degli occhi. (Figura 3, punta di freccia) </li></ol> 6. Saline iniezione glaucoma che inducono <ol><li> Quando l&#39;assemblea microneedle e l&#39;animale sono preparati, iniziare le iniezioni. </li><li> Quando l&#39;animale si conferma essere insensibile a piedi / coda pizzico, perforare con attenzione la vena episclerale con il microago, venendo ad un angolo basso tra i 10 ei 20 gradi alla vena (Figura 3, freccia bianca). Una puntura successo nella vena è evidente quando il sangue entra nella punta del microago (Figura 3, freccia nera). </li><li> Lentamente e manualmente iniettare circa 50 microlitri di soluzione salina nella vena. Questo dovrebbe prendere circa 10 sec. Le vene saranno sbollentare bianca come il sale circola through del sistema vascolare (figura 4, punta di freccia). Alcune regioni possono mantenere un aspetto rosso sangue (figura 4, freccia). <ol><li> Eseguire una seconda iniezione nella vena, opposto al sito del primo, per garantire completa danno retinico allo strato completo di cellule gangliari retiniche. Nota: In pochi minuti, si dovrebbe vedere un aspetto torbido distinta attraverso l&#39;iride dell&#39;occhio come sali circola attraverso il sistema vascolare. </li></ol></li><li> Lasciare l&#39;occhio opposto greggia per uso come controllo interno. </li></ol> 7. il recupero degli animali <ol><li> Rimuovere la pinza emostatica. </li><li> Utilizzare un applicatore di cotone per applicare tripla pomata antibiotica (Bacitracin di zinco, solfato di neomicina, polymysin B solfato) al sito bloccato dalla pinza emostatica e ai siti di iniezione. Il danno tissutale intorno all&#39;occhio non si verifica utilizzando la pinza emostatica. </li><li> &gt; Luogo anestetizzato animali nelle loro gabbie su un circolante coperta di acqua calda per previpotermia ent. Mantenere gli animali sotto osservazione fino a quando la coscienza e il comportamento normale sono riacquistato. Trasportare animali svegli di nuovo alla colonia degli animali. Animali rimangono nella colonia fino al momento del sacrificio. </li></ol> 8. sacrificio animale e rimozione Retina <ol><li> Un mese dopo la procedura per indurre il glaucoma, gli animali sono eutanasia da CO 2 asfissia e la puntura toracica secondaria. <ol><li> Posto l&#39;animale nella camera e mettere il coperchio saldamente. </li><li> Aprire le valvole di CO 2 e regolatore del gas per permettere al 20% del volume / min CO 2 spostamento ossigeno nella camera. </li><li> Lasciare quattro a 5 minuti per l&#39;animale a scadenza. </li><li> Spegnere entrambe le valvole. </li><li> Rimuovere animale dalla camera ed eseguire una puntura toracico secondario con un bisturi sterile. </li></ol></li><li> Dopo l&#39;eutanasia, usare un bisturi per tagliare il tessuto connettivo nella cavità orbitale che circonda l&#39;occhio, being attenzione a non tagliare nel bulbo oculare stesso. </li><li> usare cautela forbici bordo curvo per tagliare il nervo ottico e qualsiasi tessuto rimanente per estrarre il bulbo oculare intatta. Mettere bulbo oculare estratto in una sterile 60 millimetri x 15 mm piastra di Petri monouso contenente PBS fresco. </li><li> Fare un oculare dal bulbo oculare. Per fare questo, fare una piccola incisione con il bisturi appena posteriore al confine tra l&#39;iride e la sclera. Seguire questa incisione intorno alla circonferenza dell&#39;occhio con piccole forbici a molla per rimuovere dell&#39;emisfero corneale dal bulbo oculare. L&#39;emisfero collegato al nervo ottico rimane. </li><li> Trova la retina molto sottile di colore rosa / beige all&#39;interno della conchiglia oculare dall&#39;animale eutanasia. Tenere lo strato pigmentato della retina con una pinza smussati per stabilizzare il paraocchi. Utilizzare