SAS and MGA are supported by Project Grants, a Program Grant and Research Fellowships from the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC), and by funds from the Operational Infrastructure Support Program provided by the Victorian Government, Australia. MMH has support from a Peter MacCallum Foundation Grant.

IL-3 ve Preparasyon kaynak WEHI-3B-koşullandınlmış madde Not: Fare granülositik lösemi hücre hattı WEHI-3B, IL-3 ihtiva eden bir koşullu ortam üretmek üzere kültürlenir. <ol><li> Dulbecco Modifiye Kartal ortamında kültive WEHI-3B (DMEM),% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 1 glutamin, uzun ömürlü bir ek 50 ug / ml gentamisin. Bir T175 cm3 doku kültürü şişesi içinde, taze kültür ortamına 50 ml büyüme log fazında 5 x 10 6 hücre inoküle ila yaklaşık 7 gün süreyle büyümeye ya da hücreleri, yaklaşık 24 ile büyüme bunların log fazına geçene kadar - 48 saat (kültür içinde aşırı hücre ölümünü önlemek). 500 ml aynı anda üretilebilir - 200 toplu halde şekilde koşullu ortam, -20 ° C&#39;de birden fazla yıl boyunca saklanabilir olma yeteneğine sahiptir. </li><li> 15 dakika hücrelerin ve hücre artıklarının kaldırmak için 1000 x g&#39;de şişeleri ve spin sıvı ve hücre süzün. Süpernatant üst% 90 çıkarmakatant. 0.22 um filtre birimi ile filtre. </li><li> 1 ml, 50 ml, -20 ° C&#39;de depolama için 200 mi hacim ya da -70 ° içine kısım WEHI-3B koşullandırılmış ortam (CM). Daha küçük alikotları, uzun süreli depolama için deney hazırlanması, faktör bağımlı hücre çizgilerinin geçişi için kültür ortamı yapmak için ara hacim ve daha büyük miktarlar için de yararlıdır. IL-3, steril koşullar altında kullanılan bu yüzden çözülmüş ortam birkaç hafta muhafaza edilebilir, 4 ° C de, nispeten kararlıdır. </li><li> Seçenek olarak ise, bir 0.22 um filtre birimi ile filtrelenmiştir sonra, kültür ortamında seyreltilmiştir 50 ng / ml&#39;lik seviyelerde rekombinant fare IL-3 kullanımı. </li></ol> VEGFR-2-Epor-Ba / F3 ve Kontrol Ba / F3 Hücre Hatlarında 2. Kültür ve Değerlendirme <ol><li> DMEM kültür kontrolü Ba / F3 hücreleri,% 10 FBS, 50 ug / ml gentamisin ve penisilin / streptomisin takviyesi,% 1 L-glutamin ve% 10 WEHI-3B-CM stabilize. hücrelerinden her üç günde bir oranının yaklaşık 1:15 ilâ seyreltilerde Geçiş hücrelerilog fazında büyüyor. </li><li> DMEM kültür VEGFR2-EPOR-Ba / F3 hücreleri,% 10 FBS, 50 ug / ml gentamisin,% 1 L-glutamin ve% 10 WEHI-3B-sm ve 1 mg / ml G418 stabilize. log fazında büyüyen hücrelerden 01:15 seyreltilerde Passage hücreleri. Kimerik reseptörün yapımı ve ifade hakkında daha fazla bilgi için 24 Bkz. </li><li> orta log-faz kültürlerinden hasat kontrol Ba / F3 veya VEGFR2-Epor-Ba / F3 hücreleri. Yavaşça şişenin tabanından bu yapışmayan hücreler çıkarıldı pipetle. Orta IL-3 ihtiva eden kaldırma (hücre pelletini kurtarmak için 5 dakika boyunca 750 x g &#39;de 10 ml santrifüj), fare toniklik fosfat tamponlu tuzlu su, pH 7.3 (PBS) ile üç kez yıkanır. </li><li> 10,000 hücre başına, daha sonra yıkama WEHI-3B-CM veya rekombinant IL-3 olmaksızın tek DMEM ve katkı maddeleri ile birlikte hücreler, ve 7.4 x 10 4 hücre / ml (yani, 13.5 ul 1.000 hücre konsantrasyonunda bu ortam içinde tekrar süspansiyon bir hemasitometre kullanarak saymak suretiyle tespit edildiği üzere 135 ul) içinsırasıyla, tahlilde yarı-nicel veya nitel versiyonları kullanın. </li><li> Mavi Tripan çıkışı (DİKKAT) tarafından canlılığı hücreleri değerlendirin. hücre popülasyonu ile 1 ve bir hemositometrede 100 hücre az sayısı: PBS (% 0,4) 1 Tripan Mavisi karıştırın. boya alma Hücreler ölü ya da ölmekte kabul edilir. 98&#39;den% canlılığı deneyi gerçekleştirmek için gereklidir. </li></ol> 3. Yarı kantitatif Deneyi <ol><li> Oda sıcaklığında 72 oyuklu mikro plaka oyuklarına, IL-3-eksikli ortam 13.5 ul içinde ihtiva yıkanmış hücreler (1.000 hücre) ekleyin. yerçekimi önyargı hücre konsantrasyonunu değil hücre çökmesini sağlamak için aliquotting sırasında hücre süspansiyonu karıştırmak için özen gösterin. iyi kalibre P20 otomatik pipet ve otoklava ipuçlarını kullanın. </li><li> Bir kalibre edilmiş P20 pipet ya da tercihen P2 pipet kullanarak (oyuk başına 1.000 hücre içeren 15 ul&#39;lik bir son hacim yapmak 1.5 ul),% 10 hacminde kuyucuklara test örnekleri ve kontrol ekleyin. ca alRe örnekleri pH, tuz ve diğer sitostatik / potansiyel sitotoksik maddeler açısından Ba ​​/ F3 hücreleri için kültür koşulları ile uyumlu olmasını sağlamak için. Mümkün olan yerlerde, uygun bir ortam kullanmak ya da tampon (örneğin DMEM veya PBS sırasıyla) veya orta ya da tampon içerisinde seyreltilir. Aynı ucu ile öğütme karıştırma sağlayacaktır. </li><li> Kontrol örnekleri için, (i) tek başına ortam ihtiva eden dahil herhangi