In situ hibridizasyon dokularda belirli genlerin mRNA ve IncRNA ifade desenleri sunmak için çok bilgilendirici bir tekniktir. Bu makaledeki amacımız, önemli bir balıkçılık kaynağı olan Sipunculus nudus'un coelomik sıvısında spesifik mRNA lokalizasyonunu saptamak için hassas bir yöntem geliştirmektir. Başarılı deneylerimizden elde ettiğimiz temsili sonuçları bu yöntemi kullanarak sunduk.
Yöntemimizin coelomik sıvıda spesifik mRNA ve IncRNA'nın ekspresyon desenlerini belirlemek için diğer Sipuncula türleri için de geçerli olacağı umulmalıdır. Diseksiyonu masasındasip nülleri düzeltin. Küçük otoklavlı makas ile Sipunculus nudus gövdesini açın.
Daha sonra pipetli coelomik sıvıyı toplayıp poli-D-lizin letedavi edilen mikroskop slaytlarına aktarın, hafifçe yayılır. 37 santigrat derece bir saat boyunca slaytlar hava kuru. Slaytları DEPC-PBS ile üç kez, yıkama başına beş dakika hafif ajitasyonla yıkayın.
PBS drenaj, oda sıcaklığında beş dakika boyunca slaytlar üzerinde proteinaz K çözeltisi ekleyin. Proteinaz K çözeltisini boşaltın. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca slaytlara PFA çözeltisi ekleyin.
PFA çözeltisini boşaltın. Slaytları DEPC-PBS ile üç kez, yıkama başına beş dakika hafif ajitasyonla yıkayın. PBS'yi boşaltın.
50 mikrolitre riboprob ekleyin. Bir kapak kaydırış ekleyin. Islak kutuya slaytlar koyun ve parafin film ile iyi mühür.
Bir gecede 60 santigrat derece melezleştirin. Slaytları yıkama tamponuna batırın ve kapak kayması otomatik olarak kapanana kadar bekletin. 65 derece santigrat iki kez önceden ısıtılmış yıkama tampon ile slaytlar yıkayın, nazik ajitasyon ile yıkama başına 30 dakika.
65 santigrat derece, yıkama başına 30 dakika nazik ajitasyon ile iki kez önceden ısıtılmış SSC çözeltisi ile slaytları yıkayın. Slaytları MABT çözeltisi ile oda sıcaklığında iki kez yıkayın. Nazik ajitasyon ile yıkama başına 30 dakika.
MABT'yi boşaltın. Engelleme arabelleği ekleyin. Slaytları oda sıcaklığında 3-4 saat kuluçkaya yatırın.
Engelleme arabelleği boşaltın. Antikor ekleyin, slaytları bir gecede dört derece santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Antikor çözeltisini boşaltın.
Slaytları MABT çözeltisi ile dört kez, yıkama başına 25 dakika hafif ajitasyonla yıkayın. MABT'yi boşaltın. Üç kez alkali fosfataz tampon ekleyin, kuluçka başına beş dakika.
Alkali fosfataz tampon kaldırın. BCIP-NBT boyama çözeltisini ekleyin. Slaytları karanlıkta tutun.
Boyama süresi sinyal yoğunluğuna bağlı olarak gece boyunca bile dakika ile saat arasında değişir. Boyama nın başlangıcında boyama durumu daha sık kontrol edilmelidir. Örneğin, birkaç dakika aralığı ile ve boyama en geç birkaç saat.
Kontrol süresi ışığa maruz kalma nedeniyle yüksek arka plan sinyali tanıtmak önlemek için olabilir kadar kısa olmalıdır. In situ hibridizasyonun temsili sinyalleri gösterilir. Sipunculus nudus coelomik sıvının dmrt1 hedefleyen anti-sense riboprobe ile yerinde hibridizasyonunda spermatozeugmata, şekil 2A ve B.Sense riboprobe for dmrt1'in trofoblast hücrelerinde yoğunlaşan mor boyama, şekil 2A ve B.Sense rinoprobu herhangi bir hibridizasyon sinyali, şekil 2C saptanmadı.
Bu videoyu izledikten sonra, sipunculus nudus coelomic sıvı hedef mRNA veya IncRNA ifade kalıpları görselleştirmek için nasıl çok iyi bir anlayışa sahip olacaktır.
