Name: a whole mount in situ hybridization method for the gastropod mollusc lymnaea stagnalis
Uploaded: 2016-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis at JoVE.com

Bu çalışma DFG projesi # JA2108 / 2-1 ile DJJ için fon tarafından desteklenmiştir.

NOT: Aşağıdaki adımlar L. embriyonik ve larva aşamaları situ deneyde bir iletken için bir yöntem özetlemektedir Bir adım, bu kelime &#39;DİKKAT&#39; ve tüm uygun güvenlik prosedürleri ile gösterilir tehlikeli kimyasal kullanımını içerir stagnalis. benimsenmelidir. Tehlikeli kimyasallar için temsili MSDS yaprak Linkler Ek Dosya 1&#39;de verilmiştir. Tüm reaktifler için Tarifler Ek Dosya 2&#39;de verilmektedir. Kapsülden çıkarma Aparatı 1. Meclis <ol><li> Bunu yapmak için, Şekil 2A&#39;da gösterildiği gibi, bir uygun uzunlukta bir P1,000 ucu kesilmiş kullanılarak (1 mm&#39;lik bir iç çap ve 3 mm arasında bir dış çapa sahip) silikon boru, bir 20 ml&#39;lik atılabilir bir şırınga bağlayın. </li><li> ters bir büyük Petri kabı standart bir mikroskop lamı bantlayın. Şekilde gösterildiği gibi bir mikroskop lamı hemen bitişik silikon boru bantlayın60, 2C ve 2D. </li><li> Mikroskop lamı üzerine çekilmiş bir cam iğne istirahat ve hafifçe iğnenin ucu boru iç çapı boyunca bir şekilde yaklaşık% 20 çıkana kadar silikon tüp içine yerleştirin (Şekil 2C ve 2D bakınız). İğne Petri kabı pozisyon bant aşağı getirildikten sonra. </li><li> silikon boru serbest ucu Decapsulated malzeme toplayacak bir Petri kabındaki dinlenmeye bırakın. </li></ol> 2. Örnek Toplama, Fiksasyon ve kapsülden çıkarma NOT: Aksi belirtilmedikçe tüm adımları, oda sıcaklığında gerçekleştirilmektedir. <ol><li> Dikkatle bir akvaryum duvarlarında yumurta dizeleri toplamak. Bunu yapmak için, substrat kapalı yumurta dize kazımak için bir spatula olarak esnek plastik düz bir parça kullanımı ve suyun dışında yüzen yumurta dize balık plastik çay süzgeci kullanın. Sahne ve Şekil sağlanan kılavuzunu kullanarak bir mikroskop altında malzeme sıralamak1. </li><li> Bir kağıt havlu üzerine yumurta dize yerleştirin ve tüy forseps kullanarak yumurta kütlesi boyunca uzunlamasına bir kesi yapmak. Yumurta dize dışında yumurta kapsüllerini rulo ve tüy forseps kullanarak kağıt havlu etrafında onları iterek, her kapsül mümkün olduğunca jöle malzeme kadar kaldırın. </li><li> tüy forseps kullanarak, musluk suyu 5 ml içeren bir Petri kabı içine yumurta kapsülleri aktarın. Bu yemeğin içine istenen gelişim evreleri de-jöleli yumurta kapsülleri toplamaya devam. Planlanan WMISH Deney daha sonra bir sonraki adıma geçin için tüm gelişim aşamalarında yeterince kapsüller toplayın. </li><li> daha gelişmiş larva çalışırken tespitin önce onları uyuşturan (5 gün ilk bölünme (dpfc) ve eski sonrası). NOT: Bu çok zor in situ boyanma yorumunu yapan taahhüt kasları önleyecektir. <ol><li> kendi capsu ise hala (larva Sakinönceden tespit için 30 dakika • 6H 2 O MgCl2% 2 w / v solüsyonda Les). </li><li> fiksatif çözüm kendi yumurta kapsüller içinde hala birkaç larva süre daldırarak ve mikroskop altında tepki izleyerek 30 dakika sonra gevşeme derecesini değerlendirmek. tamamen rahat larvaları yanıt vermez ise eksik rahat larvaları, kendi kabukları içine çekilecektir. Bu larvalar rahat edildikten sonra bir sonraki adıma geçin. </li></ol></li><li> Yumurta kapsül hacminin 10 katı sağlayan bir kapatılabilir bir tüp içine geniş delikli pipet ile yumurta kapsüller aktarın (örn., Yerleşmiş kapsüller 1 ml 10 + ml tüp gerektirir). </li><li> Aspire kadar borunun mümkün sıvı ve yerleşmiş yumurta kapsül hacmi 10 kat olan sabitleyici çözeltisinin bir hacmi ile değiştirin. Yavaşça her gelişim aşamasında (Şekil 1 e bakınız) için uygun bir süre için oda sıcaklığında sabitleyici yumurta kapsüller döndürün. </li><li> Discontinue rotasyon ve kapsüller lavabo ve uygun bir atık kabına fiksatif solüsyonu aspire izin verin. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında% 0.1 Tween-20 (PBTw) Fosfat Tamponlu Tuz çözeltisi sabitleyici değiştirilmesi ve döndürerek yumurta kapsüller yıkayın. PBTw aspire ve iki kez tekrarlayın. </li><li> Embriyoların ve aparatları kullanarak kapsüllerden larvaları çıkarın tüp aracılığıyla ve cam iğne dışarı içine geçmiş kapsül tüp takmak ve daha sonra gidermek. Şekil 2&#39;de gösterilmiştir (ayrıntılar için bakınız bölüm 1) 20 ml şırınga içine kapsül çizin toplama çanak. NOT: Normalde, her kapsül çoğunluğu (&gt;% 90) cihaz üzerinden tek bir geçiş gerekir gerekir. Birçok durumda kapsül zarı hasar, ancak embriyo ve larva rüptüre kapsülün içinde kalır. sadece şırınga içine hazırlanması ve tekrar dispelling bu malzemeyi yeniden işleyin. </li><li> bir mikrofon kullanarak bir 1.5 ml tüp içine decapsulated embriyolar ve larvaları toplayınropipette (0 için P20 - 3 gün eski larva, ve bahşiş sonunda yaşlı larva P200 kesti). NOT: Bu aşamada yapılabilir protokolde (birkaç ay kadar için) bir duraklama. Eğer bu gerekli ise, decapsuled malzemenin depolanması için 1.5 ml&#39;lik bir tüp (bir sonraki adıma) içine alınmalıdır. Aksi takdirde Protokolün 3 hemen devam ediyor. </li><li> Embriyolar ve larvalar tüpün dibine çöker ve süpernatant aspire izin verin. PBTw% 33 Etanol (EtOH) ile değiştirin ve 5 bekletin - 10 dk. PBTw% 66 EtOH ve% 100 EtOH ile tekrar edin. Oda sıcaklığında% 100 EtOH içinde iki kez larvaları yıkayın. % 100 EtOH içinde -20 ° C&#39;de malzemenin saklayın. </li><li> 10 dakika - hazır devam zaman, yeniden hidrat% 100 EtOH kaldırılması ve PBTw% 66 EtOH ile değiştirerek numuneler, 5 bekletin. 10 dakika - 5 bekletin, PBTw% 33 EtOH ile tekrarlayın. Son olarak, tüm EtOH kaldırılır sağlamak için PBTw 3x 5 dk yıkama ile yıkayın. </li></ol> 3. Proteinaz-K, TEA ve Post-fifiksasyon NOT: Biz hızlı bir şekilde zaman kritik çözümler alışverişi için bir örgü zemin ile en verimli ve nazik bir yöntem küçük sepetlerde aşağıdaki adımları uygulayarak bulabilirsiniz. Bu ev yapılabilir, biz INTAVIS InSituPro -Vsi sıvı taşıma robotu (www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc) ile uyumlu sepetleri (orta boy) kullanın. Bu sepet, hızlı ve kolay değişimi çözeltiler için bir 12 yuvalı doku kültürü çanağı (TCD) oyuklarına arasında hareket edebilir, veya çözelti de bir pipet kullanılarak aspire edilebilir. Alternatif olarak, tüm çözüm borsaları sadece larva süpernatant aspire bu sepet olmadan yapılabilir. Bu durumda, hafif bir girdap hareketi yüzer de kenarından kaldırılacak sağlayan çanağın merkezine tüm embriyolar ve larvaları yoğunlaşacaktır. Aşağıdaki kullanıcı çözüm alışverişi için sepetleri istihdam olduğunu varsayar. <ol><li> bir pipet kullanılarak, PBTw 2 ml ile 12 kuyu TCD oturan bir sepet içine embriyo transferi ve larva. NOT:. Eklenen gelişim aşamasına bağlıdır olabilir embriyoları ve / veya larva sayısı ancak başparmak genel bir kural embriyolar / larvaların (yani serbest taban alanı en az 25% muhafaza etmektir, araştırılmaktadır, yok ) sepeti fazla kalabalık. </li><li> Uygun proteinaz-K çözeltisi (Şekil 1 e bakınız), 2 ml, 2 mi% 0.2 glisin her biri başka bir 2 kuyucuklu de bitişik hazırlayın. Proteinaz-K iyi içeren uygun konsantrasyonda her bir sepet taşımak ve hemen zamanlama başlar. </li><li> 10 dakika sonra iyi olarak ihtiva eden% 0.2 Glisin her bir sepet taşımak ve 5 dakika için inkübe edilir. Daha sonra% 0.2 glisin ile ikinci oyuk her bir sepet taşımak ve 5 dakika için inkübe edilir. 3 ml PBTw 3x 5 dk alışverişi ile Glisin yıkayın. </li><li> PBTw çözüm çıkarın ve taze hazırlanmış Triethanolamine (TEA) sol ile bir kez numune tedavi5 dk DİKKAT Katkı! tahrik etmeyin. 5 dakika için taze hazırlanmış çay çözeltisine 3 ml değiştirin. karıştırılmaz. numune çay çözeltisine çoğunluğu aspire. Asetik Anhidrit (TEAAA) çözümü ile taze hazırlanmış trietanolamin ekleyin ve 5 dakika. DİKKAT boyunca inkübe! Tahrik etmeyin. </li><li> İSTEĞE BAĞLI - Yukarıdaki adım kuluçka iken, TEAAA çözümün başka taze bir parti hazırlamak ve yukarıdaki adımı tekrarlayın. Not: TEAAA bu ikinci tedavi isteğe bağlıdır ancak tamamen arka üretilmesi eğilimli problar tüm arka plan ortadan kaldırmak için yararlı olabilir. </li><li> kuyudan o aspire TEAAA çözeltisi çıkarın ve PBTw 3 ml ile değiştirin. karıştırılmaz. PBTw çıkarın ve PBTw içinde% 3.7 formaldehit 3 ml uygulanır. Yavaşça 30 dakika inkübasyon sırasında zaman zaman girdap. </li><li> kuyudan o aspire Fiksatif çıkarın ve PBTw 3 ml ile değiştirin. 