Bu protokol hücre dışı matrise açılan kapıdır. Karmaşıklık ve yapısı mikron ölçeğine kadar iniyor. Bu nedenle, bu yöntemin temel avantajı, yapısal bütünlüğünü koruyan hücre dışı bir matris elde etmeyi mümkün kılmaktadır, böylece biyokimyasal ve anatomik analizin yolunu açmaktadır.
Prosedürü gösterenler, Alejandro Mayorca Gilani, Raphael Reuten ve Maria Rafaeva, şu anda laboratuvarımda ve Chris Madsen ve laboratuvarımda bulunan ve Lund Üniversitesi'nde çalışmaya devam eden. Ötenazili farenin toraksını, karnını ve sırtını saç kesme makinesi ile tıraş darak başlayın. Bölgeyi% 70 etanol ile dezenfekte edin.
Daha sonra fareyi bir polistiren tepsiye sabitleyin, dört uçlu arka uzuvlarını, başını ve kuyruğunu uzatın. Mikrocerrahi mikroskobun altına yerleştirin. Mayo düz desen makası kullanarak, alt mandibular bölgeden alt karın bölgesine doğru akan bir kese kesisi yapın ve torasik duvarı ve peritonları ortaya çıkarmak için deri altından parçalara bölün.
Daha sonra torasik duvarın her iki tarafındaki altıncı interkostal boşluk boyunca pektoralis majör ve pektoralis küçük kaslarını kesmek için mikrocerrahi makas kullanın. Sternumu önceki kesiler boyunca düz desen makası ile kesin. Daha sonra sternumu uzun ekseni boyunca keserek sternotomiyi tamamlayın.
Kardiyopulmoner kompleksi ortaya çıkarmak için torasik duvarın her iki tarafını yükseltin ve sabitlayın. Timus ve çevresindeki yağ dokusunu hassas bir şekilde ataşmanlarından çekerek çıkarmak için yuvarlak uçlu mikro toparlamalar kullanın. Ve yemek borusunu mikro makasla kesin.
Brachiocephalic veinleri ve brakiyofalik arteri keskin mikro torptiklerle ayırın. Daha sonra ligasyon ve koterizasyonu kolaylaştırmak için sol ortak karotis ve sol subklavyan arterleri alttaki dokudan ayırın. Brakiyofalik sol ortak karotis ve sol subklavyan arterlerin ortaya çıkışının üzerine dikişler yerleştirmek için bir mikroneedle tutucu ve keskin mikroasipler ve dokuz oh dikiş kullanın, brakiyofalik damarları dağlayın.
Mikro makas kullanarak, bağı bölümlere alarak bir giriş açın. Nefes borusuna 27 ölçer kateter takın ve bronşlara trakea dallarına kadar hassas bir şekilde itin, bronşları bozmamaya dikkat edin. Altı O dikişi kullanarak, kateteri sabitlemek için nefes borusunun etrafına üç dikiş yerleştirin.
12. torasik omurun yüksekliğinde fareyi bölümlendirin, alçalan Aorta omurgaya doğru ön sırada çalışır ve omurga ile birlikte burada bölümlenmelidir. Aort katerazörünü retrograd olarak katetere alın ve kateteri aort arkına ulaşana kadar itin. Bir dikiş kullanarak, kateter ucunun beş milimetre altından başlayarak Aorta'nın etrafına dört dikiş yerleştirin.
Silikon boru ve daha düşük konektörler kullanarak fareyi bir pompa sistemine bağlayın. 15 dakika boyunca dakikada 200 mikrolitre deiyonize su ile perfuse. Daha sonra perfüzyon maddesini deiyonize suda seyreltilmiş% 0.5 DOC olarak değiştirin ve bir gecede perfüzyon.
Ertesi gün, perfüzyon maddesini deiyonize suda seyreltilmiş% 0.1 SDS olarak değiştirin ve sekiz saat boyunca perfüzyon. Daha sonra SDS ve DOC'u yıkamak için 24 saat boyunca deiyonize su ile perfüzyona uğrayın.