bir IL-3,; (Ii) WEHI-3BD-CM,% 10 nihai hacim de, tek başına ortam ilave edilir; ve / veya (iii) VEGF-A Resim IL-3 ihtiva eden, tek başına ortam içinde 100 ng / ml olacak şekilde seyreltilmiştir. </li><li> steril su, PBS veya ortam ile mikro plaka kullanılmayan kuyu doldurun ve izin gaz değişimi (su kağıt mendil ıslatılmış) ile nemlendirilmiş bir kap içinde plaka yerleştirin. % 10 CO2 bulunan nemli bir atmosferde kaplar içinde hücreler inkübe edin. Test örnekleri ve ortam bileşenleri mevcut ise, bu deney, konforlu bir kişi tarafından, 3 saat içinde ayarlanabilir. </li><li> tipik olarak 16 saat sonra plakalar değerlendirilmesiİnkübasyon bu pozitif ve negatif numuneler arasındaki zaman ayrım belirgindir. Hücreler kültür içinde nasıl göründüğünü örnekleri için bakınız Şekil 3. 100 × büyütme - 40 standart ters faz-kontrast mikroskop kullanılarak plakaları analiz edin. Not: Wells yuvarlak ve yarı saydam görünür hücreler içeren örneğin IL-3 veya VEGF-A destekleyici büyüme faktörleri ihtiva etmektedir. Destekleyici büyüme faktörleri olmaksızın veya tek başına ortam maddesi ile Wells yuvarlak hücre, hem de ölü veya ölmekte hücrelerin ve hücre artıklarının (ör Şekil 3C) sayısı azaltılmış olacaktır. 24-48 saat sonra inkübasyon de tahlil değerlendirilmesi hassasiyet için optimum olduğunu. </li></ol> 4. Kantitatif Biyoassay <ol><li> Oda sıcaklığında, bir standart 96 oyuklu mikrotiter plakasının oyuklarına IL-3-eksikli ortam içinde yıkanmış hücreler (135 ul 10,000 hücre) ekleyin. ce etkilemez yerçekimi tarafından hücre çökmesini sağlamak için aliquotting sırasında hücre süspansiyonu karıştırmak için özenll konsantrasyonu. </li><li> % 10 hacim (15 ul) kalibre edilmiş bir pipet (P20) kullanarak kuyulara test örnekleri ve kontrolleri ekleyin. Numuneler pH, tuz veya diğer sitostatik / potansiyel sitotoksik maddeler açısından Ba ​​/ F3 hücreleri için kültür koşulları ile uyumlu olmasını sağlamak için özen gösterin. Mümkün olan yerlerde, uygun bir ortam kullanmak ya da tampon (örn., DMEM ya da PBS) veya orta ya da tampon içerisinde seyreltilir. Filtre 0.22 mikron gözenek selüloz asetat santrifüj tüp filtre ünitesi kullanılarak küçük hacimlerde sterilize edin. </li><li> 48 saat süre ile,% 10 CO2 içeren nemlendirilmiş bir atmosferde hücreleri, büyüme faktörleri ve / veya önleyici ajanların karışımını inkübe edin. su ile ıslatılmış kağıt mendil vardır ve gaz alışverişini sağlayan nemlendirilmiş bir kap içinde tahlil gerçekleştirin. de viyabl hücre sayısının temsili göstergeler Kuluçka süresinin tamamlanmasından sonra, aşağıda belirtilen alternatif yöntemlerden birini kullanarak tahlil değerlendirilmesi bulunmaktadır. </li><li> Alternatif # 1: 3H-thymidine Ortaklığın Not: Bu miktar, 96 gözlü plaka formatında için tasarlanmıştır. <ol><li> 37 ° C (oyuk başına 150 ul hacim) 48 saat için deney plakalarının inkübasyondan sonra, (IL-3 / WEHI-3B CM olmayan Ba / F3 kültür ortamı) deney ortamı 50 ul bir hacim içinde, 3H-timidin ekleme oyuk başına 1 uCi nihai dozu verecek şekilde de 20 uCi / ml&#39;lik bir konsantrasyonda başına. </li><li> Bir hücre hasat cihazı kullanılarak hücrelerin hasat edilmesinden önce 37 ° C&#39;de bir 4 saat inkübe edin. sintilasyon filtreleri yerleştirerek bireysel örnekler ayıklamak ve bir sıvı sintilasyon sayacı ile miktarı belirlenir. </li></ol></li><li> Alternatif 2: Hücresel ATP Biyoparlaklık Tespiti Not: Bu yaklaşım popülasyonunda canlı hücreler yansıtan bir biyolüminesans sinyali üretebilir hücreleriyle birlikte bir ATP izleme ayıracı kullanır. <ol><li> Hücreleri, ATP ayıklamak ve üretmek için bir ATP İzleme Reaktifini kullanmak içinüreticinin talimatlarına uygun olarak lüminesan sinyal. 96 oyuklu bir plaka formatı ile uyumlu bir luminometre kullanılarak ışık yayılması okuyun. </li></ol></li><li> Alternatif # 3: Canlı hücreler tarafından Gösterge Boya enzimatik Azaltma Not: Resazurin dayalı tahliller hücre canlılığı iyi bir korelasyon göstermektedir. <ol><li> resazurin göre boya ile kültürlenen hücreler birleştirin ve üreticinin talimatlarına göre bir floresan plaka okuyucu kullanarak tahlilleri ölçmek. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ferrara, N., Gerber, H. P., LeCouter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+VEGF+and+its+receptors.">The biology of VEGF and its receptors.</a> Nat Med. 9, 669-676 (2003).</li><li>Achen, M. G., Stacker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor-D:signalling+mechanisms,+biology+and+clinical+relevance.">Vascular endothelial growth factor-D:signalling mechanisms, biology and clinical relevance.</a> Growth Factors. 5, 283-296 (2012).