Biz Şekiller 1-3&#39;te gösterilen deneylerde kullanılan Nkx2-1 MCherry ESC Dr. Rossant ve Dr Bilodeau teşekkür etmek istiyorum. FACS SickKids-UHN Sitometrisi Tesisinde uygulandı. Bu çalışma Sağlık Araştırma Kanada Enstitüsü ve Yenilik Kanada Vakfı bir altyapı hibe (CSCCD) hibe işletim tarafından desteklenmiştir.

Hayvan deneyleri Sick Children Araştırma Enstitüsü Hastanesi Hayvan Bakım Komitesi talimatlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. 1. İskele Hazırlık <ol><li> akciğer Decellularization <ol><li> CO 2 odasının kullanılarak yetişkin Wistar sıçan Euthanize. Odasında hayvan koyun ve dakikada odası hacminin% 10-30 bir dolgu hızında% 100 CO 2 pozlama başlar. <ol><li> bilinçsizlik için hayvan gözlemlemek; Bu yaklaşık 2-3 dakika sonra ortaya çıkar. bilinçsizlik Bu süre içinde oluşmazsa, hızı ve oda mühür doldurmak kontrol edin. bilinçsizlik ardından, soluk göz rengi ve solunum olmaması için hayvan gözlemleyin. Her iki gözlenmesi halinde, 1-2 dakika boyunca CO2 doldurma korumak ve daha sonra prosedür için odasından gelen hayvan çıkarın. </li></ol></li><li> forepaws ve arka ayakları sabitleyerek yüzey diseksiyon hayvan Güvenli ve% 70 etanol ile göğüs ve karın bölgeyi sprey. kalp ve lu girişsternum boyunca dikey bir kesi kullanılarak göğüs boşluğu açılarak NGS. </li><li> diyafram üzerinden küçük kesiler yapmak ilk akciğerleri delinmesiyle şansını azaltmak, akciğerler geri çekmek için neden. Bir dikiş ile inferior vena kava bağlanır ve küçük diseksiyon makas ile sol atrium küçük bir kesi yerleştirin. </li><li> Heparinize Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) (HBSS, 10 U / ml heparin) ile dolu bir 25 G iğne ile hazırlanmış bir 10 ml şırınga kullanarak, akciğer dolaşımı sayesinde tampon itmek için sağ ventrikül içine iğne sokarak akciğer perfüzyon başlatmak (2 ml / dakika oranı). Akciğerler beyaz çevirmek ve sol atrium akan sıvı berrak bitene kadar bu işleme devam edin. </li><li> perfüzyon ardından, tiroid kıkırdak yakın plastik bir kateter ile trakea ve cannulate ortaya çıkarmak ve bir dikişle yerine sabitleyin. </li><li> Kur bir imbik standı ve kelepçe bir 10 ml şırınga sabitleyerek bir yerçekimi perfüzyon sistemi. Kaldır discard şırınga pistonu. akciğerler üzerinde 20 cm şırınga varil üzerinde maksimum doldurma noktasını sabitleyin. şırınga sonuna ve kanüle trakeaya decellularization çözümü sunmak için vana diğer ucuna uzun bir plastik boru için iki yönlü stopcock takın. şırıngaya çözüm dökün ve çözüm ekli plastik boru ve kateter doldurmak için izin verir. <ol><li> 1 dakika boyunca total akciğer kapasitesi (yaklaşık 12 ml) doldurarak akciğerleri lavaj ve sıvı akciğerlerin dışarı akmasına izin vermek için trakea plastik kateter çıkarın. H 2 O 20 cm altına basınç tutmak için akciğerlere lavaging şırınga fazla 10 ml doldurmayın </li></ol></li><li> fosfat tamponlu tuz (PBS) ile 10 kez batırıldıktan ardından sekiz kez decellularization çözeltisi ile akciğerlerin tekrar lavajı. </li><li> boyun ve göğüs boşluğundan serbest trakea ve akciğerler incelemek ve hayvan kaldırmak. vibratome se hazırlık kadar 4 ° C &#39;de soğuk PBS doku tutunctioning. </li></ol></li><li> Kalın bölüm nesil <ol><li> % 2 yaklaşık 15 ml (ağırlık / hacim) agaroz% 4 ve% 6 kadar küçük dikdörtgen bloklar halinde, tüm lobu yerleştirmek için (ağırlık / hacim) agaroz hazırlayın. mikrodalga PBS içinde düşük erime noktalı agaroz toz eritilir. Bir ısı bloğu 50 ml tüpler agaroz aktarın ve jelleşmenin önüne geçmek üzere 40 ° C &#39;nin üzerindeki sıcaklığı muhafaza. </li><li> Küçük bir makas kullanarak her lob (kranial, orta, aksesuar ve kuyruk sağa loblar ve sol lob) ayırmak için her lober bronş sonunda decellularized akciğer teşrih. Pat aşırı PBS kaldırmak ve% 2 içine yerleştirmek için emici yaprak kullanarak her lob kurutun (w / v) agaroz ısıtma bloğu üzerinde iken. </li><li> Petri kabı yerleştirmek, agaroz içinde kaplamanın 5 dakika sonra her bir lob kaldırma ve yüzey soğuk plaka üzerinde 1 dakika boyunca jel sağlar. </li><li> Yavaşça 5 dakika sonra, tekrar% 4 (ağırlık / hacim) agaroz serin lobları yerleştirin ve% 6 (ağırlık / hacim) agaroz ile bir kez daha kaplama tekrarlayın. </li><li> ardışık co sonraHer lob ating, kenarlarından çevreleyen doku agaroz en az 3 mm olan metal taban kalıplar kullanılarak% 6 (ağırlık / hacim) agaroz ayrı her lobun yerleştirin. Orient her lob deneyci bakan metal kalıbın yüzeyinde lobunun en büyük yassı kenarını konumlandırarak forseps kullanarak. Bu kenar vibratome kesit için numune plakasına sabitlenmiş taraf olacaktır. </li><li> blok önceden vibratome ile kesit için en az 30 dakika süreyle soğuk plaka üzerinde jel izin verin. 