Bu protokol, bozulmamış akciğer hücre dışı matriksinin üç boyutlu bir doku kültürü substratı ve orta derecede verim olarak tekrarlanabilir kullanımını sağlar. Tasarlanmış akciğer doku sisteminin temel avantajı, platformun esnekliğidir. ELT'ler, çeşitli doku iskelelerini, hücreleri veya ilgilenilen kültür ortamlarını kullanacak şekilde uyarlanabilir.
Akciğerler çıkarıldıktan sonra, 10 mililitrelik bir şırıngayı agaroz ve HBSS ile fenol kırmızısı olmadan doldurun. Akciğerleri trakea kanülü yoluyla yaklaşık 10 mililitre hava ile şişirin, ardından hazırlanan agarozu hemen trakea kanülü yoluyla akciğer loblarının en distal uçları şişirilene kadar enjekte edin. Beyaz kapağı dört yönlü bir stopcock'tan trakea kanülünün dişi luer kilidine takarak trakeayı kapatın.
Akciğeri, agarozun katılaşmasını sağlamak için buz üzerine 150 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Akciğer dilimlerini makaledeki protokole göre hazırlayın ve ardından 100 milimetrelik bir Petri kabını 1/3 hacim PBS ile doldurun. Forseps kullanarak kasetleri ve tırnakları tabağa aktarın.
Dilimler donmuşsa, oda sıcaklığındaki PBS'ye dökerek her seferinde bir tabak çözülür. Ardından, çözülmüş bir dilimi 150 milimetrelik bir Petri kabına aktarın. İnce forseps veya hemostat kullanarak dilimi yavaşça açın ve fazla PBS'yi dokunun etrafından dikkatlice aspire edin.
Ardından, bir tıraş bıçağının tam uzunluğunu tabağa sıkıca bastırarak ve hafifçe yan yana sallayarak dilimden üç milimetre genişliğinde, en az dokuz milimetre uzunluğunda bir şerit kesin. Doku şeridini kasete klipslemek için, kasetin üzerinde yüzdürün ve her iki ucundaki klipslerdeki delikleri aşacak şekilde dikkatlice ortalayın. İnce forsepslerle bir ucundaki deliğe kısmen bir sekme yerleştirin, dokuyu yavaşça düzeltin ve ikinci tırnağı ayarlayın.
Son olarak, dokuyu sabitlemek için her tırnağa tamamen basmak için forseps kullanın. Tüm tarafları kırptıktan sonra, kasetleri içeren 100 milimetrelik çanağı laminer bir akış başlığına aktarın. Kasetleri, çentikli tarafları kavramak için kavisli bir hemostat kullanarak ilk hücreselleştirme çözeltisini içeren altı delikli plakalara aktarın.
Ardından, altı kuyucuklu plakayı 10 dakika boyunca 30 RPM'de yörüngesel bir çalkalayıcıya yerleştirin. Sıvıyı her bir kuyucuktan aspire edin, ardından kuyucuk başına ikinci desellülarizasyon çözeltisinin üç mililitresi ile değiştirin. Plakayı 30 RPM'de yörüngesel bir çalkalayıcıya yerleştirin ve beş dakika boyunca inkübe edin.
Bu işlemi, makaledeki hücresellikten arındırma protokolünde belirtildiği gibi her bir çözümle tekrarlayın. PBS ile son durulamadan sonra, dokuları antibiyotik ve antimikotiklerle taze PBS içeren steril altı kuyucuklu plakalara aktarın ve 48 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Antibiyotikler ve antimikotiklerle sterilizasyondan sonra, akciğer dokusu iskeleleri hemen tohumlanabilir veya 30 güne kadar dört santigrat derecede saklanabilir.
Kültür için kullanmadan önce, ek bir sterilizasyon adımı olarak dört santigrat derecede depolanan iskeleleri, taze PBS ve antibiyotikler ve antimikotiklerle gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, iskeleleri steril PBS ile, kuyu başına beş mililitre, üç kez, her biri beş dakika boyunca durulayın. İskeleleri, tohumlama için dokuları seçmek için 5X büyütmede bir faz kontrast mikroskobu altında inceleyin.