</li><li>Ferrara, N., Mass, R. D., Campa, C., Kim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+VEGF-A+to+treat+cancer+and+age-related+macular+degeneration.">Targeting VEGF-A to treat cancer and age-related macular degeneration.</a> Annu Rev Med. 58, 491-504 (2007).</li><li>Ferrara, N., Hillan, K. J., Gerber, H. P., Novotny, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+development+of+bevacizumab,+an+anti-VEGF+antibody+for+treating+cancer.">Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer.</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 391-400 (2004).</li><li>Korpelainen, E. I., Alitalo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+angiogenesis+and+lymphangiogenesis.">Signaling angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 10, 159-164 (1998).</li><li>Senger, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+cells+secrete+a+vascular+permeability+factor+that+promotes+accumulation+of+ascities+fluid.">Tumour cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascities fluid.</a> Science. 219, 983-985 (1983).</li><li>Joukov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+vascular+endothelial+growth+factor,+VEGF-C,+is+a+ligand+for+the+Flt-4+(VEGFR-3)+and+KDR+(VEGFR-2)+receptor+tyrosine+kinases.">A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt-4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases.</a> EMBO J. 15, 290-298 (1996).</li><li>Achen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+D+(VEGF-D)+is+a+ligand+for+the+tyrosine+kinases+VEGF+receptor+2+(Flk1)+and+VEGF+receptor+3+(Flt4).">Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor 2 (Flk1) and VEGF receptor 3 (Flt4).</a> Proc Natl Acad Sci USA. 95, 548-553 (1998).</li><li>Leppanen, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determinants+of+vascular+endothelial+growth+factor-D+receptor+binding+and+specificity.">Structural determinants of vascular endothelial growth factor-D receptor binding and specificity.</a> Blood. 117, 1507-1515 (2011).</li><li>Wise, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF)-like+protein+from+orf+virus+NZ2+binds+to+VEGFR2+and+neuropilin-1.">Vascular endothelial growth factor (VEGF)-like protein from orf virus NZ2 binds to VEGFR2 and neuropilin-1.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 3071-3076 (1999).</li><li>Yamazaki, Y., Takani, K., Atoda, H., Morita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snake+venom+vascular+endothelial+growth+factors+(VEGFs)+exhibit+potent+activity+through+their+specific+recognition+of+KDR+(VEGF+receptor+2).">Snake venom vascular endothelial growth factors (VEGFs) exhibit potent activity through their specific recognition of KDR (VEGF receptor 2).</a> J Biol Chem. 278, 51985-51988 (2003).</li><li>Stacker, S. A., Achen, M. G., Jussila, L., Baldwin, M. E., Alitalo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphangiogenesis+and+cancer+metastasis.">Lymphangiogenesis and cancer metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 2, 573-583 (2002).</li><li>Stacker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-D+promotes+the+metastatic+spread+of+tumor+cells+via+the+lymphatics.">VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics.</a> Nat Med. 7, 186-191 (2001).</li><li>Skobe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+tumor+lymphangiogenesis+by+VEGF-C+promotes+breast+cancer+metastasis.">Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis.</a> Nat Med. 7, 192-198 (2001).</li><li>Mandriota, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor-C-mediated+lymphangiogenesis+promotes+tumour+metastasis.">Vascular endothelial growth factor-C-mediated lymphangiogenesis promotes tumour metastasis.</a> EMBO J. 20, 672-682 (2001).</li><li>Stacker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphangiogenesis+and+lymphatic+vessel+remodelling+in+cancer.">Lymphangiogenesis and lymphatic vessel remodelling in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 14, 159-172 (2014).</li><li>Karnezis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-D+promotes+tumor+metastasis+by+regulating+prostaglandins+produced+by+the+collecting+lymphatic+endothelium.">VEGF-D promotes tumor metastasis by regulating prostaglandins produced by the collecting lymphatic endothelium.</a> Cancer Cell. 21, 181-195 (2012).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis:+an+organizing+principle+for+drug+discovery.">Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 6, 273-286 (2007).</li><li>Stacker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+vascular+endothelial+growth+factor-D+involves+proteolytic+processing+which+generates+non-covalent+homodimers.">Biosynthesis of vascular endothelial growth factor-D involves proteolytic processing which generates non-covalent homodimers.