Dokuyu steril bir kriyo tüpünde% 1 penisilin streptomisin ve dört santigrat derecede 0.3 mikromoler sodyum azit ile deiyonize suda saklayın. İmmün lekelenme yapmak için örneği bir gecede %6 eşek serumu ve %3 BSA içeren bir kriyo tüpüne inkübe ederek engelleyin. Daha sonra PBS'de % 3 eşek serumunda 24 saat primer antikor ile kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra numuneyi PBST'de beş kez yıkama başına bir saat yıkayın. PBS'de %3 eşek serumunda floresan konjuge sekonder antikor ile numuneyi 24 saat boyunca kuluçkaya yatırın. Ardından yıkamaları PBST'de tekrarlayın.
İyonize suyu ekleyin ve numuneyi doğrudan ışıktan dört santigrat derecede saklayın. Örneği görüntülemek için, cam bir alt tabağa yerleştirin ve iki damla damla çözeltisi ile nemlendirin. Hedefi belirleyin ve floresan ışığı kullanarak numuneyi inceleyin.
Bilgisayar kontrolüne geçin, lazerleri açın ve lazer yoğunluğunu, iğne deliği diyaframını, dedektörlerin dalga boyunu, kazancını, çözünürlüğünü ve yakınlaştırmasını ayarlayın. Z yığını için sayı ve adım boyutunu ayarlayın, sonra edinmeye başlayın. Bir akciğer lobu ötanazili bir fareden geçirin ve 10'a 10 ila 5 milimetre kriyo kalıbına yerleştirin.
Yaklaşık 500 mil oct bileşiği ile örtün ve kuru buz üzerinde dondurun. Numuneyi o sıcaklıkta tut. İşlenmiş bir fareden bir hücreden çıkarmış akciğer lobu çıkar, en büyük yüzey alanı aşağı olan bir kriyo kalıbına yerleştirin ve OCT bileşiği ile örtün.
Numuneyi kuru buz üzerinde dondurun ve aksi gerekmedilene kadar bu sıcaklıkta saklayın. Örnek en az 12 hafta saklanabilir. Donmuş doku bloklarını eksi 20 santigrat derecede beş mikrometre bölümüne bölümlere ayırdık için kriyostat kullanın.
Ve bölümleri yapışkan cam slaytlara yerleştirin. Slaytları hava kuruyana kadar oda sıcaklığına aktarın. Slaytları PBS'ye kısaca daldır, ardından 15 dakika boyunca PBS'de %4 paraformaldehit.
PBS'de bir kez, daha sonra iki kez damıtılmış suda yıkama başına beş dakika yıkayın. Slaytları Myer'in hematoksilin çözeltisinde 10 dakika boyunca daldırin. Daha sonra, slaytları 10 dakika boyunca damıtılmış su altında bir Copeland kavanozunda yıkayın ve yedi dakika boyunca eosin çözeltiye daldırin.
Xylene'e birkaç kez daldırın. Birkaç damla DPX montaj ortamı uygulayın ve bir cam kapak kayması yerleştirin. Slaytları kimyasal bir başlık altında bir gecede kurumaya bırakın ve ardından bir slayt tarayıcısında tarayın.
Protokolü başarıyla tamamladıktan sonra kalp ve akciğerler ile NX dokusu hücrelerden arındırılmış olacaktır. Hücreden arındırma, ECM iskelelerinin hematoksilin eozin boyanma ile doğrulanabilir. İskeleler taze organların boyutlarını korur ve insoliable ECM yapısı bozulmamış.
ECM iskeleleri geçirgenliğin ve hafif penetrabilliğin arttığını gösterdi. Bu protokolün motorlu bir mikroskop aşaması ile kullanılması, tüm montaj örneklerinin alt mikron çözünürlüğünde üç boyutlu karo görüntülemesini sağlar. Komple decellurizasyon elde etmek için ilgi organlarına doğru akıştan kaçınmak önemlidir.
Damarların mikrocerrahi diseksiyonu ve ligasyonu etkili olmalıdır. Ve aynı zamanda yerel VCM yapısını korumak için hedef dokulara saygı gösterin. Bu prosedürden sonra, iskeleler yapısal ECM proteinleri için zenginleştirilecek ve kütle spektrometresi veya doku mühendisliği için kullanılabilir.
Bu teknik, hücre dışı matrisin yüksek çözünürlüklü haritalandırılmasına giden yolu açmaktadır.