4 ° C&#39;de en çok 12 saat boyunca nemlendirilmiş bir odada saklayın blok önce kesit vibratome. </li><li> Kur soğuk PBS 12 ile kesit odasını doldurarak vibratome. Çevre buz banyosu ile kesit boyunca soğuk sıcaklık korumak. metal kalıplar blokları kaldırmak ve doku kenarından yaklaşık 3 mm tutarken, lobu çevreleyen aşırı agaroz aşağı trim bir jilet kullanın. </li><li> yapıştırıcı kullanılarak numune plakasının merkezine doku düzeltmek ve t içine plaka daldırınO kesit odasını PBS dolu. 0,2 mm / sn, 1.85 mm ve 350 um: sırasıyla aşağıdaki hız, genlik ve kalınlık değerleri seçerek vibratome sınırlarını kesit Kur. Not: lob yönlendirme uzunlamasına ve enine iki kısmı, kabul edilebilir. </li><li> Bölüm her lob tamamen. Bir bölüm tam bölüm dizisinin sonunda bıçak ile ayrılmış değilse elle kesilmiş bölümleri küçük makas kullanarak ücretsiz. nazikçe iskele bölümleri toplayın ve bir sonraki adıma kadar buz üzerinde PBS tutmak. Not: Oluşturulan Bölümler proksimal ve distal akciğer alanlarına ve recellularization için kullanılabilir her iki kaynaktan içerecektir; Bununla birlikte, yüzeyin en uzak akciğer içerecektir. </li></ol></li><li> skafold bölümlerinin atım <ol><li> mikrosantrifüj tüpler (30 bölüm / tüp) PBS 350 mikron kalınlığında iskele bölümleri aktarın ve nükleaz ile tedavi (PBS içinde 90 U / ml) (Malzeme listesi bakınız) 12 - üzerinde oda sıcaklığında 24 saat,Bir rotator. </li><li> nükleaz işlemin ardından, yeni bir mikrosantrifüj tüplerine forseps kullanılarak bir döndürücünün üzerine, oda sıcaklığında 6 saat süre ile, steril koşullar altında (PBS içinde 200 U / ml penisilin streptomisin ve 25 ug / ml amfoterisin B), antimikrobiyal çözeltisi ile muamele transferi bölümlerinden oluşmaktadır. Not: iskeleleri, kullanımdan önce bir hafta kadar 4 ° C antimikrobiyal çözelti içinde saklanabilir. </li><li> antimikrobiyal çözeltisi ile arındırma adımından sonra steril şartlar altında iki kez PBS ile yıkayın iskeleleri ve hücreler ile tohumlanmasından önce serbest farklılaşma ortamı (SFDM) serum aktarın. </li></ol></li></ol> 2. Endodermal Hücre Hazırlama <ol><li> Kesin Endoderm İndüksiyon <ol><li> 2i koşullar 13 kullanılarak besleyici içermeyen, serum serbest kültürü altında fare ESC hatları korumak. Trypsinization tarafından yapışık pluripotent kültüründen hücreleri kaldırarak endoderm indüksiyon başlayın. </li><li> 20,000 bir yoğunlukta SFDM tohum hücrelerin yeniden süspanseOrtam değişikliği olmadan hücreler üç gün boyunca, düşük yapışkan tabaklar / ml EB oluşumuna imkan vermek için. </li><li> Üç gün yavaşça, 10 ml bir pipet kullanarak 50 ml konik tüp EBS aktarmak ve onları oda sıcaklığında 3 dakika boyunca alt almasına izin sonra. </li><li> Dikkatlice aspire medya ve eklemek taze SFDM medya 50 ng / ml aktivin A ile desteklenmiş </li><li> geri 1 düşük yapışık plakalar üzerine Tohum hücreleri üç gün daha 2 yoğunluğu ve kültür kesin endoderm farklılaşma elde etmek. </li></ol></li><li> Kesin Endoderm zenginleştirme <ol><li> Gün 6 EBS toplamak tripsin ile ayırmak ve konjuge floresan antikorlar 14 kullanılarak c-KIT ve CXCR4 ifade etiket. </li><li> Her ikisinin de işaretleyicilerin ekspresyonu için floresans ile aktive edilen hücre tasnif (FACS) kullanılarak Sıralama etiketli hücreler zenginleştirilmiş bir nihai endoderm popülasyonu 15 elde edildi. </li></ol></li></ol> 3. Recellularization Kurulumu <ol><li> Hava-sıvı arayüzükültür kurulumu <ol><li> Steril forseps kullanarak bir hidrofobik yüzen membran (8 mikron gözenek boyutu) üzerine SFDM her decellularized iskele bölümü (adım 1.2.9) aktarın. iskele sağlamak bölümler zar üzerinde eşit yayılır. </li><li> sırasıyla SFDM 1 ya da 0.5 ml ile kuyu doldurarak 6 veya 12 oyuklu plakalar hazırlamak. Yavaşça bir hava-sıvı kültür kurulum oluşturma, zar medyanın üstünde yüzen sağlayan kuyu içine membranlar yerleştirin. </li></ol></li><li> 3D iskelelerinin tohumlama <ol><li> Kesin endoderm belirteçleri (adım 2.2.2) için aşağıdaki FACS, hemasitometre kullanarak sıralanmış hücreleri saymak SFDM 5 dakika ve tekrar süspansiyon için 400 xg&#39;de aşağı doğru döndürün. Yaklaşık olarak 100,000 hücre / 10 ul / iskelet ihtiva eden bir birim elde etmek için tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> doğrudan adım 3.1.2 her hazırlanmış bölümü üzerine pipet, hücrelerin 10 ul iskelesi recellularize için. </li><li> kültürlerinde, her 48 saat SFDM ortamı değiştirin. hafif bir eğim de plaka tutarak eski medya aspirekültür bozmamak için. Yavaş yavaş dalgalı membran batan önlemek için oyuk kenarı boyunca kültüre taze SFDM ekleyin. </li><li> olgun havayolu epitel numaralı seribaşı hücrelerin farklılaşmasını sağlamak kadar 21 gün boyunca hava-sıvı kültürleri korumak. Not: Recellularized bölümler hücre kültürü 16 boyunca herhangi bir zaman noktasında, doku boyama ve imünoflöresan (IF) mikroskopi için işlenebilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+Factors,+Matrices,+and+Forces+Combine+and+Control+Stem+Cells.">Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells.</a> Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).</li><li>Daley, W. P., Peters, S. B., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+dynamics+in+development+and+regenerative+medicine.">Extracellular matrix dynamics in development and regenerative medicine.</a> J. Cell Sci. 121 (3), 255-264 (2008).</li><li>Ghaedi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPS+cell-derived+alveolar+epithelium+repopulates+lung+extracellular+matrix.">Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix.</a> J. Clin. Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).</li><li>Huang, S. X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).</li><li>Jensen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+lung+de-cellularization+protocol+supports+embryonic+stem+cell+differentiation+in+vitro+and+following+implantation.">A rapid lung de-cellularization protocol supports embryonic stem cell differentiation in vitro and following implantation.</a> Tissue Eng. Part C: Methods. 18 (8), 632-646 (2012).</li><li>Longmire, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+derivation+of+purified+lung+and+thyroid+progenitors+from+embryonic+stem+cells.">Efficient derivation of purified lung and thyroid progenitors from embryonic stem cells.</a> Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).</li><li>Wong, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+mature+airway+epithelia+expressing+functional+CFTR+protein.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein.</a> Nat. Biotechnol. 30 (9), 876-882 (2012).</li><li>Gilpin, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Lung+Epithelial+Specification+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+on+Decellularized+Lung+Matrix.">Enhanced Lung Epithelial Specification of Human Induced Pluripotent Stem Cells on Decellularized Lung Matrix.</a> Annal. Thorac. Surg. 98, 1721-1729 (2014).</li><li>Cortiella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Acellular+Natural+Lung+Matrix+on+Murine+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation+and+Tissue+Formation.">Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation.</a> Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2565-2580 (2010).</li><li>Princivalle, M., De Agostini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+roles+of+heparan+sulfate+proteoglycans:+a+comparative+review+in+Drosophila,+mouse+and+human.">Developmental roles of heparan sulfate proteoglycans: a comparative review in Drosophila, mouse and human.</a> Int. J. Dev. Biol. 46, 267-278 (2002).</li><li>Thompson, S. M., Jesudason, E. C., Turnbull, J. E., Fernig, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+in+lung+morphogenesis:+The+elephant+in+the+room.">Heparan sulfate in lung morphogenesis: The elephant in the room.</a> Birth Defects Res. Part C, Embryo Today. 90 (1), 32-44 (2010).</li><li>Zimmermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+reproducibility+in+preparing+precision-cut+liver+tissue+slices.">Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices.</a> Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).</li><li>Ying, Q. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal.">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li><li>Fox, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Culture+and+FGF+Signaling+Drive+Differentiation+of+Murine+Pluripotent+Cells+to+Distal+Lung+Epithelial+Cells.">Three-Dimensional Culture and FGF Signaling Drive Differentiation of Murine Pluripotent Cells to Distal Lung Epithelial Cells.</a> Stem Cells Dev. 24 (1), 21-35 (2014).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+(FACS).">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).</li><li>Shojaie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acellular+lung+scaffolds+direct+differentiation+of+endoderm+to+functional+airway+epithelial+cells:+requirement+of+matrix-bound+HS+proteoglycans.">Acellular lung scaffolds direct differentiation of endoderm to functional airway epithelial cells: requirement of matrix-bound HS proteoglycans.</a> Stem Cell Reports. 4, 1-12 (2015).</li><li>Kubo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+definitive+endoderm+from+embryonic+stem+cells+in+culture.">Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture.</a> Development. 131 (7), 1651-1662 (2004).</li><li>Longmire, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Derivation+of+Purified+Lung+and+Thyroid+Progenitors+from+Embryonic+Stem+Cells.">Efficient Derivation of Purified Lung and Thyroid Progenitors from Embryonic Stem Cells.</a> Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).</li><li>Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3D+mouse+embryo+atlas+based+on+micro-CT.">A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT.</a> Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).</li></ol>