</a> J Biol Chem. 274, 32127-32136 (1999).</li><li>McColl, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmin+activates+the+lymphangiogenic+growth+factors+VEGF-C+and+VEGF-D.">Plasmin activates the lymphangiogenic growth factors VEGF-C and VEGF-D.</a> J Exp Med. 198, 863-868 (2003).</li><li>Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+human+endothelial+cells+derived+from+umbilical+veins.+Identification+by+morphologic+and+immunologic+criteria.">Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria.</a> J Clin Invest. 52, 2745-2756 (1973).</li><li>Shibuya, M., Claesson-Welsh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+by+VEGF+receptors+in+regulation+of+angiogenesis+and+lymphangiogenesis.">Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Exp Cell Res. 312, 549-560 (2006).</li><li>Pacifici, R. E., Thomason, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+tyrosine+kinase/cytokine+receptors+transmit+mitogenic+signals+in+response+to+ligand.">Hybrid tyrosine kinase/cytokine receptors transmit mitogenic signals in response to ligand.</a> J Biol Chem. 269, 1571-1574 (1994).</li><li>Stacker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutant+form+of+vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF)+that+lacks+VEGF+receptor-2+activation+retains+the+ability+to+induce+vascular+permeability.">A mutant form of vascular endothelial growth factor (VEGF) that lacks VEGF receptor-2 activation retains the ability to induce vascular permeability.</a> J Biol Chem. 274, 34884-34892 (1999).</li><li>Davydova, N., Roufail, S., Streltsov, V. A., Stacker, S. A., Achen, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+VD1+neutralizing+antibody+to+vascular+endothelial+growth+factor-D:+binding+epitope+and+relationship+to+receptor+binding.">The VD1 neutralizing antibody to vascular endothelial growth factor-D: binding epitope and relationship to receptor binding.</a> J Mol Biol. 407, 581-593 (2011).</li><li>Wise, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vascular+endothelial+growth+factors+vary+extensively+in+amino+acid+sequence,+receptor-binding+specificities,+and+the+ability+to+induce+vascular+permeability+yet+are+uniformly+active+mitogens.">Viral vascular endothelial growth factors vary extensively in amino acid sequence, receptor-binding specificities, and the ability to induce vascular permeability yet are uniformly active mitogens.</a> J Biol Chem. 278, 38004-38014 (2003).</li><li>Davydova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+human+vascular+endothelial+growth+factor-D+for+structural+and+preclinical+therapeutic+studies.">Preparation of human vascular endothelial growth factor-D for structural and preclinical therapeutic studies.</a> Protein Expr. Purif. 82, 232-239 (2012).</li><li>Baldwin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forms+of+mouse+vascular+endothelial+growth+factor-D+are+generated+by+RNA+splicing+and+proteolysis.">Multiple forms of mouse vascular endothelial growth factor-D are generated by RNA splicing and proteolysis.</a> J. Biol. Chem. 276, 44307-44314 (2001).</li><li>Baldwin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specificity+of+receptor+binding+by+vascular+endothelial+growth+factor-D+is+different+in+mouse+and+man.">The specificity of receptor binding by vascular endothelial growth factor-D is different in mouse and man.</a> J. Biol. Chem. 276, 19166-19171 (2001).</li><li>Makinen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+lymphatic+endothelial+cells+transduce+growth,+survival+and+migratory+signals+via+the+VEGF-C/D+receptor+VEGFR-3.">Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth, survival and migratory signals via the VEGF-C/D receptor VEGFR-3.</a> EMBOJ. 20, 4762-4773 (2001).</li><li>Achen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+to+vascular+endothelial+growth+factor-D+block+its+interactions+with+both+VEGF+receptor-2+and+VEGF+receptor-3.">Monoclonal antibodies to vascular endothelial growth factor-D block its interactions with both VEGF receptor-2 and VEGF receptor-3.</a> Eur J Biochem. 267, 2505-2515 (2000).</li><li>Bamford, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+COSMIC+(Catalogue+of+Somatic+Mutations+in+Cancer)+database+and+website.">The COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) database and website.</a> Br J Cancer. 91, 355-358 (2004).</li><li>Pleasance, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+catalogue+of+somatic+mutations+from+a+human+cancer+genome.">A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome.</a> Nature. 463, 191-196 (2010).</li></ol>