Endotel hücre süspansiyonunu endotel ortamında mililitre başına 5 milyon hücrede, dilim başına 500.000 endotel hücresi tohumlamak için yeterli hücreyle hazırlayın. Otoklavlanmış tohumlama banyolarını 100 milimetrelik Petri tabaklarına yerleştirin ve durulama iskelelerini baş aşağı dikkatlice tohumlama banyolarına aktarın. Hazırlanan hücre süspansiyonunu karıştırmak için yavaşça döndürün.
Daha sonra, 100 mikrolitre hücreyi doğrudan kuyucukların tabanındaki her bir dokunun üzerine dikkatlice pipetleyin ve pipet ucu ile dokuya zarar vermemeye özen gösterin. Tohumlanmış dokuları hücre kültürü inkübatörüne aktarın. Endotel hücresi tohumlamasından 24 saat sonra, manuel bir pipet kullanarak her bir kuyucuğa 900 mikrolitre önceden ısıtılmış kültür ortamı ekleyin, ardından plakayı inkübatöre geri verin.
24 saatlik hücre tohumlamasından sonra, ortamı çıkarın ve kuyucuk başına bir mililitre taze endotel ortamını değiştirin. Endotel hücrelerinin tohumlanmasından 72 saat sonra, AEC2'leri veya alveolar epitel tip II hücrelerini ve bir hemositometre kullanarak fibroblastları sayın ve AEC2 büyüme ortamında mililitre başına 5 milyon hücrede 1: 1 hücre süspansiyonu hazırlayın. Her tohumlama banyosundan gelen ortamı iyice pipetleyin ve hazırlanan hücre süspansiyonunu yavaşça döndürün.
Pipet, kuyunun tabanındaki her bir dokunun hemen üstüne 100 mikrolitre hücre koyar. Tohumlanmış dokuları hücre kültürü inkübatörüne aktarın. İki saat sonra, her bir kuyucuğa 900 mikrolitre önceden ısıtılmış AEC2 büyüme ortamı ekleyin, ardından plakayı inkübatöre geri verin.
AEC2'ler ve fibroblastlar ile 24 saatlik kültürden sonra, kaset başına kuyu başına bir mililitre önceden ısıtılmış AEC2 büyüme ortamı içeren 12 delikli bir plaka hazırlayın. Tohumlama banyosunun her bir kuyucuğundan 800 mikrolitre orta pipet alın, daha sonra kasetleri tohumlama banyosundan çıkarın ve sağ taraftan hazırlanan 12 delikli plakaya, kuyu başına bir kasete aktarın. İstenilen kültür süresi boyunca her gün bir cam Pasteur pipet kullanarak kültür ortamını dikkatlice değiştirin.
Kültür süresi boyunca 5X büyütmede faz kontrast mikroskobu ile doku yeniden popülasyonunun derecesini izleyin. Doku iskelelerinin H ve E boyamaları, görünür hücre çekirdeği olmadan desellülarizasyondan sonra korunmuş alveoler mimari göstermiştir. Alveolar doku, desellülarize ekstrasellüler matriks iskeleleri faz kontrast mikroskobu ile 5X büyütmede görüntülendiğinde gözlendi.
Bazı dilimlerde büyük dallanan hava yolları ve damarlar da görülebiliyordu. Kültürün yedinci gününde, faz kontrast mikroskopisi, mühendislik ürünü akciğer dokularındaki resellülarizasyon paterninin, başarılı repopulasyon vakalarında dokuların alveoler yapısını taklit ettiğini göstermiştir. Zayıf resellülarizasyon da görülebiliyordu.
Yedi veya sekizinci günde H ve E boyaması, alveoler septanın yeniden popülasyonunu gösterdi. İmmünofloresan ayakta, pro-kollajen tip I alfa 1-pozitif fibroblastlar, ABCA3-pozitif AEC2'ler, CD31-pozitif endotel hücreleri, bol miktarda SPB-pozitif AEC2'ler ortaya çıktı. Dahası, timidin testi birçok çoğalan AEC2 gösterdi.
Bu teknik, akciğer doku mühendisliği için stratejilerin geliştirilmesini kolaylaştırmış ve alveolus içinde tip II hücre proliferasyonunu ve farklılaşmasını destekleyen kuyrukların araştırılmasını sağlamıştır.