un altro paio di pinze chiuse per prendere in giro molto delicatamente tutta la retina intatto al largo della parte posteriore dell&#39;occhio. Evitare di pizzicare, tirare, o tirando direttamente la retina. </li><li> Utilizzare piccole forbici per tagliare la primaveraarea in cui il nervo ottico è ancora attaccato alla retina. </li><li> Assicuratevi di tagliare via ogni residuo di epitelio pigmentato o tessuto sclerale dalla retina. </li><li> Usando una pipetta di trasferimento, trasferire molto delicatamente la retina isolata ad un Sylgard pulito rivestito 35 millimetri x 10 mm piastra di Petri contenente PBS fresco. </li></ol> 9. tutto il montaggio Retina Preparazione <ol><li> Una volta nel piatto Sylgard, usare una pinza e un ago cactus al pin della retina in posizione. Mantenere lo strato di cellule gangliari della retina rivolto verso l&#39;alto e verso il basso del nervo ottico. forma emisferica della retina è notevole, anche dopo la fissazione. La curvatura della retina si arricciano verso il soffitto quando lo strato di cellule gangliari retiniche è nell&#39;orientamento desiderato. </li><li> Utilizzare piccole forbici per tagliare la retina in quattro quadranti, rendendo la forma di un quadrifoglio irradia dalla testa del nervo ottico. </li><li> Pin i quadranti della retina con aghi di cactus aggiuntive per rendere la retina più piatta possibile without allungamento (Figura 5). </li><li> Fissare le retine riposte nel piatto Sylgard con 3 ml di paraformaldeide al 4% O / N a temperatura ambiente. </li></ol> 10. Anticorpo colorazione di Retina Nota: retine Stain fissi con anticorpi primari e secondari per la visualizzazione neuroni della retina (Figura 6). <ol><li> Risciacquare, retine piatto montato fisso tre volte per 2 minuti ciascuno in PBS. </li><li> Permeabilize le retine con 1% Triton X-100 con 1% di siero fetale bovino in PBS per 60 min. </li><li> Sciacquare retine per tre volte, 2 min ciascuna, in PBS. </li><li> Risciacquare due volte con 0,1% Triton X-100 in PBS, 5 min a lavaggio. </li><li> Sciacquare due volte con PBS, 5 minuti a lavaggio. </li><li> Incubare con 1% Triton X-100 e 1% di siero bovino fetale in PBS a temperatura ambiente per 45 min. </li><li> Risciacquare due volte con 0,1% Triton X-100 in PBS, 5 min a lavaggio. </li><li> Sciacquare due volte con PBS, 5 minuti a lavaggio. </li><li> Incubare ciascuna retina in 3 ml 1% di siero fetale bovino in PBScon il mouse purificato anti-topo CD90 / mouse CD90.1 (1: 300 diluizione) O / N a RT. </li><li> Risciacquare retine volta con 0,1% Triton X-100 in PBS per 5 min. </li><li> Sciacquare due volte con PBS, 5 minuti a lavaggio. </li><li> Incubare ciascuna retina in 3 ml di PBS (senza FBS) con secondario Alexa Fluor 594 capra anti-IgG di topo (1: 300) O / N a RT. </li><li> Lavare retine con PBS liberamente. </li><li> Utilizzando un microscopio da dissezione, rimuovere con attenzione gli aghi di cactus dalla retina. </li><li> trasferire delicatamente retine su vetrini da microscopio con una pipetta di trasferimento. Assicurarsi di mantenere l&#39;orientamento con strato di cellule gangliari della retina di fronte al soffitto. forma emisferica della retina è notevole, anche dopo la fissazione. La curvatura della retina si arricciano verso il soffitto quando lo strato di cellule gangliari retiniche è nell&#39;orientamento desiderato. </li><li> Assorbire ogni eccesso di PBS con KimWipe o altro materiale assorbente. Fare attenzione a non assorbire la retina. </li><li> Aggiungere 5 gocce di ½ glicerolo e ½ PBS in peso per la mattinamezzi ontaggio. </li><li> Coprire retina con vetrino, evitando bolle d&#39;aria. </li><li> coprioggetto protetta tramite smalto trasparente, colla o altro adesivo. </li></ol>