Steven A. İstifleme ve Marc M. Achen Sirkadiyen Technologies Ltd., büyüme faktörleri VEGF ailesi hedefleyerek terapötikler gelişmekte bir şirkette pay sahibi olan.

Burada tarif edilen deney, büyüme faktörleri bağlı olan yüksek canlılığının hücreleri kullanılarak dayanır. Hücreler, bu yüzden faktör bağımlı olmasını sağlamak, ve kimerik reseptörünün ekspresyonunu korumak için dikkatli bir şekilde kültüre edilmesi gerekebilir. orta taze yapılmış ve aşırı uzun süre ve WEHI-3D ​​CM önemli derece aktif olduğunu depolanmaz sağlanması. Hücreler, iyice tahlisiye ligandlarına hücrelerin maruz zaman kalıntı, IL-3 tahlili kontamine olmasını ...

salgılanan protein, büyüme faktörleri ve aynı kökenli hücre yüzeyi reseptörlerinin, vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) ailesinin eriyebilir ligandların ve membrana gömülü reseptörler, hücre membranları üzerinde işaretlerinin transdüklenmesinden sırasıyla bu işlev önemli ve farklı bir gruptur. Bu endotel hücreleri, aynı zamanda epitel kaynaklı hücreler ve bağışıklık sistemi 1,2 kişilerce temel olarak işlev görür. sık görülen klinik kullanımda bunları hedefleyici ligand ile aktive edilen VEGF reseptörleri (VEGFR), yaşa bağlı makula dejenerasyonu ve kanser gibi önemli hastalığı, kritiktir ve terapötik tarafından angaje sinyal yollannın (örn, VEGF-A hedef monoklonal antikoru bevakizumab) 3,4. VEGF ailesinin karmaşıklığını bir doğada bulunan çözülebilir ligandlan (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, parapox virüs ailesi ORF ve yılan zehiri VEGF, artı diğer tarafından kodlanan VEGF proteinlerinin çeşitliliğidir inhibitörVEGF-A) 2 izoformları. Bu ligandlar yani reseptör tirozin kinaz ailesinin üç üyesi, VEGFR-1, VEGFR-2 ve VEGFR-3 ile etkileşim. Bu reseptörler değişken, farklı hücre tiplerinde ifade edilir fakat genellikle tüm boyutları 5, kan ve lenf damarları kaplayan endotel hücrelerinin yüzeyi üzerinde birlikte ifade edilmiştir. VEGFR-2, memeli VEGF-A 6, VEGF-C ve VEGF-7 D 8,9 olarak orf VEGF 10 ve yılan zehiri VEGF 11 ligandlarına bağlanabildiği. VEGFR-2 anjiyojenez, embriyonik gelişme (daha önceden mevcut damarlardan yeni kan damarlarının büyümesi), yara iyileşmesi, kanser ve göz hastalıkları sürüş önemli bir rol oynar. Bu bağlamda, bu tür VEGF-A, -C ve D bir bağ olarak ve ligandlar, kan damar endotel hücreleri 12-15 reseptörünü aktive eder. Lenfatik endotel hücreleri üzerinde VEGFR-2 lenfanjiyogenezin rol yeni lenfatik damarların 16 oluşumunu oynar. VEGFR-2 de dilatasyon ve sağlıklı doku ve hastalık 17 büyük arterlerin ve lenfatiklerden genişlemesini teşvik edebilir. VEGFR-2&#39;nin tam bir anlayış: ligand etkileşimleri anjiojen bağımlı hastalıklar 18 iyileştirilmesinde kullanım için inhibitörlerin geliştirilmesi için önemlidir. VEGFR-2&#39;ye, VEGF-A bağlama en izoformlar, VEGF-C ve VEGF-D proteolitik bölünme VEGFR-2 19,20 yüksek afıniteli bağlanma sergiler VEGF-homoloji alanı kapsayan bir fragman serbest bırakmak için gerekli olsa da. Biz 21 (özel ortam gerektiren) birincil endotel pasaja teknik olarak zor olan hücreler, satın almak için pahalı ve kültür ihtiyacını aşmak için tasarlanmıştır VEGFR-2&#39;nin ligandlar izlemek için bir biyoassay geliştirilen ve çoklu VEGFR&#39;yi ifade ve ko- ilişkili olan 22 reseptörleri. saplama amacıyla, diğer VEGF reseptörleri ya da ko-reseptörleri ile VEGFR-2&#39;nin heterodimerizasyon istenmeyen karmaşıklık neden olabilirY çift reseptör-ligand etkileşimleri, spesifik bir reseptöre bağlanabilir etkinliğini ya da önleyici reaktifler etkisini değerlendirmek. 23. biyo-deney hücre membranında ilgili alıcı hareketliliğini koruyan ve bir ligand en bağlanma yeteneği ve çapraz-link VEGFR-2 hücre dışı bölgesinin değerlendirme sağlar. biyo-deney (bu durumda, VEGFR-2), bir VEGF reseptörünün hücre dışı bölgesi transmembran ve eritropoietin reseptörü (EPOR), sitokin reseptör ailesinin bir üyesi hücre içi bölgeleri ile birleştirildiği edildiği bir kimerik reseptörünün oluşturulması dayanır 8,24. Bu füzyon proteini daha sonra, faktör bağımlı ön-B hücre hattı Ba / F3 olarak ifade edilir bağlanması ve reseptörün hücre dışı alanı edebilen sitoplazmik efektör bölge aktivasyonuna neden olan çapraz bağlama yeteneğine sahip bir ligand ile bu stimülasyon üzerine hücreyi tanıtmak için Janus kinazlar (JAK) aracılığıyla bir hayatta kalma sinyal nakletmehayatta kalması ve / veya çoğalması. Bunun aksine, ligand ile tam uzunlukta VEGFR-2, aynı hücre tipinde ve stimülasyon sentezleme, VEGFR-2 yolunun yakın sinyal efektörleri, bu hücre tipinde uygun olmadıklarını gösteren hücre hayatta kalma ve proliferasyon teşvik etmez. Bu yeni VEGFR-2 ligand 10,19,20,24-29 bağlanmasını keşfetmek için bağlamlarda çeşitli tahlili kullanılmıştır. Bir VEGFR-3-EPOR-Ba / F3 tahlili ile birlikte, bağlayıcı ve VEGFR-2 ve VEGFR-3 30 çapraz bağlama için göreceli VEGF-C&#39;nin etkinliklerini ve VEGF-D büyüme faktörleri karşılaştırılmıştır. Deney VEGFR-2 veya VEGF-D, çözülebilir VEGFR-2 tutucu ve VEGF ailesi 31 hedefleme peptidomimetikleri monoklonal antikorların nötralize edici inhibitör aktivitesinin karakterize edilmesi için kullanılmıştır. Tahlil, aynı zamanda primer endotel hücreleri bağlanan farklı orf soylarından VEGF&#39;lerinde yeteneğini ve çapraz bağ VEGFR-2, test öncesi göstermek için kullanılan <s&gt; 10,26 kadar. Deney daha zahmetli endotel hücre deneyleri 25 ya da temizleme büyüme değerlendirmek protokolleri 27 faktörleri sunulmadan önce hızlı bir şekilde aktivitesi için değerlendirilebilir VEGF&#39;lerinde mutantlarının süratle taranması için özellikle yararlıdır. Bu tarif deney uygulaması kolaydır, ve yarı-kantitatif versiyonu büyüme faktörleri, antikorlar ya da başka deneyler için çözünebilir reseptör alanlarının üretim veya saflaştırma takip bazen gereklidir pratik belirlemeleri için izin verir. tahlilinde kullanım kolaylığı spesifik dokular veya organ sistemleri ile kan veya lenf damarları türetilen primer endotel hücreleri ile yapılan daha fazla ve daha eksiksiz çalışmalar için ideal bir tamamlayıcısı yapar.

