İsveç Tıbbi Araştırma Konseyi (hibe 5942) tarafından çalışmalar için mali destek sağlanmıştır.

1. Hayvanlar <ol><li> Gibi, fare, sıçan, ve kobaylar gibi küçük kemirgenler, hayvan modellerinde olarak kullanılmaktadır. Ne yazık ki, yetişkin farelerde (birçok fare suşlarının değerlendirilmiştir) güvenilmez fareler kullanılarak çalışmalar yapar, kendi mezenterik pencereleri içinde potansiyel ebeveynli mikrodamarlar sadece çok düşük bir sayı (anjiyogenez köken aldığı) eksikliği ya da sahip olmak eğilimindedir. Bu nedenle tahlil öncelikle sıçanlar için geliştirilmiştir. </li><li> Sıçanlar, damızlık teslim edildikten sonra en az 7 gün boyunca standart bir ortama alışmanız genelde su ve pelet ücretsiz erişim ile 12 saat aydınlık / karanlık döngüsü altında standart bir kafes çiftleri yerleştirilmiştir. Her hayvan işaretlenir. Çeşitli yetiştiriciler elde edilen; Biz çoğunlukla genç erişkin sıçan (yaş 5-6 hafta daha genç sıçanlarda yerli mikrodamarlar sayısının düşük olma eğilimi çeşitli suşları yaşı genellikle 7-10 hafta ancak genellikle erkek Sprague-Dawley rat). Önce deney ve deney boyunca dönemde, hayvanların her ikinci gün tartılır ve her zaman fedakarlık günü. Hayvanlar, eş zamanlı olarak ip tedavi edildiğinde (anjiyogenez indüksiyonu için aşağıya bakınız) ve sc veya iv veya po, onlar her gün tartılır. Bu deney başlangıcında eşit vücut ağırlığının deney ve kontrol grupları kurulmasını sağlar ve deney sırasında vücut ağırlığı-kazanç tedavi etkisinin izlenmesine olanak sağlar. Erişkin erkek sıçanlarda fizyolojik güçlü bir büyümeye (gerilme tipine bağlı olarak haftada yaklaşık 40-60 g kazanıyor), kilo alımı geriliği hassas bir yerine refahı sistemik toksisite işaretleyici, iştahsızlık, gelişme geriliği. </li></ol> Biz, yüksek standart bir hayvan bakım tesisi çalışma ve önemli çabalar, hayvanların yaşadığı stres düzeyini en aza indirmek için yapılır. Geçerli etik kurallar Workman P. ve arkadaşları tarafından kurulmuş olan (kanser araştırma hayvanların refah ve kullanımı için rehber. Br. J. Kanser 102, 1555-1577, 2010). Göteborg Üniversitesi Hayvan Etik Kurul, bu çalışmalar onayladı. 2. Pro-anjiyogenik İntraperitoneal Tedavi <ol><li> Test edilecek aday pro-anjiyo-faktör çözülür ve hastaların infüzyon için kullanılan endotoksin içermeyen tuzlu su içinde seyreltilmesi (son derece düşük seviyelerde bile, endotoksin pro-anjiyogenik). Tüm çözümler, enjeksiyon gününde, steril filtrelenmiş (Millipore 0.22 mikron filtrasyon) taze yapılmış, nötr pH (7,1-7,3) kontrol ve oda sıcaklığında kullanılır. Test aracı, düşük ya da çok düşük konsantrasyonlarda enjekte edilir. Örneğin, sıçan rVEGF 164 (564-RV/CF, Ar-Ge Systems Europe Ltd, Oxon, Birleşik Krallık) baskın VEGF-A sıçanlarda izoformu, dondurulmuş, endotoksin ücretsiz salin 96 pmole / ml seyreltilir çözülmüş ve sıçan 5 ml&#39;lik bir hacim içine ip enjekte edilir. Biz ip enjeksiyon için 0.8 mm iğne ile (yeşil iğne, 21G) 5 ml şırınga kullanın. Pazartesi sabahı (Gün 0) Cuma sabahı (4. Gün) 4.5 gün, yani günde iki kez verilen bu tedavi, etrafında Gün 21 pik, mezenterik testi dokusu sağlam bir çimlenme anjiyogenez tepki neden olur. Çözüm ip yönetme tüm hacim periton boşluğuna (ve bağırsak, mesane ya da diğer herhangi bir organı içine) teslim olmasını sağlar. 5 ml, sıvı jet karın boşluğuna karın duvarı üzerinden geçtiğini operatör tarafından hızlı enjeksiyon dokunsal onay sağlar. Takiben, önce ip pro-anjiyogenik tedavi ile ya da eş zamanlı olarak, herhangi bir test aracı seçim sistemik uygulanan olabilir. </li></ol> 3. Sistemik administation Anjiyogenez modülasyon Ajanlar <ol><li> Ip tedavisi devam eden güçlü bir pro-anjiyo-yanıt yol açabilir test doku mast hücreleri aktive ederek inflamasyon veya muhtemelen indüksiyon yoluyla anjiyogenik tepki etkileyebilir ip rota dışında herhangi bir rota kullanılabilir. Oral yoldan ya da tek bir enjeksiyon sc veya iv yanı sıra, sık sık, iki ya da birkaç hafta kadar sabit bir hızda çözüm sunmak için (bir veya daha fazla, hacimleri ve pompalama kez değişen) osmotik minipumps kullanarak sc uygulama. </li><li> Sürekli subkutan infüzyon test ajanların