1.5 ml tüp içine malzemeyi aktarın. Rhibridizasyon tampon maddesi ile PBTw eplace ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe - dikkatli olun. </li><li> Oda sıcaklığında sıcak bir blok içine tüpler yerleştirin ve istenen hibridizasyon sıcaklığı sıcaklığını ayarlamak. NOT: melezleme sıcaklığı belirli prob ve ampirik optimize edilmesi gerekecektir, ancak biz 55 ° C iyi bir sıcaklık başlangıçta deneme için buluyorum. Blok melezleme sıcaklığına gelmesi ve numuneler yaklaşık 15 dakika boyunca önceden melezleşme izin izin (yani, daha uzun, riboprobes hazırlamak için gereken süre gerekli değildir). Yeterli hacimleri seyreltilmiş riboprobes (normalde 100 ul) hazırlayın. Biz ilk aralık olarak 100 ve 500 ng / ml arasında, genellikle test prob konsantrasyonu. Biz 12&#39;ye göre riboprobes hazırlar. </li><li> örneklerden hibritleme tamponu çıkarın ve örnekleri hibridizasyon tamponu içinde probu ekleyin. 100 ul (ya da yeterli miktarda Overlay melezleştirme Buffe üzerinde bir faz oluşturmak içinr) Mineral yağ elde edilmiştir. NOT: Mineral yağ uzun hibridizasyon adımı sırasında oluşturacak kapsamlı yoğunlaşmayı önler. Kapsamlı yoğunlaşma önemli ölçüde hibridizasyon çözüm kimyasını ve prob konsantrasyonu hem de değiştirecektir. </li><li> prob ve 10 dakika boyunca 75 ° C&#39;ye kadar numunelerin ısıtılmasıyla hedef RNA&#39;yı denatüre, daha sonra arzu edilen melezleştirme sıcaklığına ısısını düşürür. (- 48 saat 24) melezleştirme 12 saat (O / N) ya da daha fazla en az devam etmesine izin verir. </li><li> melezleme sırasında, ısı bloğu tek bir tüp kaldırmak yağ fazının bozmadan larvaları askıya başparmak ve işaret parmağı arasında hızla döndürün ve ısı bloğu değiştirin. 12 saat ya da öylesine - bu kez her 6 tekrarlayın. </li></ol> 4. Sıcak Yıkayıcı ve İmmuno Not: aşağıdaki adımlar için bir sıvı kotarma robotu kullanımı da, bu da kolayca manuel olarak yapılabilir. Bu durumda, embriyolar ve larvalar ShoULD. onlar hibritlenmiştir 1.5 ml tüpler içinde tutulması Bütün takip eden çözelti, Değişimleri aspire edildi ve bir P1,000 pipet ile eklenir. elle yapıldığında aşağıdaki adımlardan her biri, her çözeltinin 1 ml istihdam etmelidir. <ol><li> Isı ile yeterli miktarda 4x, 2x (3 mi, her numune için her biri) ve hibridizasyon sıcaklığı 1x yıkama çözeltileri. </li><li> melezleştirme sıcaklığında 15 dakika her biri için tüm örnekler 4x yıkama tamponunda üç kez yıkayın. melezleştirme sıcaklığında 15 dakika her biri için tüm örnekler 2x yıkama tamponu içinde üç kez yıkayın. melezleştirme sıcaklığında 15 dakika her biri için tüm örnekler 1x yıkama tamponu içinde üç kez yıkayın. </li><li> melezleştirme sıcaklığında 1x Sodyum Klorür sodyum sitrat tamponu +% 0.1 Tween (SSC +% 0.1 Tween) ile bir kez tüm örnekler yıkayın. Numuneler oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. </li><li> W MAB tekrar Maleik asit tampon maddesinde (mAb) ile 1 x SSC çözeltisi yerine 15 dakika boyunca 1 x SSC +% 0.1 Tween iki kez tüm örnekler yıkayın ve 10 dakika bekletinkül. Blok çözeltisi ile MAB takın ve 1.5 saat süre ile inkübe edilir. </li><li> (1: blok çözeltisi içinde antikorun 10,000 seyreltme) antikor çözeltisi blok çözeltisi değiştirin ve yumuşak çalkalama ile oda sıcaklığında 12 saat (O / N) inkübe edilir. </li></ol> 5. Renk Gelişimi ve Montaj <ol><li> Antikor çözeltisi aspire edilir ve 10 dakika için her PBTw 15 kez yıkayın. 1x Alkalen Fosfataz Tampon (AP) ile PBTw değiştirin ve 10 dakika inkübe edilir. </li><li> DİKKAT - Yukarıdaki inkübasyon adım ilerler, AP boyama çözüm hazırlarken (Ek Dosya 2&#39;ye bakınız). iyi bir TCD içine malzemeyi aktarın ve AP boyama solüsyonu ile 1x AP çözüm değiştirin. süre renk reaksiyonu kaydedilebilir için yer alır, böylece artık zaman not edin. Arka plan oranı sinyal optimum kadar boyanma paterni gelişimini izlemek. </li><li> renk gelişimini durdurmak için, uygun idin içinde elden (1x AP boyama çözüm kaldırmake konteyner) ve PBTw 2 ml uygulamak ve şimdi zamanı not edin. 5 dakika her biri için iki kez daha PBTw ile durulayın. 1.5 ml tüp içine malzemeyi aktarmak için, bu durulama birini kullanabilirsiniz. </li><li> (Bu, O / N yapılabilir) PBTw çıkarın ve PBTw% 3.7 formaldehit 1 ml uygulamak ve ajitasyon ya da oda sıcaklığında en az 30 dakika döndürün. </li><li> PBT 3 yıkama (uygun bir atık konteynerine atık fiksatif elden) ile fiksatif yıkayın. deiyonize su içinde, 50 ° C &#39;de numuneler 3 kez yıkayın. NOT: Bu yıkar takas ve görselleştirme adımları sırasında görünür hale gelebilir tuzlarının çökelmesini ortadan kaldırır. </li><li> Benzil Alkol (BB: Ayrıca Murray Clear olarak bilinen BA) veya gliserol örnekleri benzil benzoat monte edilmelidir karar verir. NOT: Daha güçlü temizleme maddesi BB tercih: BA L. olarak stagnalis embriyolar biraz opak. Numuneler BB monte edilmek üzere: BA ilk bir etanol serisi ile susuz gerekecektir. Numuneler,% 60 monte edilecek olangliserol hemen monte edilebilir. </li><li> Bir pipet kullanarak: (BA veya% 60 gliserol BB) montaj çözelti içine örnekleri aktarın. BB monte ederken: NOT BA bu iyi bir bardak yapılmalıdır (BB: BA polikarbonat plastik eriyecek). </li><li> 10 dakika ve daha sonra ayırıcılar olarak yığılmış lamelleri uygun sayıda (örneklerin &lt;1 dpfc, numuneler için 2 lamelleri&gt; 1 dpfc için 1 lamel) kullanarak bir slayt üzerine takar - numuneler için 5 temizlemek için izin verin. NOT: Tüm bağlar artık DIC optik ile bileşik mikroskobu kullanılarak görüntülü olabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+evolutionary+relationships+of+molluscs+with+phylogenomic+tools.">Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools.</a> Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).</li><li>Brusca, R. C., Brusca, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Invertebrates. , (2002).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis:+number+of+people+treated+in+2011.">Schistosomiasis: number of people treated in 2011.</a> Week. Epi. Rec. 88, 81-88 (2013).</li><li>Henry, J. Q., Collin, R., Perry, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slipper+snail,+Crepidula.:+an+emerging+lophotrochozoan+model+system.">The slipper snail, Crepidula.: an emerging lophotrochozoan model system.</a> Biol. Bull. 218 (3), 211-229 (2010).</li><li>Perry, K. J., Henry, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+genome+modification+in+the+mollusc,+Crepidula+fornicata.">CRISPR/Cas9-mediated genome modification in the mollusc, Crepidula fornicata.</a> Genesis. 53 (2), 237-244 (2015).</li><li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+biology+of+memory+storage:+a+dialog+between+genes+and+synapses.">The molecular biology of memory storage: a dialog between genes and synapses.</a> Bio. Rep. 24, 475-522 (2004).</li><li>Jackson, D. J., Ellemor, N., Degnan, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+gene+expression+with+larval+competence,+and+the+effect+of+age+and+parentage+on+metamorphosis+in+the+tropical+abalone+Haliotis+asinina.">Correlating gene expression with larval competence, and the effect of age and parentage on metamorphosis in the tropical abalone Haliotis asinina.</a> Mar. Biol. 147, 681-697 (2005).</li><li>Carter, C. J., Farrar, N., Carlone, R. L., Spencer, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+of+a+molluscan+RXR+and+evidence+for+its+novel,+nongenomic+role+in+growth+cone+guidance.">Developmental expression of a molluscan RXR and evidence for its novel, nongenomic role in growth cone guidance.</a> Dev. Biol. 343 (1-2), 124-137 (2010).</li><li>Rittschof, D., McClellan-Green, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molluscs+as+multidisciplinary+models+in+environment+toxicology.">Molluscs as multidisciplinary models in environment toxicology.</a> Mar. Pollut. Bull. 50 (4), 369-373 (2005).</li><li>Liu, M. M., Davey, J. W., Jackson, D. J., Blaxter, M. L., Davison, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+set+of+maternal+genes?+Insights+from+a+molluscan+transcriptome.">A conserved set of maternal genes? Insights from a molluscan transcriptome.</a> Int. J. Dev. Biol. 58 (6-8), 501-511 (2014).</li><li>Hohagen, J., Herlitze, I., Jackson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+whole+mount+in+situ.+hybridisation+protocol+for+the+mollusc+Lymnaea+stagnalis.">An optimised whole mount in situ. hybridisation protocol for the mollusc Lymnaea stagnalis.</a> BMC Dev. Biol. 15 (1), 19 (2015).</li><li>Raven, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+egg+of+Limnaea+stagnalis.+L.+from+oviposition+till+first+cleavage.">The development of the egg of Limnaea stagnalis. L. from oviposition till first cleavage.</a> Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 91-121 (1946).</li><li>Raven, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+egg+of+Limnaea+Stagnalis.+L.+from+the+first+cleavage+till+the+troghophore+stage,+with+special+reference+to+its'+chemical+embryology.">The development of the egg of Limnaea Stagnalis. L. from the first cleavage till the troghophore stage, with special reference to its' chemical embryology.