beyan için hiçbir rakip mali çıkarları vardır.

Burada açıklanan protokol başka hiçbir takviyesi ile farklılaşmayı doğrudan sadece doğal akciğer iskeleleri kullanarak olgun ESC türetilmiş havayolu epitel üretir. Bu kültür, kurulum, serumsuz, pahalı olmayan ve tekrarlanabilir tanımlanır. Baz farklılaşma medya yok büyüme faktörü takviyesi gereklidir. Kök hücre kökenli akciğer epitel hücreleri üretmek için daha önce yayınlanmış yöntemler soy kısıtlama 3,4,8,18,19 teşvik etmek büyüme faktörü takviyesi ile 2 boyutlu st...

Akciğer soy pluripotent hücrelerin Yönetmen farklılaşma mikro-1,2 hassas sinyal olayları bağlıdır. Bu nedenle sürecin dinamik doğası in vitro akciğer organogenez kesin olayları taklit etmek zor olmuştur. Son raporlar akciğer farklılaşma 3-8 ulaşmak için iki boyutlu kültürlerin çözünür büyüme faktörü takviyesi ile adım adım soy kısıtlama stratejilerini kullanmışlardır. adım adım farklılaşma protokollerde, pluripotent hücreler, embriyonik kök hücreleri (ESC) veya uyarılmış pluripotent kök hücreler olup, ilk kesin endoderm germ tabakasına ayırt edildi. homeodomen içeren transkripsiyon faktörü NKX2-1 ifadesi ile tanımlanan endodermal hücreler daha sonra, akciğer progenitör hücrelere daha sonra bir ön endoderm kaderine itti ve bulundu. Bu akciğer atalarıdır daha proksimal (havayolu) veya uzak (alveolar) akciğer epitel hücrelerinin wi için ayırt edildiinci büyüme faktörü takviyesi devam etti. Böyle 2 boyutlu stratejiler akciğer epitel hücreleri üreten bazı başarı vardı, ancak orada belirsiz verimlilik, diğer Endodermal soy mümkün kirlenme, 3 boyutlu (3D) yapı eksikliği gibi çeşitli sınırlamalar vardır ve bazı durumlarda tanımlanmamış kültürlerin kullanımı serum takviyesi ile. Hücresizleştirilmiş akciğer iskeleler üzerine pluripotent veya farklılaşmış hücrelerin kültürü artan akciğer epitelyal yapılar 3,5,6,8,9 oluşturan Serpilen hücreleri, rejeneratif potansiyelini değerlendirmek için bir tahlil olarak kullanılır. Bu tür raporlar kültür sürekli büyüme faktörü veya serum takviyesi ile İskele üzerinde hücreleri ekildi. Akciğer gelişimi çevresel işaretlere yanıt olarak bölünmesi, göç, gen ekspresyonu ve tek tek hücrelerin farklılaşmasını içermektedir. hücre dışı matrisi (ECM) yapısal destek sağlamanın yanı sıra, tissu yönlendiren glikoproteinlerin bir kafes olanentegre ve bu süreçleri 10,11 düzenleyerek e morfolojilerinden. Daha iyi in vivo akciğer gelişim ortamını taklit etmek endoderm kültürü için doğal bir platform olarak akciğer ECM iskele kullanarak, yüksek verimlilik ve tekrarlanabilirlik ile ayar tanımlanmış 3D-kültürde hücre kökenli havayolu epitel hücrelerini kök yarattı. Fare, akciğer ECM iskeleleri oluşturulan Decellularization hem de fare ESC türetilmiş endodermal hücreler tarafından üretilen ve daha sonra, bu iskeleler üzerine ekilmiştir. CXCR4 ve c-KIT proteinlerinin Çift ifade havayolu (proksimal akciğer) progenitör hücreler olarak tanımlanır Sox2 &amp; NKX2-1 ifade hem pozitif kesin bir endoderm hücre kimliğini ve hücreleri gösterir. Kesin endoderm hücreleri in vitro fonksiyonel hava yolu epitel hücreleri üretmek için üç hafta kadar hava sıvı arayüzü (ALI) de kültüre edildi. Bu protokol tanımdan akciğer soy farklılaşmasını teşvikgibi erken NKX2-1 + / Sox2 + erken proksimal akciğer ataları ortaya çıkması ile gözlenen 7 gün olarak tive endoderm. 14. günde ve kirpikli de ortaya kültür olgun hava yolu epitel hücre popülasyonlarının 21 (TUBB4A +), kulüp (SCGB1A1 +) ve bazal (TRP63 + KRT5 +) yerel fare solunum yollarında morfolojik ve fonksiyonel benzerlik ile hücreleri tarafından. Bu protokol epitel hücreleri hava yolu sağlam farklılaşma elde etmek için 3D-matris mikroçevresinin önemini ortaya koymaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="901">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Reagents</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Perfusion solution</td>
			<td style="width:163px;">Sigma</td>
			<td style="width:168px;">H0777</td>
			<td style="width:281px;">10U/mL heparin</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:291px;">Perfusion solution</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:168px;">14170112</td>
			<td style="width:281px;">dissolved in Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS-)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Decellularization solution</td>
			<td style="width:163px;">BioShop</td>
			<td style="width:168px;">CHA003</td>
			<td style="width:281px;">8mM CHAPS&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Decellularization solution</td>
			<td style="width:163px;">Sigma</td>
			<td style="width:168px;">E9884</td>
			<td style="width:281px;">25mM EDTA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Decellularization solution</td>
			<td style="width:163px;">BioShop</td>
			<td style="width:168px;">SOD002</td>
			<td style="width:281px;">1M NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Decellularization solution</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">14190-144</td>
			<td style="width:281px;">dissolved in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Benzonase nuclease</td>
			<td style="width:163px;">Novagen</td>
			<td style="width:168px;">70664-3</td>
			<td style="width:281px;">90U/mL Benzonase nuclease&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Benzonase nuclease</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">14190-144</td>
			<td style="width:281px;">diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Antimicrobial solution&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:168px;">15140</td>
			<td style="width:281px;">200U/mL penicillin streptomycin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Antimicrobial solution&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:168px;">15290</td>
			<td style="width:281px;">25&#956;g/mL amphotericin B&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Antimicrobial solution&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">14190-144</td>
			<td style="width:281px;">diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Trypsinization&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">12605-028</td>
			<td style="width:281px;">TrypLE</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:291px;">Serum free differentiation media (SFDM)</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">IMDM 2440-053, F12 11765-054</td>
			<td style="width:281px;">3:1 ratio of IMDM and Ham&#8217;s modified F12 medium</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Serum free differentiation media (SFDM)</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">12587-010</td>
			<td style="width:281px;">B27 supplement (50x dilution)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Serum free differentiation media (SFDM)</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">17502-048</td>
			<td style="width:281px;">N2 supplement (100x dilution)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Serum free differentiation media (SFDM)</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">15260-037</td>
			<td style="width:281px;">0.05% (Fraction V) bovine serum albumin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Serum free differentiation media (SFDM)</td>
			<td style="width:163px;">Gibco</td>
			<td style="width:168px;">35050-061</td>
			<td style="width:281px;">200mM Glutamax&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Serum free differentiation media (SFDM)</td>
			<td style="width:163px;">Sigma</td>
			<td style="width:168px;">M6145</td>
			<td style="width:281px;">4&#956;M monothioglycerol</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Serum free differentiation media (SFDM)</td>
			<td style="width:163px;">Sigma</td>
			<td style="width:168px;">A4403&#160;</td>
			<td style="width:281px;">0.05mg/mL ascobic acid</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Endoderm induction</td>
			<td style="width:163px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:168px;">338-AC/CF</td>
			<td style="width:281px;">Activin A</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Antibodies</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">CDH1</td>
			<td style="width:163px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:168px;">610181</td>
			<td style="width:281px;">Mouse, non-conjugated, 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">C-KIT</td>
			<td style="width:163px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:168px;">558163</td>
			<td style="width:281px;">Rat, PE-Cy7, 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">CXCR4</td>
			<td style="width:163px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:168px;">558644</td>
			<td style="width:281px;">Rat, APC, 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">KRT5</td>
			<td style="width:163px;">Abcam</td>
			<td style="width:168px;">ab24647</td>
			<td style="width:281px;">Rabbit, non-conjugated, 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">NKX2-1</td>
			<td style="width:163px;">Abcam</td>
			<td style="width:168px;">ab76013</td>
			<td style="width:281px;">Rabbit, non-conjugated, 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Laminin</td>
			<td style="width:163px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:168px;">NB300-144</td>
			<td style="width:281px;">Rabbit, non-conjugated, 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">SCGB1A1</td>
			<td style="width:163px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:168px;">sc-9772&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Goat, non-conjugated, 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">SOX2</td>
			<td style="width:163px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:168px;">AF2018&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Goat, non-conjugated, 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">TRP63</td>
			<td style="width:163px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:168px;">sc-8431</td>
			<td style="width:281px;">Mouse, non-conjugated, 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">TUBB4A</td>
			<td style="width:163px;">BioGenex</td>
			<td style="width:168px;">MU178-UC</td>
			<td style="width:281px;">Mouse, non-conjugated, 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Goat IgG&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:168px;">A-11055</td>
			<td style="width:281px;">Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Mouse IgG&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:168px;">A-21202</td>
			<td style="width:281px;">Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Mouse IgG&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:168px;">A-31571</td>
			<td style="width:281px;">Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rabbit IgG&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:168px;">A-21206</td>
			<td style="width:281px;">Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Rabbit IgG&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:168px;">A-31573</td>
			<td style="width:281px;">Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Other Materials</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low adherent plates</td>
			<td style="width:163px;">Nunc</td>
			<td style="width:168px;">Z721050&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Low cell binding plates,&#160; 6 wells&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Air-liquid interface membranes&#160;</td>
			<td>Whatman</td>
			<td align="right">110614</td>
			<td>Hydrophobic Nucleopore membrane, 8&#956;m pore size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S&#160;</td>
			<td>Leica Vibratome</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tissue Adhesive</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td align="right">10033</td>
			<td>Pelco tissue adhesive</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of esc-derived mouse airway epithelial cells using decellularized lung scaffolds