The authors have no conflicting or competing interests to disclose.

Questo protocollo descrive un metodo per indurre condizioni glaucoma simile in un modello in vivo di ratto in. Questa procedura utilizza una iniezione di soluzione salina ipertonica per indurre cicatrici nel trabecolato 29, 32. Sviluppare tessuto cicatriziale occlude il deflusso dell&#39;umore acqueo che aumenta la pressione nella camera anteriore. Con diminuito deflusso e la pressione si accumulano, la lente sospesa da legamenti elastici spinge indietro nella camera vitrea. vitreo poi appli...

Il glaucoma è un gruppo di malattie oculari che colpiscono i neuroni nella retina, in particolare, le cellule gangliari retiniche 1-2. Gli assoni di queste cellule convergono per diventare il nervo ottico che trasportano informazioni visive al cervello in cui viene percepita la visione. Danni alle RGCs e le loro assoni provoca quindi difetti visivi. Le caratteristiche principali associati a disturbi glaucoma sono RGC degenerazione e la morte, aumento della pressione intraoculare (IOP), e coppettazione disco ottico e atrofia. Queste caratteristiche portano alla perdita del campo visivo o totale, la cecità irreversibile. Attualmente, il glaucoma ha causato la cecità in 70 milioni di persone in tutto il mondo 3. Come tale, essa è la terza causa mondiale di cecità 4. Il meccanismo esatto della morte RGC nel glaucoma rimane sconosciuto. Gran parte della ricerca è stato fatto per svelare il mistero. È noto, tuttavia, che il principale fattore di rischio di glaucoma è un aumento in pressione intraoculare dovuta alla circolazione irregolare di umore acqueo (AH) nella camera anteriore dell&#39;occhio. AH agisce come alternativa trasparente e incolore di sangue nella camera anteriore dell&#39;occhio avascolare. Si nutre le cellule circostanti, rimuove i residui secreti dai processi metabolici, trasporti neurotrasmettitori, e permette la circolazione di farmaci e cellule infiammatorie all&#39;interno dell&#39;occhio durante gli stati patologici 1. Il mantenimento della circolazione di umore acqueo coinvolge il corpo ciliare e trabecolato. umor acqueo è prodotto dal corpo ciliare. Esso fluisce poi nella camera anteriore per mantenere la salute generale del tessuto oculare. 75 - 80% del deflusso dell&#39;umor acqueo viene secreto attivamente attraverso la non-pigmentazione dell&#39;epitelio ciliare quando il fluido viene filtrato attraverso tre strati di tessuto spugnoso nel muscolo ciliare. Le uscite fluido attraverso il trabecolato e attraverso canale di Schlemm che empti nel sistema sanguigno 5 .Il restante 20 - 25% del deflusso bypassa trabecolare che è passivamente secreti da ultrafiltrazione e diffusione attraverso la via uveo-sclerale. Questo percorso sembra essere relativamente indipendente dalla pressione intraoculare 1. Quando la produzione umore acqueo e deflusso sono in equilibrio, la pressione aumenta all&#39;interno dell&#39;occhio. Come detto, questo aumento della pressione intraoculare è il principale fattore di rischio per lo sviluppo di glaucoma. Tale pressione provoca danni agli strati intricate neuroni della retina nella parte posteriore dell&#39;occhio. Danni ai assoni delle cellule gangliari della retina del nervo ottico fa sì che il cervello a non ricevere più accurate informazioni visive. Come risultato, la percezione di visione è persa e può verificarsi completa cecità. Fino ad oggi, non esiste una cura per il glaucoma. Diversi metodi di trattamento esistenti che in primo luogo lo scopo di ridurre la pressione intraoculare. Questi includono attualitàclassi di farmaci come i bloccanti dei recettori beta1-adrenergici, o analoghi delle prostaglandine per uso topico. I beta-bloccanti riducono la pressione intraoculare riducendo la produzione di umore acqueo 7. Le prostaglandine funzione per ridurre la PIO aumentando il deflusso dell&#39;umore acqueo 8-14. Alfa agonisti adrenergici e inibitori dell&#39;anidrasi carbonica sono utilizzati anche come metodi secondari di trattamento. Alpha agonisti adrenergici aumentano deflusso attraverso la via uveosclerale 15-17. Inibitori dell&#39;anidrasi carbonica riducono la produzione di AH per inibizione enzimatica 18. Molto procedure più invasive vengono utilizzati anche per il trattamento del glaucoma. Trabeculoplastica laser è usato per aumentare il deflusso dell&#39;umore acqueo 19. Un&#39;altra terapia chirurgica, chiamata trabeculectomia, crea un sito di drenaggio alternativo per filtrare AH quando il percorso trabecolare tradizionale è bloccato 20-21. Queste opzioni di trattamento sono stati conosciuti per effettivamente ridurre la IOP. Tuttavia, fino al 40% dei pazienti affetti da glaucoma mostrano normali livelli di IOP suggerendo la necessità di metodi terapeutici più completi. 