</a> Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 353-434 (1946).</li><li>Raven, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+in+Limnaea+stagnalis.+and+its+disturbance+by+lithium.">Morphogenesis in Limnaea stagnalis. and its disturbance by lithium.</a> J. Exp. Zool. 121 (1), 1-77 (1952).</li><li>Raven, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nature+and+origin+of+the+cortical+morphogenetic+field+in+Limnaea.">The nature and origin of the cortical morphogenetic field in Limnaea.</a> Dev. Biol. 7, 130-143 (1963).</li><li>Morrill, J. B., Blair, C. A., Larsen, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulative+development+in+the+pulmonate+gastropod,+Lymnaea+palustris.,+as+determined+by+blastomere+deletion+experiments.">Regulative development in the pulmonate gastropod, Lymnaea palustris., as determined by blastomere deletion experiments.</a> J Exp Zool. 183 (1), (1973).</li><li>Van Den Biggelaar, J. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+the+phases+of+the+cell+cycle+during+the+period+of+asynchronous+division+up+to+the+49-cell+stage+in+Lymnaea.">Timing of the phases of the cell cycle during the period of asynchronous division up to the 49-cell stage in Lymnaea.</a> J. Emb. Exp. Morph. 26 (3), 367-391 (1971).</li><li>Verdonk, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+early+development+of+Lymnaea+stagnalis.">Gene expression in early development of Lymnaea stagnalis.</a> Dev. Biol. 35 (1), 29 (1973).</li><li>Gall, J. G., Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+Detection+of+Rna-Dna+Hybrid+Molecules+in+Cytological+Preparations.">Formation and Detection of Rna-Dna Hybrid Molecules in Cytological Preparations.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 63 (2), 378-383 (1969).</li><li>Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+patterns+of+engrailed+and+dpp+in+the+gastropod+Lymnaea+stagnalis.">Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis.</a> Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).</li><li>Shimizu, K., Sarashina, I., Kagi, H., Endo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+functions+of+Dpp+in+gastropod+shell+formation+and+shell+coiling.">Possible functions of Dpp in gastropod shell formation and shell coiling.</a> Dev Genes Evol. 221 (2), 59-68 (2011).</li><li>Koop, D., Richards, G. S., Wanninger, A., Gunter, H. M., Degnan, B. M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+MAPK+signaling+in+patterning+and+establishing+axial+symmetry+in+the+gastropod+Haliotis+asinina.">The role of MAPK signaling in patterning and establishing axial symmetry in the gastropod Haliotis asinina.</a> Dev. Biol. 311 (1), 200-212 (2007).</li><li>Lartillot, N., Lespinet, O., Vervoort, M., Adoutte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+pattern+of+Brachyury+in+the+mollusc+Patella+vulgata+suggests+a+conserved+role+in+the+establishment+of+the+AP+axis+in+Bilateria.">Expression pattern of Brachyury in the mollusc Patella vulgata suggests a conserved role in the establishment of the AP axis in Bilateria.</a> Development. 129 (6), 1411-1421 (2002).</li><li>Jackson, D. J., W&#246;rheide, G., Degnan, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+expression+of+ancient+and+novel+molluscan+shell+genes+during+ecological+transitions.">Dynamic expression of ancient and novel molluscan shell genes during ecological transitions.</a> BMC Evol. Biol. 7 (1), 160 (2007).</li><li>Jackson, D. J., Meyer, N. P., Seaver, E., Pang, K., McDougall, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+of+COE.+across+the+Metazoa+supports+a+conserved+role+in+neuronal+cell-type+specification+and+mesodermal+development.">Developmental expression of COE. across the Metazoa supports a conserved role in neuronal cell-type specification and mesodermal development.</a> Dev Genes Evol. 220, 221-234 (2010).</li><li>Perry, K. J., Lyons, D. C., Truchado-Garcia, M., Fischer, A. H. L., Helfrich, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deployment+of+regulatory+genes+during+gastrulation+and+germ+layer+specification+in+a+model+spiralian+mollusc.">Deployment of regulatory genes during gastrulation and germ layer specification in a model spiralian mollusc.</a> Dev. Dyn. , (2015).</li><li>Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+patterns+of+engrailed+and+dpp+in+the+gastropod+Lymnaea+stagnalis.">Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis.</a> Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).</li><li>Shimizu, K., Iijima, M., Setiamarga, D. H. E., Sarashina, I., Kudoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left-right+asymmetric+expression+of+dpp+in+the+mantle+of+gastropods+correlates+with+asymmetric+shell+coiling.">Left-right asymmetric expression of dpp in the mantle of gastropods correlates with asymmetric shell coiling.</a> EvoDevo. 4 (1), 15 (2013).</li><li>Christodoulou, F., Raible, F., Tomer, R., Simakov, O., Trachana, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ancient+animal+microRNAs+and+the+evolution+of+tissue+identity.">Ancient animal microRNAs and the evolution of tissue identity.</a> Nature. 463, (2010).</li><li>Koga, M., Kudoh, T., Hamada, Y., Watanabe, M., Kageura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+triple+staining+method+for+double+in+situ+hybridization+in+combination+with+cell+lineage+tracing+in+whole-mount+Xenopus+embryos.">A new triple staining method for double in situ hybridization in combination with cell lineage tracing in whole-mount Xenopus embryos.</a> Dev Growth Differ. 49 (8), 635-645 (2007).</li><li>Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+in+the+embryonic+zebrafish+brain+using+differential+detection+systems.">Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems.</a> BMC Dev. Biol. 11 (1), 43 (2011).</li><li>Davison, A., Frend, H. T., Moray, C., Wheatley, H., Searle, L. J., Eichhorn, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+behaviour+in+Lymnaea+stagnalis.+pond+snails+is+a+maternally+inherited,+lateralized+trait.">Mating behaviour in Lymnaea stagnalis. pond snails is a maternally inherited, lateralized trait.</a> Biol. Lett. 5 (1), 20-22 (2009).</li><li>Kuroda, R., Endo, B., Abe, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chiral+blastomere+arrangement+dictates+zygotic+left-right+asymmetry+pathway+in+snails.">Chiral blastomere arrangement dictates zygotic left-right asymmetry pathway in snails.</a> Nature. 462 (7274), 790-794 (2009).</li><li>Shibazaki, Y., Shimizu, M., Kuroda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Body+handedness+is+directed+by+genetically+determined+cytoskeletal+dynamics+in+the+early+embryo.">Body handedness is directed by genetically determined cytoskeletal dynamics in the early embryo.</a> Curr. Biol. 14 (16), 1462-1467 (2004).</li><li>Lu, T. Z., Feng, Z. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sodium+leak+current+regulates+pacemaker+activity+of+adult+central+pattern+generator+neurons+in+Lymnaea+stagnalis.">A sodium leak current regulates pacemaker activity of adult central pattern generator neurons in Lymnaea stagnalis.</a> PLoS One. 6 (4), e18745 (2011).</li><li>Dawson, T. F., Boone, A. N., Senatore, A., Piticaru, J., Thiyagalingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Splicing+of+an+Invertebrate+Beta+Subunit+(LCav-beta)+in+the+N-Terminal+and+HOOK+Domains+and+Its+Regulation+of+LCav1+and+LCav2+Calcium+Channels.">Gene Splicing of an Invertebrate Beta Subunit (LCav-beta) in the N-Terminal and HOOK Domains and Its Regulation of LCav1 and LCav2 Calcium Channels.</a> PLoS ONE. 9 (4), e92941 (2014).</li><li>Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+evolutionary+relationships+of+molluscs+with+phylogenomic+tools.">Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools.</a> Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).</li><li>Gregory, T. R., Nicol, J. A., Tamm, H., Kullman, B., Kullman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+genome+size+databases.">Eukaryotic genome size databases.</a> Nuc. Acids. Res. 35 (Database issue), D332-D338 (2007).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada tarif edilen yöntem, Lymnaea stagnalis tüm gelişim aşamalarında olan muhtemelen farklı sentezleme seviyelerine sahip RNA transkriptlerinin etkin olarak gösterebilir. Onların kapsüller embriyolar ve larvaları çıkarmak için diğer encapsulated- için bildirilen kimyasal, ozmotik şok ve fiziksel tedaviler çeşitli trialed model organizmalar geliştirmek. Ancak, bizim elimizde biz burada açıklamak yöntemi embriyolar ve larvaları zarar vermeden sert kapsül zarı kaldırır sadece ...