Osmotik minipumps Dolum ve implantasyon Alzet Osmotik Pompalar, Mountain View, CA; Genellikle 5. Gün, yani ip VEGF tedavisi, ozmotik minipumps (örneğin, Model 2ML2, 14-15 gün süreyle 5.0 ul / h sabit pompalama hızı ile sona erdikten sonra bir gün , ABD) steril koşullar altında test aracı ya da uygun bir araç ile doldurulur. ° C, pompa (lar) 37 steril% 0.9 (w / v) NaCl gecede depolama sonra cerrahi (spinal colu kenarındaki sırtında sc implante.mn) isofluran gaz (Isoba veteriner kullanarak anestezi edilmiş sıçanlarda scapulaların bölgede, hava geçirmez bir şeffaf odasında başlangıçta, Schering-Plough Hayvan Sağlığı, Merck &amp; Co, Inc, Whitehouse Station, NJ, ABD) ve bir maske ile (daha sonra yeniden kullanılmadan önce aşağıdaki hayvana kaynaklanan stresi en aza indirmek için, oda hava ile temizlendi). Implantasyon sonrası hemen ipek iplik kullanarak pompa implantasyonu için yapılan cilt insizyonu sütüre edilir. Deney süresince hayvanların fizyolojik kilo ve test ajanlar sabit bir hızla uygulandığında bu yana, kg vücut ağırlığı başına bir test ilaç için seçilen gerçek doz infüzyon döneminin başında ortalama doz daha yüksek ve daha düşük infüzyon süresi sonunda ortalama doz daha. Sürekli infüzyon, burada açıklandığı gibi, uzun bir metronom tedavi biçimi olarak görülebilir. </li></ol> 4. Deney sona erdirme <ol><li> Bir kerede bir hayvan, hayvan hızla öldürür CO 2 gaz ile temizlendi şeffaf bir hava geçirmez odası, yerleştirilir . Odasına tekrar kullanılabilir edilmeden önce hava ile temizlendi. </li></ol> 5. Hasat Doku Örnekleri <ol><li> DVD &#39;de gösterildiği gibi, karın duvarı açılır ve bağırsak çekal valfi (ince bağırsak ve kalın bağırsağın birleştiği) ulaştığı en distal bölümü de dahil olmak üzere, küçük bağırsak mezenter tanımlanır. En distalde yer alan &quot;windows&quot; dört (veya daha fazla) sayılı ve objektif standart tedavi edilmezse SuperFrost Plus-slayt (DAKO Danimarka A / S, Glostrup, Danimarka) üzerine yayılır. Non-spesifik olarak bu malzemelerin lekeli olabilir mikrodamarlar sonraki immünohistokimyasal görselleştirme geçersiz olmamakla birlikte, mümkünse kan, bağırsak içeriği veya diğer vücut sıvıları ile numunelerin kirlenmesine neden olan, önlemek için önemlidir. </li><li> Bağlı küçük bir bağırsak segmenti Her mezenterik pencere örnek bir slayt üzerine yayılmış ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında kurutulur. Ardından, bağırsak güdük, bozulmadan membranöz mezenter örnekleri uzun süre için -20 ° C&#39;de saklanır, kapalı kesilir. Bu DVD gösterilmiştir. </li></ol> Bu doku ve patent damarsal iletilen ışık intravital mikroskobu ile hasat öncesi görülebilmesi belirtilmelidir. 6. Mikrodamarlar İmmünohistokimyasal Boyama Protokolü <ol><li> Gün 0 Numuneler -20 ° C oda sıcaklığında, 1 saat için 60 ° C&#39;de bir kabin kurutulur Çözülme izin ve gece boyunca oda sıcaklığında tutulur. </li><li> 1. Gün Slaytları slayt sahipleri (her saniye bir parça) boyama boyama kavanoza yerleştirin ve oda sıcaklığında 10 dakika TBS (pH 7.8) ile iki kez yıkayın. Çözüm atılır ve sonraki çözümü ile değiştirilir ve bu nedenle aşağıdaki adımları için. </li><li> Tripsin tedavisi Tripsin çözüm (25 ° C&#39;de 20 dakika) ile boyama slayt sahibi olacak Limana boyama kavanoza doldurun. Çözüm atın ve% 2.5 sakkaroz solüsyonu (her seferinde 10 dakika boyunca oda sıcaklığı) ile iki kez kuluçkaya yatmaktadır. Çözüm atın ve su dest kez bir çift (bir kaç dakika her biri için oda sıcaklığında) durulayın. </li><li> Engelleme % 0.5 H 2 O 2 metanol (30 dakika boyunca oda sıcaklığı) ile boyama slayt sahibi olacak Limana boyama kavanoza doldurun. Çözüm atın ve su dest (bir kaç dakika oda sıcaklığında) ile durulayın. Çözüm atın ve TBS (pH 7.4) (her defasında 8 dakika boyunca oda sıcaklığında) ile iki kez yıkayın. </li><li> Kuluçka Tüm inkübasyonlar oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odasında. Aşağıda listelenen çözümleri her biri yaklaşık 150 ul slayt başına kullanılır. Slaytlar nemlendirilmiş bir odasında yerleştirilir ve çözümleri örnekleri (non-membranöz parça çözümler ile kaplı olması gerekmez) üzerine