Akciğer soy farklılaşma büyüme faktörü sinyalizasyon, hücre-hücre etkileşimleri ve hücre-matriks etkileşimleri içeren karmaşık çevresel ipuçları entegrasyonunu gerektirir. Bu nedenle karmaşıklığı nedeniyle, in vitro olarak akciğer gelişiminin tekrarlama zorlu olan akciğer epitelyal hücrelerine kök hücrelerin farklılaşmasını teşvik etmek. Bu protokol, hücresizleştirilmiş akciğer iskeleleri kök hücre türevli yolu epitel hücreleri akciğer, 3 boyutlu bir ortam taklit eden ve üretmek için kullanılır. Fare embriyonik kök hücre ilk önce decellularized iskelelerinin üzerine ekilir aktivin A Endoderm hücreleri ile bir embriyoid gövde (EB) kültür yöntemi kullanılarak endoderm soyuna farklılaşmış ve en fazla 21 gün süreyle hava-sıvı arayüzü kültüre edilir. Bu teknik, ek büyüme faktörü takviyesi olmadan fonksiyonel hava yolu epitel hücrelerine seribaşı hücreler (kirpikli hücreler, kulüp hücreleri ve bazal hücreler) farklılaşmasını teşvik eder. Bu kültür kurulum tanımlanır, serum-ücretsiz, ucuz ve tekrarlanabilir. Sınırlı kirlenme kültüründe olmayan akciğer endoderm soydan gelen olmamasına rağmen, bu protokol sadece hava yolu epitel popülasyonları üretir ve alveol epitel hücrelerinin neden vermez. Bu protokol ile oluşan hava yolu epitelial akciğer organojenez esnasında ve hastalık modelleme ya da sistik fibroz gibi hava yolu ilgili patolojilerin ilaç keşfi platformları için hücre-matris etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir.