<table><tbody><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer</td></tr><tr><td>G418 Sulphate (Geneticin)</td><td>Invivogen</td><td>ant-gn-5</td><td>Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties.</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H-Thymidine</td><td>PerkinElmer</td><td>NET-027</td><td>This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation</td></tr><tr><td>Vialight Plus Kit</td><td>Lonza</td><td>LT07-221</td><td>Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent</td></tr><tr><td>Prestoblue Cell Viability Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>A13261</td><td>Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell</td></tr><tr><td>Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well)</td><td>Thermo Scientific</td><td>136528</td><td>Small microtitre plate</td></tr><tr><td>96 well Tissue Culture Plate</td><td>Falcon, Corning Inc.</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1X)</td><td>Gibco</td><td>11965-92</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100X)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>&amp;nbsp;10099-141</td><td></td></tr><tr><td>Cell Harvester</td><td>Tomtec Life Sciences</td><td></td><td>Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester</td></tr><tr><td>Liquid Scintillation Counter</td><td>LKB Wallac</td><td>1205</td><td>LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter</td></tr><tr><td>UniFilter-96 GF/B</td><td>Perkin Elmer</td><td>6005177</td><td>White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 &amp;micro;m poresize</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0.22 um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit</td><td>Costar, Corning Inc.</td><td>8160</td><td>Centrifuge tube filters have a 0.22 &amp;micro;m pore CA membrane-containing filter unit within a 500 &amp;micro;l capacity polypropylene microcentrifuge tube.</td></tr><tr><td>Fluorescence Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td>BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

a simple bioassay for the evaluation of vascular endothelial growth factors

vasküler biyolojide rol oynayan reseptör tirozin kinazlar ve bunların etkileşime giren ligandlar analizi ilişkili reseptörlerin ilgili ligandların geniş bir yelpazesi ve özel bir endotel hücrelerinin primer kültürleri ile ilgili zorluk ailesine yapısal ifadesi genellikle zordur. Burada, vasküler endotel büyüme faktörü reseptör-2 (VEGFR-2), anjiyogenez ve lenfanjiyogenezin teşvik sinyallerin önemli bir transdüktör ligandların belirlenmesi için bir biyolojik tayini açıklamaktadır. transmembran ve eritropoietin reseptörü (EPOR) sitoplazmik bölgeleri ile VEGFR-2&#39;nin hücre dışı (ligand bağlayıcı) bölgesinin bir füzyonunu kodlayan bir cDNA faktör bağımlı hücre çizgisi Ba / F3 olarak ifade edilir. Bu hücre hattı, 24 saat içinde hücrelerin ölümü ile interlökin-3 (IL-3) ve bu etken sonuçların çekilmesine mevcudiyetinde artmaktadır. VEGFR-2 / EPOR reseptör füzyon ekspresyonu hayatta kalma ve potentia teşvik etmek için alternatif bir mekanizma sağlarbağlanması ve füzyon proteini (yani, bir olabilir çapraz bağlantı VEGFR-2 hücre dışı bölgesi) hücre dışı kısmının çapraz bağlama yeteneğine sahip bir ligand mevcudiyetinde kararlı bir şekilde transfekte edilmiş Ba / F3 hücrelerinin lly çoğalması. ligand ve küçük hücre hacimleri, 24 saat hızlı bir sonucu imkan veren bir yarı-kantitatif bir yaklaşım, bir canlı hücre sayısı temsili göstergeler içeren kantitatif bir yaklaşım: deney iki yolla gerçekleştirilebilir. deney yapmak için nispeten kolaydır, bilinen VEGFR-2 ligandları yüksek ölçüde duyarlı ve VEGFR-2 gibi reseptör veya ligand ve çözülebilir bağ trans monoklonal antikorlar gibi sinyal hücre dışı inhibitörleri barındırabilir.

Bu bölümde, bir VEGFR-2-EPOR-Ba / F3 biyoassay (tahlilinde ilkelerine Şekil 1 e bakınız) temel özelliklerini gösteren bir deneyin sonuçlarını gösterir. Diğer Çalışmalar, alternatif bir VEGFR-2 ligandları mutan VEGF molekülleri ve inhibitör monoklonal antikorlar 8,10,19,24-30 tahlilinin daha geniş bir uygulama göstermektedir. Burada sunulan veriler, VEGFR-2-EPOR-Ba / F3 biyo-anali...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors at JoVE.com

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

Biz, tespit miktarının ve ligandların vasküler endotelyal büyüme faktörü ailesinin üyelerinin aktivitesini izlemek için basit bir hücre bazlı biyolojik tayini açıklamaktadır. Deney ligand ile reseptör ve çapraz bağlama bir yarı-nicel veya kantitatif bir değerlendirmesini sağlamak için bir faktör bağımlı hücre hattı içinde ilave kimerik reseptörler kullanır.

Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörlerinin Değerlendirilmesi için Basit Biyoassay

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

a-simple-bioassay-for-evaluation-vascular-endothelial-growth

Research

JoVE Journal

Biology

9.6K Görüntüleme.  Peter MacCallum Cancer Centre.  Biz, tespit miktarının ve ligandların vasküler endotelyal büyüme faktörü ailesinin üyelerinin aktivitesini izlemek için basit bir hücre bazlı biyolojik tayini açıklamaktadır. Deney ligand ile reseptör ve çapraz bağlama bir yarı-nicel veya kantitatif bir değerlendirmesini sağlamak için bir faktör bağımlı hücre hattı içinde ilave kimerik reseptörler kullanır. 

Video: A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, branching, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane.  Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels within the assays often do not resemble vessels in vivo.  Based on earlier work by Nehls and Drenckhahn, we have optimized an in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts.  This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis and, importantly, the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. EC are coated onto cytodex microcarriers and embedded into a fibrin gel.  Fibroblasts are layered on top of the gel where they provide necessary soluble factors that promote EC sprouting from the surface of the beads.  After several days, numerous vessels are present that can easily be observed under phase-contrast and time-lapse microscopy. This video demonstrates the key steps in setting up these cultures.

This video demonstrates the protocol of an in vitro angiogenesis assay that recapitulates several stages of angiogenesis. Time-lapse images of sprouting, lumen formation, branching and anastomosis - key features of angiogenesis - are shown.

Anjiyogenez Çalışmaları için optimize edilmiş Fibrin Jel Boncuk Testi

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Biyoloji

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

Deneyleri roman endotel düzenleyiciler inflamatuvar yanıtta yer alan karakterize etmek için eleme

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis1. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.

This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.

Stratejik Endotel Hücre Tüp Oluşumu Testi: Azaltılmış Ekstrasellüler Matrix Ekstrasellüler Matrix ve Büyüme Faktörü Karşılaştırılması

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Tıp

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor 
tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated
by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is 
translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit 
sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network 
to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes
 most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; 
(iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the 
assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses 
observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay 
allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern 
formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular 
structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in 
terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of 
discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, 
including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., 
angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates 
VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) 
low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined 
effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normal adult vascularized mammalian tissue that lacks physiologic angiogenesis and that has not been exposed to surgical intervention is used to study: (i) the initiation and development of angiogenesis following intraperitoneal administration of test agents; and (ii) modification of angiogenesis following systemic administration of selected test agents.

Rat mezenter Anjiyogenez Testi

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

Endotel Hücre için Tüp Deneyi birleşimi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Anjiyogenezin Çalışması

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired factors are introduced into cold-liquid ECM-mimic gel which, after subcutaneous injection, solidifies to form an environment mimicking the cancer milieu. This matrix permits the penetration of host cells, such as endothelial cells, and therefore, the formation of vasculature.
Herein we propose a new modified matrigel plug assay, which can be exploited to illustrate the angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells, as opposed to a specific factor (e.g., bFGF and VEGF) or agent. The plug containing ECM-mimic gel is utilized to introduce the host (i.e., mouse) with a pool of factors secreted to the C.M. of fast-growing tumor-generating glioblastoma cells. We have previously described an extensive comparison of the angiogenic potential of U-87 MG human glioblastoma and its dormant-derived clone, in this system model, showing induced angiogenesis in the U-87 MG parental cells. The C.M. is prepared by filtering collected media from confluent tissue culture plates of either cell line following 48 hr incubation. Hence, it contains only factors secreted by the cells, without the cells themselves. Described here is the combination of two imaging modalities, microbubbles contrast-enhanced ultrasound imaging and intravital fibered-confocal endomicroscopy, for an accurate, real-time characterization of the extent, morphology and functionality of newly-formed blood vessels within the plugs.

We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.).&#160;

Hızlı büyüyen Tümör üreten hücreleri tarafından salgılanan faktörler tarafından işe alınmış İzleme İşlevsellik ve vaskülatürüne morfolojisi

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired ...

Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby the permeability of the endothelium to blood cells, plasma macromolecules, and water can be adapted according to the physiological need. In certain diseases, cytokines and growth factors are released that target the endothelial barrier to transiently increase vascular permeability; however, their prolonged presence may cause chronic vascular hyperpermeability and thereby tissue-damaging edema. The Miles assay is an in vivo technique that allows researchers to study vascular hyperpermeability through the proxy measurement of vascular leakage. Here, we provide a detailed protocol on how to perform this procedure in the mouse, which is the most widely used model organism to study mammalian physiology and pathology. The procedure involves the intravenous injection of Evans blue dye to label the circulating albumin followed by multiple intradermal injections of permeability-inducing agents and vehicle control solutions into opposing flanks of the mouse. Consequently, Evans blue dye gradually leaks into the dermis, where it accumulates and can be extracted for quantification as leakage induced by the permeability-inducing agent relative to the vehicle. The Miles assay can be performed in wild type or genetically modified mouse models and may be combined with drug administration to study molecular mechanisms that regulate vascular permeability and identify agents/targets capable of inducing or blocking hyperpermeability.

Here, we present a protocol to measure the vascular leakage induced by intradermal administration of permeability promoting agents into the murine skin. This technique can be used to determine the ability of molecules to promote or inhibit vascular leakage or to study the molecular mechanisms that regulate vascular permeability.

Vasküler Hyperpermeability indükleyici ajanlar cilt mil tahlil ile değerlendirilmesi

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...