pipetlenir. Sonraki çözüm eklenmeden önce her biri için aşağıdaki adımları dikkatli bir şekilde çözüm silkeleyin. <ol><li> Normal (engelleme) serum (at) (ABC kiti) 3 Kuluçka sarı çözüm / 20 dakika için 10 ml seyreltme tamponu düşer. </li><li> Kuluçka sıçan damar endotel hücreleri etiketler İlköğretim antikor ARU0181. Antikor seyreltme tamponu (Biosource) (100 ul seyreltilmiş 40 kat [dondurulmuş] artı 900 ul seyreltme tamponu) ve inkübasyon 1:600 ​​seyreltilir 4 geceleme gerçekleşir ° C </li></ol></li><li> 2. Gün Slaytlar nemlendirilmiş odasından çıkarılır, birincil antikor atılır ve slaytlar bir boyama slayt tutucu, boyama kavanoza batık ve TBS ile iki kez yıkanır konur8 dakika (pH 7.8). <ol><li> Biotinlenmiş antikor ile inkübasyon (ABC kiti) Slaytlar nemlendirilmiş bir odasında yatay olarak yerleştirilmiş ve 1 damla mavi çözüm / 30 dakika için 10 ml seyreltme tamponu ile inkübe edilir . Çözüm atın ve boyama kavanoz içinde batık bir boyama slayt sahibi slaytlar ve 8 dakika TBS (pH 7.4) ile iki kez yıkayın. </li><li> ABC reaktifi ile inkübasyonu Slaytlar nemlendirilmiş bir odasında tekrar yatay olarak yerleştirilmiş ve aşağıdaki çözümleri örneklerinin membran parçalarının üzerine pipetlenir: 2 damla artı 30 dakika kahverengi çözüm / 10 ml TBS (pH 7.4) 2 damla portakal çözüm. 30 dakika kullanmadan önce dikkatlice karıştırın! Çözüm atın ve boyama kavanoz slaytlar slayt tutucu ve 8 dakika TBS (pH 7.4) ile iki kez yıkayın. </li></ol></li><li> DAB (% 0.05) ile boyanarak Bu adım havalandırılan bir kimyasal kaput yapılmalıdır! Slaytları yerleştirin ve 3,3 diaminobenzidin (DAB, Sigma-Aldrich) ekleyebilirsiniz pipet kullanarak çözüm: TBS içinde% 0.1 DAB solüsyonu (pH 7.4) [dondurulmuş] 10 ul H 2 O karışımı ile 1:1 seyreltilir 2 ve 7.5 ml TBS (pH 7.4). Bu çözüm, (herhangi bir parçacık mikroskobik resmi gizleyebilir ortadan kaldırmak için) hemen önce steril filtre edilir. 8 dakika örneklerdir Leke. Çözüm atın ve boyama kavanoza batık boyama slayt sahibinin slaytlar. Birkaç dakika sonra su dest çalışan ve musluk suyu altında durulayın. </li><li> Kurutma Slaytları boyama slayt sahibi tutulur. Atarak yıkayın ve dolum su dest / etanol içeren boyama kavanoz: 2 dakika her çözüm, su dest,% 70 alkol,% 95 alkol, mutlak alkol. </li></ol> 7. Vasküler Endotelyal Hücre İmmünohistokimyasal Boyama sonra Görüntüleme ve Her Mezenterik Pencere Numune Mikrovasküler Ağ Değerlendirilmesi Filmde gösterildiği gibi, mikrodamarlar sağlam doku in situ mikroskobik görselleştirildiği . <ol><li> Öncelikle, biz beyaz kağıt kalem büyütme aralığı 14 ila 34 (Leica Vahşi M 3Z) ile tüm pencere alanı, mezenterik pencere başına tüm vaskülarize alanı (VA) yanı sıra bir çizim mikroskobu kullanın. VA, tüm bölgenin bir yüzdesi olarak, kolay bilgisayarlı veya non-bilgisayarlı planimetri (ya da sadece tüm pencere resim ve görüntüleri tüm vaskülarize parça kesme ve ağırlık) ile ölçülür. </li><li> Kullanarak kolayca tespit başka bir çizim mikroskobu, bireysel mikrodamar profilleri, rastgele seçilen alanlar içinde 80 büyütme beyaz kağıt üzerine siyah mürekkeple çizilir. Bu temelde mikrovasküler yoğunluk ölçümü mikrovasküler uzunluğu sonraki bilgisayarlı morfometrik değerlendirmesi (MVL), başlangıç ​​noktasıdır. </li><li> İsteğe bağlı olarak, mikrovasküler desen oluşumu ile ilgili değişkenlerin yanı sıra, bireysel mikrovasküler lahanası (No SP ve Le SP, sırasıyla) mikrovasküler lahanası ve uzunluk sayısı değerlendirme için bu tespit edilebilir . Tasvir siyah damar yapıları ve beyaz arka plan, en ticari morfometrik bilgisayar programları, görüntülerin detaylı analizi kolaylaştırır arasında optimum kontrast. </li><li> Çoğu durumda, en önemli değişkenler birlikte çarpılır, toplam mikrovasküler uzunluğu (TMVL) oluşturmak VA ve MVL . </li></ol> 8. İstatistiksel Analiz Biz genellikle eşleştirilmemiş (iki uçlu) gözlemleri analiz etmek için standart non-parametrik Mann-Whitney U testi kullanın. Ortalama hayvan başına dört mezenterik pencereleri mezenterik penceresinin her değişken için bağımsız olarak veri noktası kullanılır. Kriter istatistiksel anlamlılık için p ≤ 0.05.