Bu protokolde belirtildiği gibi, kesin endoderm sağlam farklılaşma epitel hücreleri decellularized akciğer iskele bölümleri numaralı seribaşı hücrelerin uzun kültürünü kullanılarak elde edilebilir havayolunu olgun. Decellularized iskeleleri (1) konak hücreler tamamen çıkarıldığından emin olmak için karakterize, ve (2) hücre dışı matriks proteinleri farklılaşması için iskeleler kullanmadan önce korunmuş tavsiye edilir. Şekil 1A &#39;de ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds at JoVE.com

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Decellularized Akciğer Yapı iskeleleri kullanarak ESC türetilmiş Fare Havayolu Epitel Hücreleri Üretimi

Bu protokol verimli hava yolu epitel hücreleri olgun fare embriyonik kök hücre kaynaklı kesin endoderm yönlendirir. Bu farklılaşma tekniği tanımlanmış bir serum içermeyen kültür ortamında, akciğer soy özellikleri doğrudan 3 boyutlu hücresizleştirilmiş akciğer iskeleleri kullanır.

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

generation-esc-derived-mouse-airway-epithelial-cells-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.6K Görüntüleme.  Hospital for Sick Children.  Bu protokol verimli hava yolu epitel hücreleri olgun fare embriyonik kök hücre kaynaklı kesin endoderm yönlendirir. Bu farklılaşma tekniği tanımlanmış bir serum içermeyen kültür ortamında, akciğer soy özellikleri doğrudan 3 boyutlu hücresizleştirilmiş akciğer iskeleleri kullanır. 

Video: Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among the various fabrication methods, electrospinning is the most attractive one due to its simplicity and versatility. Additionally, electrospun nanofibers mimic the size of natural extracellular matrix ensuring additional support for cell survival and growth. This study showed the viability of the fabrication of long fibers spanning a larger deposit area for a novel biodegradable and biocompatible polymer named&#160;poly(glycerol-dodecanoate) (PGD)1 by using a newly designed collector for electrospinning. PGD exhibits unique elastic properties with similar mechanical properties to nerve tissues, thus it is suitable for neural tissue engineering applications. The synthesis and fabrication set-up for making fibrous scaffolding materials was simple, highly reproducible, and inexpensive. In biocompatibility testing, cells derived from mouse embryonic stem cells could adhere to and grow on the electrospun PGD fibers. In summary, this protocol provided a versatile fabrication method for making PGD electrospun fibers to support the growth of mouse embryonic stem cell derived neural lineage cells.

Electrospun Fibrous Scaffolds of Polyglycerol-dodecanedioate for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Synthesis and fabrication of electrospun long fibers spanning a larger deposit area via a newly designed collector from a novel biodegradable polymer named poly(glycerol-dodecanoate) (PGD) was reported. The fibers were able to support the growth of cells derived from mouse pluripotent stem cells.

Fare Embriyonik kök hücrelerden Mühendislik Sinir Dokular için Poli electrospun fibröz iskeleleri (gliserol-dodecanedioate)

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

Biyomühendislik

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer cartilage tissue offer a promising solution to repair articular cartilage. To select the optimal cell source for tissue repair, it is important to develop an appropriate culture platform to systematically examine the biological and biomechanical differences in the tissue-engineered cartilage by different cell sources. Here we applied a three-dimensional (3D) biomimetic hydrogel culture platform to systematically examine cartilage regeneration potential of juvenile, adult, and osteoarthritic (OA) chondrocytes. The 3D biomimetic hydrogel consisted of synthetic component poly(ethylene glycol) and bioactive component chondroitin sulfate, which provides a physiologically relevant microenvironment for in vitro culture of chondrocytes. In addition, the scaffold may be potentially used for cell delivery for cartilage repair in vivo. Cartilage tissue engineered in the scaffold can be evaluated using quantitative gene expression, immunofluorescence staining, biochemical assays, and mechanical testing. Utilizing these outcomes, we were able to characterize the differential regenerative potential of chondrocytes of varying age, both at the gene expression level and in the biochemical and biomechanical properties of the engineered cartilage tissue. The 3D culture model could be applied to investigate the molecular and functional differences among chondrocytes and progenitor cells from different stages of normal or aberrant development.

Cartilage repair represents an unmet medical challenge and cell-based approaches to engineer human articular cartilage are a promising solution. Here, we describe three-dimensional (3D) biomimetic hydrogels as an ideal tool for the expansion and maturation of human articular chondrocytes.