Yumuşakçalar bilimsel disiplinlerin geniş bir çeşitlilik ilgi tutmak hayvanların bir grup vardır. Morfolojik çeşitlilik 1 rağmen, tür, 3 ticari tıbbi 4 ve bilimsel konularda 5-8 geniş bir yelpazede ve alaka (tür sayısı 2 bakımından sadece Arthropodlara ikinci) zenginliği, iddia edebilir görece az sayıda yumuşakça türü vardır iyi donanımlı bilimsel model ve laboratuar ortamında bakımı kolay hem olacak. Çok böyle nörobiyoloji 9, ekotoksikoloji 10 ve daha yakın evrimsel biyoloji 11,12 olarak disiplinler tarafından kullanılan bir yumuşakça, öncelikle çünkü yaygın dağıtım ve bakım aşırı kolaylığı, Lymnaea stagnalis olduğunu. Bir &#39;model&#39; organizma olarak popülerlik ve L. mevcut gelişimsel biyologlar 13-19, moleküler araçlar aralığı ve güç kullanımı onun uzun geçmişine rağmen stagnalis bilimsel topluluk çok daha geleneksel hayvan modellerinde (Drosophila, fare, deniz kestanesi, nematodlar) o arkasında yatıyor. Bir moleküler modeli kabuk oluşumunu rehberlik moleküler mekanizmalar bir ilgi kaynaklanıyor gibi bizim arzu Lymnaea geliştirmektir. Bu Lymnaea &#39;ın gelişimi sırasında gen ifadesinin, verimli, tutarlı ve duyarlı görselleştirme için izin verecek teknikleri bir dizi rafine bizi motive etti. In situ hibridizasyon bütün montaj (WMISH) yaygın model organizmaların çeşitli kullanılır ve 40 yılı aşkın 20 kullanımda olmuştur. Farklı guises, ISH mekansal kromozomlar, rRNA, mRNA ve mikro-RNA&#39;lar belirli loci lokalize etmek için kullanılabilir. Zorluklardan biri, önceki L. için WMISH yöntemi rafine hitap için gerekli stagnalis nazikçe ve etkin ayıklanması embriyo ve t değişen aşamaları larvalarının sorun olduO depolandıkları yumurta kapsüller. Bu özütleme, ya da &#39;kapsülden çıkarma&#39;, yeterli malzeme toplamak için etkili bir şekilde elde edilmesi gerekmektedir, aynı zamanda, morfolojik ve hücresel bütünlüğü muhafaza edilirken, in situ deneyde verilen. Diğer model organizmalar da kapsüllü gelişime tabi iken, elimizde bu türler için bildirilen yöntemlerden hiçbiri başarılı L. istihdam edilebilir stagnalis. Bu yöntemin genel amaçları bu nedenle: L. ayıklamak için stagnalis yüksek verimli bir şekilde kendi kapsüller, embriyolar ve larvalar görüntüleme için tatmin edici bir WMISHsignals embriyo ve larvaları hazırlamak için, WMISH sinyali iyileştirir ön hibridizasyon tedaviler uygulamak.