22,23 Inoltre, la morte delle cellule gangliari della retina visto nel glaucoma è irreversibile, una volta che inizia e trattamenti attuali non si fermano la progressione della malattia 24-28. Ciò ha evidenziato la necessità di efficaci terapie neuroprotettive che colpiscono la sopravvivenza dei neuroni stessi. Sviluppo di modelli glaucoma è fondamentale per questo sviluppo. In questo studio stiamo dimostrando un metodo di indurre effetti glaucoma simili nei ratti adulti lungo Evans utilizzando una procedura modificata originariamente delineato da Morrison 29. In questa procedura, iniezioni di 2 M soluzione salina ipertonica nel plesso venoso episclerale induce condizioni di glaucoma, come da cicatrici di tessuto per ridurre deflusso dell&#39;umore acqueo nel trabecolato che porta a un aumento della pressione intraoculare e una significativa perdita di RGCs wntro un mese dalla procedura di 30-31. procedure di glaucoma che inducono, come quella descritta qui, può essere la chiave per sbloccare nuovi sviluppi nel trattamento del glaucoma.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="982">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:299px;">Xylazine hydrochloride, Minimum 99%</td>
			<td style="width:156px;">Sigma, Life Science</td>
			<td style="width:200px;">X1251-1G</td>
			<td style="width:327px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/mL&#160;</td>
			<td>Putney, Inc</td>
			<td>NDC 26637-411-01</td>
			<td>10 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Acepromazine Maleate, 10mg/mL</td>
			<td>Phoenix Pharmaceutical, Inc</td>
			<td>NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408</td>
			<td>50 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Serum bottle, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16171319</td>
			<td>Borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">1 mL insulin syringe&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD329410</td>
			<td>28 gauge needle&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>S7653</td>
			<td>2 M Solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Microelectrode Puller&#160;</td>
			<td>Narishige Group</td>
			<td>PP-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>B150-86-10HP</td>
			<td>without filament, 0.86 mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Microfil syringe needle for filling micropipettes</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc</td>
			<td>MF28G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">18 gauge Luer-Lock needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1130421</td>
			<td>Syringe needle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Flexible Polyethylene Tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22046941</td>
			<td>0.034 inch diameter, approximately 10 inches&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5%</td>
			<td>Akorn, Inc</td>
			<td>NDC 17478-263-12</td>
			<td>15 mL&#160; sterile bottle&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Curved Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Microscope</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>StereoZoom 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Hemostat Clamp&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>1310912</td>
			<td>curved edge</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Triple Antibiotic Ointment&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0664481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>10004-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Scalpel blade # 11</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>10011-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate</td>
			<td>Sigma, Life Science&#160;</td>
			<td>P7059-1L</td>
			<td>1x dilution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>15009-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Forceps (2), Dumont # 5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">3 mL Transfer Pipets, polyethylene, non sterile</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>357524 or 52947-948</td>
			<td>1 and 2 mL graduations</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Sylgard 184</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102092-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Cactus Needles</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>EMD Millipore&#160;</td>
			<td>PX0055-3 or 818715.0100</td>
			<td>Made into a 4% solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>T9284-100 mL</td>
			<td>Made into both a 1% and 0.1% solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Atlanta Biological</td>
			<td>S11150</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>Cat 554892</td>
			<td>1:300 dilution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Alexa Fluor 594 goat anti-mouse&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>A11005</td>
			<td>1:300 dilution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Microscope Slides</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>2948-75x25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Glycerol&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>G5516-100 mL&#160;</td>
			<td>50% glycerol to 50% PBS, by weight&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Coverglass&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>2975-225</td>
			<td>Thickness 1 22 x 50 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>C2 Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glaucoma-inducing procedure in an in vivo rat model and whole-mount retina preparation