Eklem Kondrosit Kültür ve Kıkırdak Üretimi için 3D hidrojel iskeleleri

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model substrates for organ-scale tissue development. Sprague Dawley rat kidneys are cannulated by inserting a catheter into the renal artery and perfused with a series of low-concentration detergents (Triton X-100 and sodium dodecyl sulfate (SDS)) over 26 hr to derive intact, whole-kidney scaffolds with intact perfusable vasculature, glomeruli, and renal tubules. Following decellularization, the renal scaffold is placed inside a custom-designed perfusion bioreactor vessel, and the catheterized renal artery is connected to a perfusion circuit consisting of: a peristaltic pump; tubing; and optional probes for pH, dissolved oxygen, and pressure. After sterilizing the scaffold with peracetic acid and ethanol, and balancing the pH (7.4), the kidney scaffold is prepared for seeding via perfusion of culture medium within a large-capacity incubator maintained at 37 &#176;C and 5% CO2. Forty million renal cortical tubular epithelial (RCTE) cells are injected through the renal artery, and rapidly perfused through the scaffold under high flow (25 ml/min) and pressure (~230 mmHg) for 15 min before reducing the flow to a physiological rate (4 ml/min). RCTE cells primarily populate the tubular ECM niche within the renal cortex, proliferate, and form tubular epithelial structures over seven days of perfusion culture. A 44 &#181;M resazurin solution in culture medium is perfused through the kidney for 1 hr during medium exchanges to provide a fluorometric, redox-based metabolic assessment of cell viability and proliferation during tubulogenesis. The kidney perfusion bioreactor permits non-invasive sampling of medium for biochemical assessment, and multiple inlet ports allow alternative retrograde seeding through the renal vein or ureter. These protocols can be used to recellularize kidney scaffolds with a variety of cell types, including vascular endothelial, tubular epithelial, and stromal fibroblasts, for rapid evaluation within this system.

This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.

Epitel Hücre Repopulation ve Böbrek Doku Kalkınma Kemirgen Ekstrasellüler Matriks iskelelerinin hazırlanması

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an environment that closely mimics the structural features of non-polarized tissue. Furthermore, the particular intrinsic nanofiber structure of the scaffold makes it transparent to visual light, which allows for easy visualization of the sample under microscopy. This advantage was largely used to study cell migration, organization, proliferation, and differentiation and thus any development of their particular cellular function by staining with specific dyes or probes. Furthermore, in this work, we describe the good performance of this system to easily study the redifferentiation of expanded human articular chondrocytes into cartilaginous tissue. Cells were encapsulated into self-assembling peptide scaffolds and cultured under specific conditions to promote chondrogenesis. Three-dimensional cultures showed good viability during the 4 weeks of the experiment. As expected, samples cultured with chondrogenic inducers (compared to non-induced controls) stained strongly positive for toluidine blue (which stains glycosaminoglycans (GAGs) that are highly present in cartilage extracellular matrix) and expressed specific molecular markers, including collagen type I, II and X, according to Western Blot analysis. This protocol is easy to perform and can be used at research laboratories, industries and for educational purposes in laboratory courses.

Here, we present a protocol to obtain 3D-culture systems in self-assembling peptide scaffolds to promote the differentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes into cartilage-like tissue.

Üç boyutlu peptid iskele memeli hücrelerinde kültür

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage research has focused on the development of regenerative scaffolds. This article describes the development of scaffolds that are completely derived from natural cartilage extracellular matrix, coming from an equine donor. Potential applications of the scaffolds include producing allografts for cartilage repair, serving as a scaffold for osteochondral tissue engineering, and providing in vitro models to study tissue formation. By decellularizing the tissue, the donor cells are removed, but many of the natural bioactive cues are thought to be retained. The main advantage of using such a natural scaffold in comparison to a synthetically produced scaffold is that no further functionalization of polymers is required to drive osteochondral tissue regeneration. The cartilage-derived matrix scaffolds can be used for bone and cartilage tissue regeneration in both in vivo and in vitro settings.

Decellularized cartilage-derived scaffolds can be used as a scaffold to guide cartilage repair and as a means to regenerate osteochondral tissue. This paper describes the decellularization process in detail and provides suggestions to use these scaffolds in in vitro settings.

Decellularized matris kıkırdak elde edilen iskele imalatı

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...

Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the context of liver diseases, 3-dimensional (3D) models based on cholangiocytes have emerged such as cysts, spheroids, or tube-like structures to mimic tissue topology for organogenesis, disease modeling, and drug screening studies. These structures have been mainly obtained by embedding cholangiocytes in a hydrogel. The main purpose was to study self-organization by addressing epithelial polarity, functional, and morphological properties. However, very few studies focus on cyst formation efficiency. When this is the case, the efficiency is often quantified from images of a single plane. Functional assays and structural analysis are performed without representing the potential heterogeneity of cyst distribution arising from hydrogel polymerization heterogeneities and side effects. Therefore, the quantitative analysis, when done, cannot be used for comparison from one article to another. Moreover, this methodology does not allow comparisons of 3D growth potential of different matrices and cell types. Additionally, there is no mention of the experimental troubleshooting for immunostaining cysts. In this article, we provide a reliable and universal method to show that the initial cell distribution is related to the heterogeneous vertical distribution of cyst formation. Cholangiocyte cells embedded in hydrogel are followed with Z-stacks analysis along the hydrogel depth over the time course of 10 days. With this method, a robust kinetics of cyst formation efficiency and growth is obtained. We also present methods to evaluate cyst polarity and secretory function. Finally, additional tips for optimizing immunostaining protocols are provided in order to limit cyst collapse for imaging. This approach can be applied to other 3D cell culture studies, thus opening the possibilities to compare one system to another.

Three-dimensional (3D) cellular systems are relevant models for investigating organogenesis. A hydrogel-based method for biliary cysts production and their characterization is proposed. This protocol unravels the barriers of 3D characterization, with a straightforward and reliable method to assess cyst formation efficiency, sizes, and to test their functionality.