<ol>
	<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+models+of+angiogenesis.">In vivo models of angiogenesis.</a> J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+testing+with+angiogenesis+models.">Drug testing with angiogenesis models.</a> Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).</li><li>Norrby, K., Jakobsson, A., Sorbo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast-cell-mediated+angiogenesis:+a+novel+experimental+model+using+the+rat+mesentery.">Mast-cell-mediated angiogenesis: a novel experimental model using the rat mesentery.</a> Virchows Arch. B Cell. Pathol. Incl. Mol. Pathol. 52, 195-206 (1986).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+and+angiogenesis.">Mast cells and angiogenesis.</a> APMIS. 110, 355-371 (2002).</li><li>Albertsson, P., Lennernas, B., Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+meteronomic+chemotherapy:+modulation+of+angiogenesis+mediated+by+VEGF-A.">On meteronomic chemotherapy: modulation of angiogenesis mediated by VEGF-A.</a> Acta Oncol. 45, 144-155 (2006).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+apo-lactoferrin+enhances+angiogenesis+mediated+by+vascular+endothelial+growth+factor+A+in+vivo.">Human apo-lactoferrin enhances angiogenesis mediated by vascular endothelial growth factor A in vivo.</a> J. Vasc. Res. 41, 293-304 (2004).</li><li>Norrby, K., Mattsby-Baltzer, I., Innocenti, M., &amp;amp, T. u. n. e. b. e. r. g., S, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orally+administered+bovine+lactoferrin+systemically+inhibits+VEGF(165)-mediated+angiogenesis+in+the+rat.">Orally administered bovine lactoferrin systemically inhibits VEGF(165)-mediated angiogenesis in the rat.</a> Int. J. Cancer. 91, 236-240 (2001).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-molecular-weight+heparins+and+angiogenesis.">Low-molecular-weight heparins and angiogenesis.</a> APMIS. 114, 79-102 (2006).</li><li>Norrby, K., Nordenhem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dalteparin,+a+low-molecular-weight+heparin,+promotes+angiogenesis+mediated+by+heparin-binding+VEGF-A+in+vivo.">Dalteparin, a low-molecular-weight heparin, promotes angiogenesis mediated by heparin-binding VEGF-A in vivo.</a> APMIS. 118, 949-957 (2010).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+and+de+novo+mammalian+angiogenesis.">Basic fibroblast growth factor and de novo mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res.. 48, 96-113 (1994).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+and+de+novo+mammalian+angiogenesis.">Vascular endothelial growth factor and de novo mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res. 51, 153-163 (1996).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+density+in+terms+of+number+and+length+of+microvessel+segments+per+unit+tissue+volume+in+mammalian+angiogenesis.">Microvascular density in terms of number and length of microvessel segments per unit tissue volume in mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res. 55, 43-53 (1998).</li></ol>