Demonstrating a Linear Relationship Between Vascular Endothelial Growth Factor and Luteinizing Hormone in Kidney Cortex Extracts

Vascular endothelial growth factor (VEGF) helps to control angiogenesis and vascular permeability in the kidney. Renal disorders, such as diabetic nephropathy, are associated with VEGF dysregulation in the kidney. The factors that govern VEGF under physiologic conditions in the kidney are not well-understood. Luteinizing hormone (LH), a pro-angiogenic hormone, helps regulate physiologic VEGF expression in reproductive organs. Given that LH receptors are found in the kidney, we, at Zietchick Research Institute, hypothesized here that LH also helps regulate VEGF expression in the kidney as well. To provide evidence, we aimed to show that LH levels are able to predict VEGF levels in the mammalian kidney. Most VEGF-related investigations involving the kidney have used lower order mammals as models (i.e., rodents and rabbits). To translate this work to the human body, it was decided to examine the relationship between VEGF and LH in higher order mammals (i.e., bovine and porcine models). This protocol uses the total protein lysate from the kidney cortex. Keys to this method&#39;s success include procurement of kidneys from slaughterhouse animals immediately after death as well as normalization of analyte levels (in the kidney extract) by total protein. This study successfully demonstrates a significant linear relationship between LH and VEGF in both bovine and porcine kidneys. The results are reproducible in two different species. The study provides supporting evidence that the use of kidney extracts from cows and pigs are an excellent, economical, and abundant resource for the study of renal physiology, particularly for examining the correlation between VEGF and other analytes.

Presented here is a protocol for utilizing a cortical kidney extract preparation and total protein normalization to demonstrate the correlation between vascular endothelial growth factor and luteinizing hormone in the mammalian kidney.

Böbrek Korteks Ekstrelerinde Vasküler EndotelBüyüme Faktörü ile Luteinizan Hormon Arasında Doğrusal İlişki Nin Gösterilmesi

Vascular endothelial growth factor (VEGF) helps to control angiogenesis and vascular permeability in the kidney. Renal disorders, such as diabetic ...

Çizik Yara Migrasyonu ve Sferoid Filizlenme Deneyleri Kullanılarak Anjiyogenez Çalışması

Investigating Angiogenesis on a Functional and Molecular Level by Leveraging the Scratch Wound Migration Assay and the Spheroid Sprouting Assay

Angiogenesis plays a crucial role in both physiological and pathological processes within the body including tumor growth or neovascular eye disease. A detailed understanding of the underlying molecular mechanisms and reliable screening models are essential for targeting diseases effectively and developing new therapeutic options. Several in vitro assays have been developed to model angiogenesis, capitalizing on the opportunities a controlled environment provides to elucidate angiogenic drivers at a molecular level and screen for therapeutic targets.
This study presents workflows for investigating angiogenesis in vitro using human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). We detail a scratch wound migration assay utilizing a live cell imaging system measuring endothelial cell migration in a 2D setting and the spheroid sprouting assay assessing endothelial cell sprouting in a 3D setting provided by a collagen matrix. Additionally, we outline strategies for sample preparation to enable further molecular analyses such as transcriptomics, particularly in the 3D setting, including RNA extraction as well as immunocytochemistry. Altogether, this framework offers scientists a reliable and versatile toolset to pursue their scientific inquiries in in vitro angiogenesis assays.

Yazar Spotlight: Test Geliştirmedeki Zorluklar ve Yenilikler Yoluyla Anjiyogenezin İncelenmesi

This study presents the two-dimensional (2D) scratch wound migration assay and the three-dimensional (3D) spheroid sprouting assay, along with their respective downstream analysis methods, including RNA extraction and immunocytochemistry, as suitable assays to study angiogenesis in vitro.

Çizik Yara Migrasyon Testi ve Sferoid Filizlenme Testinden Yararlanarak Anjiyogenezin Fonksiyonel ve Moleküler Düzeyde İncelenmesi

Angiogenesis plays a crucial role in both physiological and pathological processes within the body including tumor growth or neovascular eye disease. A ...

Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörlerinin Değerlendirilmesi için Basit Biyoassay

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Anjiyogenez Çalışmaları için optimize edilmiş Fibrin Jel Boncuk Testi

Deneyleri roman endotel düzenleyiciler inflamatuvar yanıtta yer alan karakterize etmek için eleme

Stratejik Endotel Hücre Tüp Oluşumu Testi: Azaltılmış Ekstrasellüler Matrix Ekstrasellüler Matrix ve Büyüme Faktörü Karşılaştırılması

Rat mezenter Anjiyogenez Testi

Endotel Hücre için Tüp Deneyi birleşimi

Hızlı büyüyen Tümör üreten hücreleri tarafından salgılanan faktörler tarafından işe alınmış İzleme İşlevsellik ve vaskülatürüne morfolojisi

Vasküler Hyperpermeability indükleyici ajanlar cilt mil tahlil ile değerlendirilmesi

Böbrek Korteks Ekstrelerinde Vasküler EndotelBüyüme Faktörü ile Luteinizan Hormon Arasında Doğrusal İlişki Nin Gösterilmesi

Çizik Yara Migrasyon Testi ve Sferoid Filizlenme Testinden Yararlanarak Anjiyogenezin Fonksiyonel ve Moleküler Düzeyde İncelenmesi

Çizik Yara Migrasyon Testi ve Sferoid Filizlenme Testinden Yararlanarak Anjiyogenezin Fonksiyonel ve Moleküler Düzeyde İncelenmesi