Fonksiyonel ve Polarize Safra Epitel Kistlerinin Oluşumu ve Kantitatif Karakterizasyonu

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of concept, a simplified and undifferentiated human skin containing a dermal (stromal) and an epidermal (epithelial) compartment has been modelled. To accomplish this, a versatile and robust, vinyl-based device divided into two chambers has been developed, overcoming some of the drawbacks present in microfluidic devices based on polydimethylsiloxane (PDMS) for biomedical applications, such as the use of expensive and specialized equipment or the absorption of small, hydrophobic molecules and proteins. Moreover, a new method based on parallel flow was developed, enabling the in situ deposition of both the dermal and epidermal compartments. The skin construct consists of a fibrin matrix containing human primary fibroblasts and a monolayer of immortalized keratinocytes seeded on top, which is subsequently maintained under dynamic culture conditions. This new microfluidic platform opens the possibility to model human skin diseases and extrapolate the method to generate other complex tissues.

Here, we present a protocol to generate a three-dimensional simplified and undifferentiated skin model using a micromachined microfluidic platform. A parallel flow approach allows the in situ deposition of a dermal compartment for the seeding of epithelial cells on top, all controlled by syringe pumps.

Mikromakine Mikroakışkan Platformda Basitleştirilmiş Üç Boyutlu Çip Üzerinde Cilt Modeli Üretimi

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is an important structure of gingival tissue, especially in the repair and regeneration of periodontal tissue. Studying the functions of gingival epithelial cells has crucial scientific value, such as repairing oral defects and detecting the compatibility of biomaterials. As human gingival epithelial cells are highly differentiated keratinized cells, their lifespan is short, and they are difficult to passage. So far, there are only two ways to isolate and culture gingival epithelial cells, a direct explant method and an enzymatic method. However, the time required to obtain epithelial cells using the direct explant method is longer, and the cell survival rate of the enzymatic method is lower. Clinically, the acquisition of gingival tissue is limited, so a stable, efficient, and simple in vitro isolation and culture system is needed. We improved the traditional enzymatic method by adding Y-27632, a Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor, which can selectively promote the growth of epithelial cells. Our modified enzymatic method simplifies the steps of the traditional enzymatic method and increases the efficiency of culturing epithelial cells, which has significant advantages over the direct explant method and the enzymatic method.

Here we present a modified method for the isolation and culture of human gingival epithelial cells by adding the Rock inhibitor, Y-27632, to the traditional method. This method is easier, less time-consuming, enhances stem cell properties, and produces larger numbers of high-potential epithelial cells both for the laboratory and for clinical applications.

Y-27632 Kullanarak Birincil İnsan Dişeti Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is ...

Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices

There is a need for improved 3-dimensional (3D) lung models that recapitulate the architectural and cellular complexity of the native lung alveolus ex vivo. Recently developed organoid models have facilitated the expansion and study of lung epithelial progenitors in vitro, but these platforms typically rely on mouse tumor-derived matrix and/or serum, and incorporate just one or two cellular lineages. Here, we describe a protocol for generating engineered lung tissues (ELTs) based on the multi-lineage recellularization of decellularized precision-cut lung slices (PCLS). ELTs contain alveolar-like structures comprising alveolar epithelium, mesenchyme, and endothelium, within an extracellular matrix (ECM) substrate closely resembling that of native lung. To generate the tissues, rat lungs are inflated with agarose, sliced into 450 &#181;m-thick slices, cut into strips, and decellularized. The resulting acellular ECM scaffolds are then reseeded with primary endothelial cells, fibroblasts, and alveolar epithelial type 2 cells (AEC2s). AEC2s can be maintained in ELT culture for at least 7 days with a serum-free, chemically-defined growth medium. Throughout the tissue preparation and culture process, the slices are clipped into a cassette system that facilitates handling and standardized cell seeding of multiple ELTs in parallel. These ELTs represent an organotypic culture platform that should facilitate investigations of cell-cell and cell-matrix interactions within the alveolus as well as biochemical signals regulating AEC2s and their niche.

This protocol describes a method to generate reproducible, small-scale engineered lung tissues, by repopulating decellularized precision-cut lung slices with alveolar epithelial type 2 cells, fibroblasts, and endothelial cells.

Desellülerize Akciğer Dilimlerinden Hazırlanan Mühendislik Akciğer Dokuları

There is a need for improved 3-dimensional (3D) lung models that recapitulate the architectural and cellular complexity of the native lung alveolus ex ...

Synthesis of Decellularized Cartilage Extracellular Matrix Hydrogels

Decellularized cartilage extracellular matrix (DC-ECM) hydrogels are promising biomaterials for tissue engineering and regenerative medicine due to their biocompatibility and ability to mimic natural tissue properties. This protocol aims to produce DC-ECM hydrogels that closely mimic the native ECM of cartilage tissue. The protocol involves a combination of physical and chemical disruption and enzymatic digestion to remove the cellular material while preserving the structure and composition of the ECM. The DC-ECM is cross-linked using a chemical agent to form a stable and biologically active hydrogel. The DC-ECM hydrogel has excellent biological activity, spatial structure, and biological induction function, as well as low immunogenicity. These characteristics are beneficial in promoting cell adhesion, proliferation, differentiation, and migration and for creating a superior microenvironment for cell growth. This protocol provides a valuable resource for researchers and clinicians in the field of tissue engineering. Biomimetic hydrogels can potentially enhance the development of effective tissue engineering strategies for cartilage repair and regeneration.

This paper introduces a new method for the synthesis of decellularized cartilage extracellular matrix (DC-ECM) hydrogels. DC-ECM hydrogels have excellent biocompatibility and provide a superior microenvironment for cell growth. Therefore, they can be ideal cell scaffolds and biological delivery systems.

Decellularize Kıkırdak Hücre Dışı Matriks Hidrojellerinin Sentezi

Decellularized cartilage extracellular matrix (DC-ECM) hydrogels are promising biomaterials for tissue engineering and regenerative medicine due to their ...