<table><tbody><tr><td>Featherweight forceps</td><td>Ehlert &amp;amp; Partner</td><td>#4181119</td><td></td></tr><tr><td>Silicon tubing</td><td>Glasger&amp;auml;tebau OCHS GmbH</td><td>760070</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillaries</td><td>Hilgenberg</td><td>1403547</td><td></td></tr><tr><td>12 well tissue culture dishes</td><td>Carl Roth</td><td>CE55.1</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehyde</td><td>Carl Roth</td><td>P733.1</td><td>CAUTION - May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed.</td></tr><tr><td>Ethylenediamine tetraacetic acid</td><td>Carl Roth</td><td>CN06.3</td><td>CAUTION - CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Carl Roth</td><td>9127.1</td><td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll type 400</td><td>Carl Roth</td><td>CN90.1</td><td></td></tr><tr><td>polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40)</td><td>Carl Roth</td><td>4607.1</td><td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.</td></tr><tr><td>Nuclease freeBovine Serum Albumin</td><td>Carl Roth</td><td>8895.1</td><td></td></tr><tr><td>Salmon sperm</td><td>Carl Roth</td><td>5434.2</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Carl Roth</td><td>7692.1</td><td>CAUTION - ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH</td></tr><tr><td>Proteinase-K</td><td>Carl Roth</td><td>7528.1</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Carl Roth</td><td>3790.2</td><td></td></tr><tr><td>Deionised formamide</td><td>Carl Roth</td><td>P040.1</td><td>CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.</td></tr><tr><td>Standard formamide</td><td>Carl Roth</td><td>6749.3</td><td>CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.</td></tr><tr><td>Triethanolamine</td><td>Carl Roth</td><td>6300.1</td><td>CAUTION - Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling.</td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Carl Roth</td><td>4483.1</td><td>CAUTION - CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT</td></tr><tr><td>Maleic acid</td><td>Carl Roth</td><td>K304.2</td><td>CAUTION - Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin.</td></tr><tr><td>Benzyl benzoate</td><td>Sigma</td><td>B6630-250ML</td><td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed.</td></tr><tr><td>Benzyl alcohol</td><td>Sigma</td><td>10,800-6</td><td>CAUTION - Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Carl Roth</td><td>3783.1</td><td></td></tr><tr><td>Blocking powder</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Anti DIG Fab fragments AP conjugated</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Carl Roth</td><td>9090.3</td><td></td></tr><tr><td>4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>4421.3</td><td>CAUTION - May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes.</td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate</td><td>Carl Roth</td><td>A155.3</td><td>CAUTION - Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>N-acetyl cysteine</td><td>Carl Roth</td><td>4126.1</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Carl Roth</td><td>6908.1</td><td>CAUTION - May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.</td></tr><tr><td>Tergitol</td><td>Sigma</td><td>NP40S</td><td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulphate</td><td>Carl Roth</td><td>CN30.3</td><td>CAUTION - Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation.</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Carl Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Carl Roth</td><td>4984.1</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Tri sodium citrate dihydrate (C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Carl Roth</td><td>3580.1</td><td>CAUTION - May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.</td></tr><tr><td>Mineral oil&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>HP50.2</td><td></td></tr><tr><td>InSituPro-Vsi&amp;nbsp;</td><td>Intavis</td><td></td><td>www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc</td></tr></tbody></table>