Il glaucoma è una malattia del sistema nervoso centrale che colpisce le cellule gangliari retiniche (RGC). assoni RGC che costituiscono il nervo ottico portano input visivo al cervello per la percezione visiva. Danni alle RGCs e ai loro assoni porta alla perdita della vista e / o cecità. Anche se la causa specifica del glaucoma è sconosciuto, il fattore di rischio per la malattia è una pressione intraoculare. procedure di glaucoma che inducono in modelli animali sono uno strumento prezioso per i ricercatori che studiano il meccanismo della morte RGC. Tali informazioni possono portare allo sviluppo di trattamenti neuroprotettivi efficaci che potrebbero essere di aiuto nella prevenzione della perdita della vista. Il protocollo in questo documento descrive un metodo per indurre glaucoma - come condizioni in un modello di ratto in vivo dove 50 ml di 2 M salina ipertonica viene iniettato nel plesso venoso episclerale. Sbiancamento dei vasi indica iniezione di successo. Questa procedura provoca la perdita di RGCs per simulare il glaucoma. Un mese dopoiniezione, animali vengono sacrificati e gli occhi vengono rimossi. Successivamente, la cornea, lenti, e vitreo vengono rimossi per fare un oculare. La retina è poi sfogliato dalla parte posteriore dell&#39;occhio e appuntato su piatti Sylgard utilizzando aghi di cactus. A questo punto, i neuroni della retina possono essere colorati per l&#39;analisi. I risultati di questo laboratorio mostrano che circa il 25% dei RGCs sono persi entro un mese della procedura rispetto ai controlli interni. Questa procedura consente di analisi quantitativa di morte delle cellule gangliari della retina in un modello di topo di glaucoma in vivo.

Questa sezione illustra i componenti apparecchiature e procedure utilizzate per indurre condizioni di glaucoma, come in un topo modello di glaucoma in vivo. Mostriamo i singoli strumenti e delle attrezzature utilizzate per eseguire una iniezione salina ipertonica che provoca un aumento della pressione intraoculare. Mostriamo l&#39;iniezione nel plesso venoso episclerale con il suo effetto scottatura caratteristico e l&#39;aspetto torbido della camera anteriore risultante. Abbiam...

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Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Glaucoma inducono Procedura in un<em&gt; In Vivo</em&gt; Modello di ratto e tutto il montaggio Retina Preparazione

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

glaucoma-inducing-procedure-an-vivo-rat-model-whole-mount-retina

Research

JoVE Journal

Medicine

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

12.9K Views.  Western Michigan University. Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis. 