Tahlil 1986 3 yılında ortaya çıkmıştır ve gittikçe daha da geliştirildi ve laboratuvarımızda 7,10-12 rafine olmuştur. Derlemeler (davet edildi) 1, 2 tartışıldığı, tahlil, özellikle yetişkin testi doku gibi önemli özellikleri bakımından diğer memeli in vivo anjiyogenez tayininde iyi karşılaştırır, doğal vaskülarize ve fizyolojik anjiyogenez yoksun; minimal travma, eğer varsa, verdirdiler doku üzerine gerçekten kantitatif değişkenler ölçülür, doz-yanıt ve moleküler-aktivite çalışmaları ile ilgili ses istatistiksel analiz sağlar; çimlenme anjiyogenez, normal dokularda ve tümörlerde hakim olduğu ortaya çıkar ve toksisite verileri kolayca sağlam büyümek sıçanlarda biriken fizyolojik yetişkinlik. Fareler için pek uygun olduğunu; real-time/serial gözlemler izin vermez; Dezavantajlı özellikleri, özellikle bireysel mikrodamar segment ve mikrovasküler lahanası sayısı ve uzunluğu değerlendirilmesi, tahlil, nispeten zaman alıcı olduğunu gerçeği içerebilir farelerde çok sayıda mezenterik pencereler potansiyel ebeveyn mikrodamarlar eksikliği bu yana yeni kılcal damarların kaynaklı olabilir. Ancak, gerçek zamanlı gözlemler, hayvan, 1 tartışılan anestezi ise exteriorized ama sağlam mezenterik pencereler mikroskop aşamasında üzerinden dışarı yayvan intravital mikroskobu ile etkindir. Anjiyogenez araştırma faydalı ama sonuçta sınırlı araçlar kornea micropocket, civciv chorioallantoic membran ve sc Matrigel fiş testleri gibi modelleri kullanarak, geçmiş yıllarda önemli gelişmeler elde edilmiştir. Antianjiyojenik ve pro-anjiyogenik tedavilerin gelecekte klinik uygulamalarda raporda açıklanan biri olarak daha duyarlı ve biyolojik ilgili, gerçekten kantitatif klinik öncesi modelleri, kurulması ve doğrulanması zorunlu kılmaktadır.