a whole mount in situ hybridization method for the gastropod mollusc lymnaea stagnalis

In situ hibridizasyon bütün montaj (WMISH) ilgili (örneğin, bir embriyo veya larva gibi) bir &quot;bütün montaj &#39;doku terkibi olan bir nükleik asit molekülü (genellikle mRNA&#39;lar) uzamsal çözünürlük veya gelişimsel aşamada sağlayan bir tekniktir. önemli ölçüde karmaşık metazoan genomları fonksiyonel karakterizasyonu, yeni nesil dizi verilerinin tufan ile bir darboğaz haline gelmektedir bir meydan okuma katkıda bulunabilir çünkü WMISH son derece güçlüdür. çok zaman genellikle yeni model sistemler için WMISH deneylere doğasında çeşitli parametrelerini optimize için gereken tekniğin kavramsal basitliğine rağmen; doku tipleri ve gelişim aşamaları arasındaki hücresel ve biyokimyasal ince farklar tek WMISH yöntemi tüm durumlar için uygun olmayabilir anlamına gelir. Biz tutarlı üretmek ve yeniden ortaya çıkan gastropod modeli Lymnaea stagnalis için WMISH yöntemler kümesi geliştirdikgenlerin ve tüm gelişim aşamaları arasında bir aralık için açık WMISH işaretleri. Bu yöntemler, bir ontogenetik pencereye bilinmeyen kronolojik yaş larva atama, onların yumurta kapsüllerden verimli embriyoların kaldırılmasını ve larvaları, her ontogenetik pencere için uygun bir proteinaz-K tedavisinin uygulanmasını ve hibridizasyon sonrası hibridizasyon ve İmmuno dahil adımlar. Bu yöntemler, belirli bir RNA transkripti için ortaya çıkan sinyal prob özel ayarlamalar (öncelikle konsantrasyon ve melezleme sıcaklığı prob) ile daha da rafine olabilen bir zemin oluşturmaktadır.

Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi Örnek WMISH boyanma, yukarıda tarif edilen teknik kullanılarak üretilebilir, ve kabuk oluşumu arasında değişen moleküler bir dizi işlem katılan genlerin mekansal ekspresyonu, çeşitli yansıtırlar (yeni bir gen, 1, 2, 3 ve 4), gelişim aşamaları bir dizi genelinde transkripsiyon regülasyonu (Brachyury) hücre-hücre sinyal (DPP) için. Biz onlar da olur bekliyoruz bu ...