Video: Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

Multi-modal Imaging di angiogenesi in un modello di ratto Nudo di metastasi ossee cancro al seno utilizzando la risonanza magnetica, tomografia computerizzata volumetrica e Ultrasuoni

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

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Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

Distacco della retina Modello in Roditori da iniezione sottoretinico di ialuronato di sodio

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo 19 F MRI per il tracciamento cellulare

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these diseases. Chronic retinal diseases such as retinal oedema or neovascularization usually require multiple intraocular injections to effectively treat the condition. However, the risks associated with these injections increase with repeated delivery of the drug. Therefore, alternative delivery methods need to be established in order to minimize the risks of reinjection. Several other investigations have developed methods to deliver drugs over extended time, through materials capable of releasing chemicals slowly into the eye. In this investigation, we outline the use of Elvax 40W, a copolymer resin, to act as a vehicle for drug delivery to the adult rat retina. The resin is made and loaded with the drug. The drug-resin complex is then implanted into the vitreous cavity, where it will slowly release the drug over time. This method was tested using 2-amino-4-phosphonobutyrate (APB), a glutamate analogue that blocks the light response of the retina. It was demonstrated that the APB was slowly released from the resin, and was able to block the retinal response by 7 days after implantation. This indicates that slow-release drug delivery using this copolymer resin is effective for treating the retina, and could be used therapeutically with further testing.

This paper details how Elvax 40W can be used as a slow-release method for drug delivery to the adult rat retina. The protocol for preparing, loading, and delivering the drug-resin complex to the eye is described.

Lento rilascio Drug Delivery attraverso Elvax 40W al Rat Retina: Implicazioni per il trattamento di condizioni croniche

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

Telemetria intrauterina misurare mouse contrattile Pressione<em&gt; In Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

L&#39;esaurimento delle cellule di topo da xenotrapianti tumorali umani migliora in modo significativo Analisi A valle delle cellule bersaglio

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No current animal models of diabetes and oxygen-induced retinopathy develop the full-range progressive changes manifested in human proliferative diabetic retinopathy (PDR). Therefore, understanding of the disease pathogenesis and pathophysiology has relied largely on the use of histological sections and vitreous samples in approaches that only provide steady-state information on the involved pathogenic factors. Increasing evidence indicates that dynamic cell-cell and cell-extracellular matrix (ECM) interactions in the context of three-dimensional (3D) microenvironments are essential for the mechanistic and functional studies towards the development of new treatment strategies. Therefore, we hypothesized that the pathological fibrovascular tissue surgically excised from eyes with PDR could be utilized to reliably unravel the cellular and molecular mechanisms of this devastating disease and to test the potential for novel clinical interventions. Towards this end, we developed a novel method for 3D ex vivo culture of surgically-excised patient-derived fibrovascular tissue (FT), which will serve as a relevant model of human PDR pathophysiology. The FTs are dissected into explants and embedded in fibrin matrix for ex vivo culture and 3D characterization. Whole-mount immunofluorescence of the native FTs and end-point cultures allows thorough investigation of tissue composition and multicellular processes, highlighting the importance of 3D tissue-level characterization for uncovering relevant features of PDR pathophysiology. This model will allow the simultaneous assessment of molecular mechanisms, cellular/tissue processes and treatment responses in the complex context of dynamic biochemical and physical interactions within the PDR tissue architecture and microenvironment. Since this model recapitulates PDR pathophysiology, it will also be amenable for testing or developing new treatments.

Here, we present a protocol to study the pathophysiology of proliferative diabetic retinopathy by using patient-derived, surgically-excised, fibrovascular tissues for three-dimensional native tissue characterization and ex vivo culture. This ex vivo culture model is also amenable for testing or developing new treatments.