Tamponlar ve reaktifler 0.5 M Tris-HCl (pH 7.8) stok solüsyonu Tris (hidroksimetil) aminomethan (60,57 gr) ~ 900 ml su dest çözülür ve ~ 45 ml% 25 HCl (konsantre), pH 7.8 ile 1 litre su dest seyreltme takip ulaşmak için eklenir . Tris-buffer salin (TBS; pH 7.8) 18 g NaCl ~ 1800 ml su dest çözünmüş 2 litre su dest seyreltme tarafından takip stok solüsyonu, 7.8 pH ayarlaması için 200 ml stok solüsyonu eklenir. TBS (pH, 7.4 &#39;) Stok çözelti için 200 ml, 2 litre su dest seyreltme tarafından takip stok solüsyonu, pH 7.4 &#39;e ayarlanması ile ~ 1800 ml su dest çözünmüş çözünmüş 18 gr NaCl eklenir . Tripsin solüsyonu (% 0.05 tripsin,% 0.1 CaCl 2) 200 ml TBS (pH 7.8) 0.1 g tripsin ve 0.2 g CaCl 2 içerir. Sakaroz çözeltisini% 2.5 200 ml TBS (pH 7.8) 5 g sakaroz içerir. TBS içinde% 1 Sodyum azid (pH 7.4) stok solüsyonu TBS (pH 7.4) ile 100 ml 1 g Na-azid içerir. Sulandırma tampon% 0,1 BSA,% 0.01 Na-azid: (Antikorlar Vectastain ABC kiti sulandırmak için kullanılır). TBS (pH 7.4) ile 100 ml seyreltilmiş, 0.1 g sığır serum albumini (BSA) ve 1 ml% 1 Na-azid içerir. ABC kiti Vectastain PK 4002, ABC peroksidaz fare IgG Normal at serumu; engelleme serum; sarı çözüm: 3 drops/10 ml seyreltme tamponu. Biotinlenmiş antikor, anti-fare IgG, mavi çözüm: 1 drop/10 ml seyreltme tamponu. ABC-reaktif: 2 damla portakal çözüm artı kahverengi çözüm 2 drops/10 ml TBS (pH, 7.4 &#39;). 20 dakika önce bu çözümler karıştırın! Fare (monoklonal) anti-sıçan endotel (Biosource International, Camarillo, CA, USA) <table border="1"><tbody><tr><td> Katalog # </td><td> ARU0181 </td></tr><tr><td> Klon # </td><td> MRC OX-43 </td></tr></tbody></table> Bu antikor, beyindeki bu istisna ile sıçan tüm vasküler endotelyal hücreler karşı yönlendirilmiştir. Vectastain peroksidaz Avidin Biotin Kompleksi (ABC) kiti Kiti primer antikor, biotinlenmiş sekonder antikoru, avidin-biotinlenmiş enzim kompleksi (ABC), ve enzim substrat içerir. <a href="http://www.vectorlabs.com/">Www.vectorlabs.com</a> veya <a href="http://www.immunkemi.se/">www.immunkemi.se</a> protokoller için. Sığır serum albumini (BSA) (Sigma-Aldrich, katalog # A-4503). DAB = 3,3 &#39;-diaminobenzidin Isopac (Sigma-Aldrich, katalog # D 9015). Sığır Pankreas (Sigma-Aldrich, katalog # T 4665) tripsin. Vectastain peroksidaz ABC-kit, Fare IgG (F &amp; D Immunkemi AB, Jarfalla, İsveç)