Watch this Scientific Journal Video about A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis at JoVE.com

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

A Whole Dağı<em&gt; In Situ</emGastropoda yumuşakça için&gt; Hibridizasyon Yöntemi<em&gt; Lymnaea stagnalis</em

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

a-whole-mount-situ-hybridization-method-for-gastropod-mollusc-lymnaea

Research

JoVE Journal

Biology

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

8.7K Görüntüleme.  Georg-August University of Göttingen. The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

Video: A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus)

Despite being one of the most productive fisheries in the Northwest Atlantic, much remains unknown about the natural reproductive dynamics of American lobsters. Recent work in exploited crustacean populations (crabs and lobsters) suggests that there are circumstances where mature females are unable to achieve their full reproductive potential due to sperm limitation. To examine this possibility in different regions of the American lobster fishery, a reliable and noninvasive method was developed for sampling large numbers of female lobsters at sea. This method involves inserting a blunt-tipped needle into the female&#39;s seminal receptacle to determine the presence or absence of a sperm plug and to withdraw a sample that can be examined for the presence of sperm. A series of control studies were conducted at the dock and in the laboratory to test the reliability of this technique. These efforts entailed sampling 294 female lobsters to confirm that the presence of a sperm plug was a reliable indicator of sperm within the receptacle and thus, mating. This paper details the methodology and the results obtained from a subset of the total females sampled. Of the 230 female lobsters sampled from George&#39;s Bank and Cape Ann, MA (size range = 71-145 mm in carapace length), 90.3% were positive for sperm. Potential explanations for the absence of sperm in some females include: immaturity (lack of physiological maturity), breakdown of the sperm plug after being used to fertilize a clutch of eggs, and lack of mating activity. The surveys indicate that this technique for examining the mating success of female lobsters is a reliable proxy that can be used in the field to document reproductive activity in natural populations.

A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters Homarus americanus

Fishery-induced changes to exploited crustacean fisheries, such as the American lobster fishery, could potentially influence their reproductive dynamics, leading to a reduction in mating success. This study&#39;s goal was to develop a noninvasive method for ascertaining the mating success of female lobsters that may be physiologically or functionally mature.

A Noninvaziv Yöntemi<em&gt; In situ</em&gt; Kadın American Istakoz&#39;ların çiftleşme Başarı (Belirlenmesi<em&gt; Homarus americanus</em&gt;)

Despite being one of the most productive fisheries in the Northwest Atlantic, much remains unknown about the natural reproductive dynamics of American ...

Çevre

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ocean temperatures and ocean acidification, corals are increasingly under threat. To tackle these challenges, advances in cell and molecular biology have proven to be crucial for diagnosing the health of corals. Modifying some of the techniques commonly used in human medicine could greatly improve researchers&#39; ability to treat and save corals. To address this, a protocol for in situ hybridization used primarily in human medicine and evolutionary developmental biology has been adapted for use in adult corals under stress.
The purpose of this method is to visualize the spatial expression of an RNA probe in adult coral tissue that has been embedded in paraffin and sectioned onto glass slides. This method focuses on removal of the paraffin and rehydration of the sample, pretreatment of the sample to ensure permeability of the sample, pre-hybridization incubation, hybridization of the RNA probe, and visualization of the RNA probe. This is a powerful method when using non-model organisms to discover where specific genes are expressed, and the protocol can be easily adapted for other non-model organisms. However, the method is limited in that it is primarily qualitative, because expression intensity can vary depending on the amount of time used during the visualization step and the concentration of the probe. Furthermore, patience is required, as this protocol can take up to 5 days (and in many cases, longer) depending on the probe being used. Finally, non-specific background staining is common, but this limitation can be overcome.

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

The goal of this protocol is to perform in situ hybridization on adult coral samples that have been embedded in paraffin and sectioned onto glass slides. This is a qualitative method used to visualize the spatial expression of an RNA anti-sense probe in paraffin-embedded tissues.

Situ Parafin gömülü yetişkin mercan örnekleri için hibridizasyon teknikleri

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of genes. Prior research into this emerging model system capitalized on comprehensive genome-wide investigations that have identified numerous quantitative trait loci (QTL) associated with various cave-associated phenotypes. However, the ability to connect genes of interest to the heritable basis for phenotypic change remains a significant challenge. One technique that can facilitate deeper understanding of the role of development in troglomorphic evolution is whole-mount in situ hybridization. This technique can be implemented to directly compare gene expression between cave- and surface-dwelling forms, nominate candidate genes underlying established QTL, identify genes of interest from next-generation sequencing studies, or develop other discovery-based approaches. In this report, we present a simple protocol, supported by a flexible checklist, that can be widely adapted for use well beyond the presented study system. It is hoped that this protocol can serve as a broad resource for the Astyanax community and beyond.

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

This protocol enables visualization of gene expression in embryonic Astyanax cavefish. This approach has been developed with the goal of maximizing gene expression signal, while minimizing non-specific background staining.

İn Situ hibridizasyon Astyanax embriyo için Wholemount

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Gelişim Biyolojisi

Spatial High-resolution Analysis of Gene Expression Levels in Tendons

In recent years, many protocols have been developed for high-resolution transcriptomics in many different medical and biology fields. However, matrix-rich tissues, and specifically, tendons were left behind due to their low cell number, low RNA amount per cell, and high matrix content, which made them complicated to analyze. One of the recent and most important single-cell tools is the spatial analysis of gene expression levels in tendons. These RNA spatial tools have specifically high importance in tendons to locate specific cells of new and unknown populations, validate single-cell RNA-seq results, and add histological context to the single-cell RNA-seq data. These new methods will enable the analysis of RNA in cells with exceptional sensitivity and the detection of single-molecule RNA targets at the single-cell level, which will help to molecularly characterize tendons and promote tendon research. 
In this method paper, we will focus on the available methods to analyze spatial gene expression levels on histological sections by using novel in situ hybridization assays to detect target RNA within intact cells at single-cell levels. First, we will focus on how to prepare the tendon tissue for the different available assays and how to amplify target-specific signals without background noise but with high sensitivity and high specificity. Then, the paper will describe specific permeabilization methods, the different probe designs, and the signal amplification strategies currently available. These unique methods of analyzing transcription levels of different genes in single-cell resolution will enable the identification and characterization of the tendon tissue cells in young and aged populations of various animal models and human tendon tissues. This method will also help analyze gene expression levels in other matrix-rich tissues such as bones, cartilage, and ligaments.