Un modello di coltura del tessuto Ex Vivo per fibrovascolare complicazioni nella retinopatia diabetica proliferativa

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

Preparation Of Gushukang (GSK) Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

Traditional Chinese herbal medicine plays a role as an alternative method in treating many diseases, such as postmenopausal osteoporosis (POP). Gushukang (GSK) granules, a marketed prescription in China, have bone-protective effects in treating POP. Before administration to the body, one standard preparation procedure is commonly required, which aims to promote the release of active constituents from raw herbs and enhance the pharmacological effects as well as therapeutic outcomes. This study proposes a detailed protocol for using GSK granules in in vivo and in vitro experimental assays. The authors first provide a detailed protocol to calculate the animal-appropriate dosages of granules for in vivo investigation: weighing, dissolving, storage, and administration. Second, this article describes protocols for micro-CT scanning and the measurement of bone parameters. Sample preparation, protocols for running the micro-CT machine and quantification of bone parameters were evaluated. Third, serum-containing GSK granules are prepared, and drug-containing serum is extracted for in vitro osteoclastogenesis and osteoblastogenesis. GSK granules were intragastrically administered twice per day to rats for three consecutive days. Blood was then collected, centrifuged, inactivated, and filtered. Finally, serum was diluted and used for performing osteoclastogenesis and osteoblastogenesis. The protocol described here can be considered a reference for pharmacological investigations of herbal prescription medicines, such as granules.

Preparation Of Gushukang GSK Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

This article provides a detailed protocol for preparing a working solution of Gushukang granules for animal studies and GSK granule containing serum for in vitro experiments. This protocol can be applied to pharmacological investigations of herbal medicines as well as prescriptions for both in vivo and in vitro experiments.

Preparazione di Gushukang (GSK) Granuli per in vivo e in vitro

Traditional Chinese herbal medicine plays a role as an alternative method in treating many diseases, such as postmenopausal osteoporosis (POP). Gushukang ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic fatty liver disease, metabolic liver disease, and liver cancer) requires experimental manipulation of animal models and in vitro cell cultures. Both techniques have limitations, such as the requirement of large numbers of animals for in vivo manipulation. However, in vitro cell cultures do not reproduce the structure and function of the multicellular hepatic environment. The use of precision-cut liver slices is a technique in which uniform slices of viable mouse liver are maintained in laboratory tissue culture for experimental manipulation. This technique occupies an experimental niche that exists between animal studies and in vitro cell culture methods. The presented protocol describes a straightforward and reliable method to isolate and culture precision-cut liver slices from mice. As an application of this technique, ex vivo liver slices are treated with bile acids to simulate cholestatic liver injury and ultimately assess the mechanisms of hepatic fibrogenesis.

This protocol provides a simple and reliable method for the production of viable precision-cut liver slices from mice. The ex vivo tissue samples can be maintained under laboratory tissue culture conditions for multiple days, providing a flexible model to examine liver pathobiology.

Murine Precision-Cut Liver Slices come un modello Ex Vivo di biologia del fegato

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

Standardized Rat Coronary Ring Preparation and Real-Time Recording of Dynamic Tension Changes Along Vessel Diameter

As a key event of cardiovascular system diseases, coronary artery disease (CAD) has been widely regarded as the main culprit of atherosclerosis, myocardial infarction, and angina pectoris, which seriously threaten the life and health of people all over the world. However, how to record the dynamic biomechanical characteristics of isolated blood vessels has long puzzled people. Meanwhile, precise positioning and isolation of coronary arteries to measure in vitro dynamic vascular tension changes have become a trend in CAD drug development. The present protocol describes the macroscopic identification and microscopic separation of rat coronary arteries. The contraction and dilation function of the coronary artery ring along the vessel diameter was monitored using the established multi myograph system. The standardized and programmed protocols of coronary ring tension measurement, from sampling to data acquisition, tremendously improve the repeatability of the experimental data, which ensures the authenticity of vascular tension records after physiological, pathological, and drug intervention.

The present protocol describes the wire myograph technique for measuring vascular reactivity of the rat coronary artery.

Preparazione standardizzata dell'anello coronarico di ratto e registrazione in tempo reale delle variazioni di tensione dinamica lungo il diametro del vaso