rat mesentery angiogenesis assay

Yetişkin sıçan mezenter pencere anjiyogenez tahlil biyolojik uygun ve son derece iyi, in vivo anjiyogenez çimlenme çalışma için uygundur, insan tümörleri ve tümör olmayan dokular anjiyogenez hakim formu davet incelemesi tartışılan [Derlemeler bakın. ] kağıtlar 1,2. Membranöz mezenterik parça bir pro-anjiyo faktör intraperitoneal (ip) enjeksiyonu ile indüklenen Anjiyogenez subkutan (sc), intravenöz (iv) veya oral (po) tercih modifiye edici ajanlar ile tedavi modüle olabilir. Mezenter Her membranöz kısmında bir pencere gibi bir görünüm veren, saydam ve yağ dokusu tarafından çerçeveli. Tahlil aşağıdaki avantajlı özelliklere sahiptir: (i) test doku seyrek olsa da, doğal olarak vaskülarize, ve son derece ince bir yana, mikrovasküler ağ, tüm ağ in situ mikroskobik olarak değerlendirilmesi gereken izin veren, neredeyse iki boyutlu ( ii) yetişkin sıçanlarda test dokusunun en normal erişkin memeli dokularında görülen önemli fizyolojik anjiyogenez yoksun; yerli vaskülarizasyon derecesine, ancak, 1 de açıklandığı gibi yaş ile ilişkilidir; travma bağlı anjiyogenez (iii) ihmal edilebilir düzeyde (v) yüksek hassasiyet sağlar; anjiyogenez modülasyon test ilaçlar sistemik olarak uygulanan ve yanıtları metabolik,, hücresel ve moleküler değişiklikler tedavi ile indüklenen net etkisi yansıtacak gözlenir (iv) testinin, klinik durum çoğaltır;. böylece doz-etki ve moleküler yapı-aktivite ilişkileri sağlam istatistiksel analizler sağlayarak, testin yanı sıra çimlenme kapiller mikrovasküler mekansal uzantısı, yoğunluk ve ağ model oluşumu objektif, kantitatif, tarafsız değişkenleri değerlendirmelerini sağlar; ve (vi yetişkin sıçanlarda sağlam büyüdükçe) tahlil, fizyolojik vücut ağırlık artışı azalma oranı bakımından yüksek hassasiyet ile tedavilerin toksik veya zararlı etkileri ortaya koymaktadır. Bu testte 3,4 kullanarak mast hücre-aracılı anjiyogenez ilk gösterilmiştir. Modeli, doz-etki ilişkileri ve dahil olmak üzere sistemik kimyasal veya fonksiyonel olarak uygulanan yakından ilgili ilaçlar ve proteinler, ölçülen etkileri ile ilgili yüksek düzeyde bir ayrımcılık göstermektedir: (i) metronomically, farklı, ilaç özel efektler verimi standart kemoterapötikler uygulanan düşük doz, (yani, anjiyogenez baskılayıcı, nötr veya anjiyogenez-uyarıcı etkinlikler 5), (ii) inhibe VEGF-A-aracılı anjiyogenez 6 uyarır doğal demir-doymamış insan laktoferrin, ve doğal demir-doymamış sığır laktoferrin, VEGF-A- aracılı anjiyogenez 7, ve (iii), çeşitli yollarla 8,9 tarafından üretilen düşük molekül ağırlıklı heparin kesirler . Ayrıca, testin son derece eşzamanlı veya ardışık moda sistemik ajanlar anjiyogenez üzerinde kombine etkileri çalışmaları için uygundur. Bu video yapma fikri o bizim laboratuvar ziyaret etti ve gösterilen metodoloji tanık merhum Dr. Yahuda Folkman kökenli. İnceleme kağıtları (davet edildi) tahlil tartışılması ve değerlendirilmesi Anjiyogenez in vivo modellerde Norrby, K.. J. Hücre. Mol. Med. 10, 588-612 (2006). Norrby, anjiyogenez modelleri ile K. Uyuşturucu testi. Uzman Opin. İlaç. Discov. 3, 533-549 (2008).

Watch this Scientific Journal Video about Rat Mesentery Angiogenesis Assay at JoVE.com

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

Fizyolojik anjiyogenez ve yoksun Normal erişkin vaskülarize memeli doku çalışma için kullanılan cerrahi müdahaleye maruz kalmamış: (i) başlatılması ve test ajanların intraperitoneal uygulanması aşağıdaki anjiyogenez geliştirilmesi; ve sistemik uygulanması aşağıdaki (ii) anjiyogenez değişiklik Test ajanlar seçilir.