This article describes how to perform an optimized in situ protocol for tendons. This method discusses tissue preparation, section permeabilization, probe design, and signal amplification methods.

In recent years, many protocols have been developed for high-resolution transcriptomics in many different medical and biology fields. However, matrix-rich ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Tüm Dağı<em&gt; In situ</emE11.5 fare embriyolarına E8.5 ve&gt; Hibridizasyon

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Biyoloji

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male urethra, which relies on androgenic signals and epithelial-mesenchymal interactions1,2. Understanding the molecular mechanisms responsible for prostate development may reveal growth mechanisms that are inappropriately reawakened later in life to give rise to prostate diseases such as benign prostatic hyperplasia and prostate cancer.
The developing LUT is anatomically complex. By the time prostatic budding begins on 16.5 days post conception (dpc), numerous cell types are present. Vasculature, nerves and smooth muscle reside within the mesenchymal stroma3. This stroma surrounds a multilayered epithelium and gives rise to the fetal prostate through androgen receptor-dependent paracrine signals4. The identity of the stromal androgen receptor-responsive genes required for prostate development and the mechanism by which prostate ductal epithelium forms in response to these genes is not fully understood. The ability to precisely identify cell types and localize expression of specific factors within them is imperative to further understand prostate development. In situ hybridization (ISH) allows for localization of mRNAs within a tissue. Thus, this method can be used to identify pattern and timing of expression of signaling molecules and their receptors, thereby elucidating potential prostate developmental regulators.
Here, we describe a high throughput ISH technique to identify mRNA expression patterns in the fetal mouse LUT using vibrating microtome-cut sections. This method offers several advantages over other ISH protocols. Performing ISH on thin sections adhered to a slide is technically difficult; cryosections frequently have poor structural quality while both cryosections and paraffin sections often result in weak signal resolution. Performing ISH on whole mount tissues can result in probe trapping. In contrast, our high throughput technique utilizes thick-cut sections that reveal detailed tissue architecture. Modified microfuge tubes allow easy handling of sections during the ISH procedure. A maximum of 4 mRNA transcripts can be screened from a single 17.5dpc LUT with up to 24 mRNA transcripts detected in a single run, thereby reducing cost and maximizing efficiency. This method allows multiple treatment groups to be processed identically and as a single unit, thereby removing any bias for interpreting data. Most pertinently for prostate researchers, this method provides a spatial and temporal location of low and high abundance mRNA transcripts in the fetal mouse urethra that gives rise to the prostate ductal network.

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Here, we describe an efficient high throughput in situ hybridization (ISH) method for visualizing patterns of mRNA expression in developing fetal mouse prostate tissue sections. The method can be easily adapted to visualize mRNA expression patterns in other mouse tissues or in tissues from other species.

Yüksek Verimli In situ</emFetal Fare Alt Ürogenital Yolu mRNA İfade Desenler Karakterize> Hibridizasyon Yöntemi

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; Yerinde</emTüm Dağı Embriyolar ve Hücre histolojisi&gt; Hibridizasyon Deniz Elasmobranchs İçin Uyarlanmış

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and activating sperm, the components in the seminal fluid can also influence female physiology to augment fertilization success of the sperm donor. While many studies have reported such effects in species with separate sexes, few studies have addressed this in simultaneously hermaphroditic animals. This video protocol presents a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using a simultaneously hermaphroditic freshwater snail, the great pond snail Lymnaea stagnalis, as model organism. While the procedure is shown using complete prostate gland extracts, individual components (i.e., proteins, peptides, and other compounds) of the seminal fluid can be tested in the same way. Effects of the receipt of ejaculate components on egg laying can be quantified in terms of frequency of egg laying and more subtle estimates of female reproductive performance such as egg numbers within each egg masses. Results show that seminal fluid proteins affect female reproductive output in this simultaneous hermaphrodite, highlighting their importance for sexual selection.

This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Gastropod Molluskların Yumurta döflenmesi erkek Aksesuar Bezi Ürünlerinin Etkisi

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and ...

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. The sipunculid worm Sipunculus nudus is a crucial fishery resource as it has high nutritional and medicinal values. Currently, the research on the molecular biology of Sipunculus nudus is still in its infancy. The purpose of this article is to develop a sensitive method for localizing specific mRNA in Sipunculus nudus coelomic fluid. The protocol includes detailed steps of ISH, including digoxigenin-labeled antisense and sense riboprobe preparation, coelomic fluid collection and section preparation, specific riboprobe hybridization, antibody incubation, coloration and post-coloration treatments. The representative results obtained from a successful experiment using this method are demonstrated. The protocol should be applicable to other Sipuncula species as well.

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

This protocol describes an effective in situ hybridization approach to detect the mRNA expression levels and spatial patterns of target genes in Sipunculus nudus coelomic fluid.

Sipunculus nudus Coelomic Sıvı için yerinde Hibridizasyon

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective transmission among host rice. Laodelphax striatellus (small brown planthopper, SBPH) is the primary insect vector that horizontally transmits RSV while sucking sap from the phloem. Saliva plays a significant role in insects' feeding behavior. A convenient method that will be useful for research on insects' saliva with piercing-sucking feeding behavior is described here. In this method, insects were allowed to feed on an artificial diet sandwiched between two stretched paraffin film layers. The diet containing the saliva was collected each day, filtered, and concentrated for further analysis. Finally, the quality of collected saliva was examined by protein staining and immunoblotting. This method was exemplified by detecting the presence of RSV and a mucin-like protein in the saliva of SBPH. These artificial feeding and saliva collection method will lay a foundation for further research on factors in insect saliva related to feeding behavior and virus transmission.

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

The present protocol describes a method to collect sufficient saliva from piercing-sucking insects using an artificial medium. This is a convenient method for collecting insect saliva and studying salivary function on insect feeding behavior and vector-borne virus transmission.

A Whole Dağı

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

A Noninvaziv Yöntemi

Situ Parafin gömülü yetişkin mercan örnekleri için hibridizasyon teknikleri

İn Situ hibridizasyon Astyanax embriyo için Wholemount

Spatial High-resolution Analysis of Gene Expression Levels in Tendons

Tüm Dağı

Yüksek Verimli In situ Hibridizasyon Yöntemi

RNA

Gastropod Molluskların Yumurta döflenmesi erkek Aksesuar Bezi Ürünlerinin Etkisi

Sipunculus nudus Coelomic Sıvı için yerinde Hibridizasyon

Laodelphax striatellus Tükürük Koleksiyonu için İki Katmanlı Membran Sandviç Yöntemi