Rat mezenter Anjiyogenez Testi

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

Research

JoVE Journal

Biology

13.8K Görüntüleme.  University of Gothenburg. Fizyolojik anjiyogenez ve yoksun Normal erişkin vaskülarize memeli doku çalışma için kullanılan cerrahi müdahaleye maruz kalmamış: (i) başlatılması ve test ajanların intraperitoneal uygulanması aşağıdaki anjiyogenez geliştirilmesi; ve sistemik uygulanması aşağıdaki (ii) anjiyogenez değişiklik Test ajanlar seçilir.

Video: Rat Mesentery Angiogenesis Assay

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro. He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes: Bir Anjiyogenez Çalışma in vitro model (Röportaj)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

Biyoloji

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, branching, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane.  Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels within the assays often do not resemble vessels in vivo.  Based on earlier work by Nehls and Drenckhahn, we have optimized an in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts.  This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis and, importantly, the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. EC are coated onto cytodex microcarriers and embedded into a fibrin gel.  Fibroblasts are layered on top of the gel where they provide necessary soluble factors that promote EC sprouting from the surface of the beads.  After several days, numerous vessels are present that can easily be observed under phase-contrast and time-lapse microscopy. This video demonstrates the key steps in setting up these cultures.

This video demonstrates the protocol of an in vitro angiogenesis assay that recapitulates several stages of angiogenesis. Time-lapse images of sprouting, lumen formation, branching and anastomosis - key features of angiogenesis - are shown.

Anjiyogenez Çalışmaları için optimize edilmiş Fibrin Jel Boncuk Testi

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

E18 Rat Brain Organotipik Dilim Kültür

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Langendorff perfüze sıçan Kalpler Optik Haritalama

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

Yetişkin Sıçan Kalp miyositler İlköğretim Kültür

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

Sıçan mezenter eksteriorizasyon: Anjiogenez ilgilendim Hücresel Dinamikler araştırılması için Bir Model

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

Endotel Hücre için Tüp Deneyi birleşimi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Anjiyogenezin Çalışması

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Şekilde, mikro Tekniği Sıçan mezenter mikrodamar geçirgenliği Yönetmelik Araştırma

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

Sıçan Karaciğer DNA Strand Breaks ve Oksidatif DNA Hasar Ölçüm Vivo Alkali Comet Assay ve Enzim-modifiye Alkali Comet Tahlili

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive expression of families of related receptors, a broad range of related ligands and the difficulty of dealing with primary cultures of specialized endothelial cells. Here we describe a bioassay for the detection of ligands to the vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), a key transducer of signals that promote angiogenesis and lymphangiogenesis. A cDNA encoding a fusion of the extracellular (ligand-binding) region of VEGFR-2 with the transmembrane and cytoplasmic regions of the erythropoietin receptor (EpoR) is expressed in the factor-dependent cell line Ba/F3. This cell line grows in the presence of interleukin-3 (IL-3) and withdrawal of this factor results in death of the cells within 24 hr. Expression of the VEGFR-2/EpoR receptor fusion provides an alternative mechanism to promote survival and potentially proliferation of stably transfected Ba/F3 cells in the presence of a ligand capable of binding and cross-linking the extracellular portion of the fusion protein (i.e., one that can cross-link the VEGFR-2 extracellular region). The assay can be performed in two ways: a semi-quantitative approach in which small volumes of ligand and cells permit a rapid result in 24 hr, and a quantitative approach involving surrogate markers of a viable cell number. The assay is relatively easy to perform, is highly responsive to known VEGFR-2 ligands and can accommodate extracellular inhibitors of VEGFR-2 signaling such as monoclonal antibodies to the receptor or ligands, and soluble ligand traps.

We describe a simple cell-based bioassay for detecting, quantifying and monitoring the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligands. The assay uses chimeric receptors expressed in a factor-dependent cell line to provide a semi-quantitative or quantitative assessment of receptor binding and cross-linking by the ligand.