The authors have no acknowledgements.

Tüm hayvan deneyleri Sağlık kurallar National Institutes göre yapılan ve Toledo Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır. pIL1-DsRed 1. Farelerin fenotipleme Not: Yavrular, vahşi tip (WT) C57BL6 fare ile heterozigot pIL1-DsRed fareler üreme tarafından oluşturulur. Üç hafta, dört eski yavrular fenotipleme hazır olarak kabul edilir. Farelerin Submandibuler kanama küçük değişiklikler 23 ile kurulmuş bir protokol izler. <ol><li> Fare Pups Whole Kan Beyaz kan hücrelerinin izolasyonu <ol><li> Her 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne heparin 20 ul ekleyin. </li><li> kafesten bir yavru kazanır. yavru kimlik etiketi kaydetmek. Submandibuler venden kan toplama önce yavrular uyutmak için gerekli değildir. </li><li> Boyun berduş tarafından yavru tutun ve th submandibuler ven delmek5 mm neşter kullanarak e yanak kese. Kan damlaları penetrasyon açısından terlemek, böylece küçük bir delik oluşturmak için yeterli kuvvet uygulamayın. Her yavru için yeni bir iğne kullanın. </li><li> Bir heparin içeren mikrosantrifüj tüp yavru başına kan 5 damla - 3 toplayın. Delinen bölgeyi temizleyin ve hemostaz kolaylaştırmak için basınç uygulayın. </li><li> Yeni kafese yavru koyun ve hayvan tesis kafesi dönmeden önce 30 dakika boyunca gözlemleyin. </li><li> Pozitif ve negatif kontroller olarak, bilinen bir fenotip yetişkin farelerden kan toplamak. </li><li> Her bir tüp, girdap tüplerine kırmızı kan hücresi lize tampon 500 ul ekle ve 5 inkübe edin - buz üzerinde 10 dakika. </li><li> Her bir tüp içinde hücre süspansiyonları altında fetal sığır serumu (FBS), 500 ul - yavaş yavaş 400 ekleyin. Net bir arayüz üst katman hücre süspansiyonu ve FBS alt tabaka arasında gözlemlenebilir. </li><li> Cap tüpleri ve santrifüj örnekleri 5 dakika boyunca 1,500 x g&#39;de. </li><li> kürk 1.1.9 - Tekrar 1.1.7 adımlarıther kırmızı kan hücreleri çıkarmak. lizis ilk kez yeterli olup olmadığını tekrar etmeyin. taneleri santrifüjleme sonrası ayırt etmek zor olması gerekir. </li></ol></li><li> Lipopolisakarid (LPS) uyarılması ve Kültür <ol><li> Tam Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 ortamı içinde 200 ul içinde süspanse hücreleri. </li><li> tüp sitometri bir akış hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> tam RPMI 1640 ortamı içinde 990 ul LPS stok çözeltisinin 10 ul (1 mg / ml) karıştırarak çalışma çözeltisi LPS sağlayın. </li><li> Hücre süspansiyonunun 200 ul çalışma çözeltisi 10 ug / ml LPS 20 ul ekle. </li><li> Kapak borular gevşek ve% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de 4 saat örnekleri inkübe edin. </li></ol></li><li> Akım Sitometri Analizi <ol><li> flow sitometri için veri toplama programını açın. edinimi örnek öncesinde satın alma şablonu ayarlayın. </li><li> araç paletinde Dot-Plot aracını tıklatın. Bir fo çizinyan dağılım (SSC) arsa vs rward dağılım (FSC). Doğrusal ölçeğine FSC ve SSC gerilim parametreleri ayarlayın. </li><li> sitometresinin izin FSC ve SSC düşük eşik seçin. sırasıyla, FSC ve SSC için barajı 200 ve 50 uygulayın. </li><li> SSC arsa vs FSC içinde, enkaz, kırmızı kan hücreleri ve lenfositler monositler, granülositler ve dendritik hücreleri içerir ve dışlayan bir kapı G1 çizin. </li><li> araç paletinde Histogram aracını tıklatın. Bir FL2 (kırmızı floresan kanalı) histogram çizin. Tüm DsRed pozitif olayları kapsar bir kapı çizmek için FL2 sinyallerinin taban çizgisi ve pozitif kontrol örneği ayarlamak için bir negatif kontrol örneği kullanın. </li><li> sitometresinin ve Sıvıları Kontrol panelinde, sıvı moduna &quot;RUN&quot; ve akış hızını &quot;HI&quot; (yaklaşık 60 ul / dak) olarak ayarlayın. Her numune için 10.000 olayları edinin. </li><li> G1 kapısından DsRed pozitif hücrelerin yüzdesi ölçerek yavru fenotip belirleyin. </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. pIL1-DsRed Farelerde Cilt iltihap İndüksiyon <ol><li> 100 mg / kg ketamin 10 mg / kg ksilazin ve 1 mg / kg asepromazin ihtiva eden bir anestezik kokteyl intraperitonal (İP) enjeksiyon ile fare anestezisi. Yeterli anestezi fareler ayak tutam arka pençe çekme görünmüyor. </li><li> Farenin her iki kulağın arka yüzeyine saç kaldırma krem ​​uygulayın. 1 dakika 30 saniye bekleyin. Su-ıslatılmış pamuk ile kulak yüzeyini silin ve kurumaya bırakın. </li><li> mikrometre ile kulak kalınlığını ölçmek ve ayrı bir kafes içinde fare değiştirin. (- 30 dakika ~ 15) anestezi kurtarma kadar gözlemleyin. Epilasyon ürünün neden olduğu deri iltihabı gidermek için daha fazla deney yapılmadan önce fare 3 gün dinlenmeye bırakın. </li><li> 1 ml aseton içinde OX 16.7 mg eritilmesi ve zeytin yağı 250 ul OX / aseton çözeltisi 750 ul karıştırarak 1.25% (w / v) oks hazırlayın. 250 &amp; ile aseton 750 ul karıştırılarak araç çözüm hazırlayın# 181; zeytinyağı l. </li><li> anestezik kokteyl (2.1) ip enjeksiyon yoluyla fare yeniden uyutmak. daha önce olduğu gibi kulak kalınlığını ölçün. </li><li> sağ kulak her iki yüzüne% 1.25 OX 12.5 ul uygulayın. sol kulak her iki yüzüne aseton / zeytin yağı araç solüsyonu 12.5 ul uygulayın. </li><li> Tam o, diğer farelerin tarafından kulakları hakaret önlemek orijinal kafeste fare yerini ve hayvan barınağı tesisi dönmek için iyileşene kadar fare kafes arkadaşları ayrı tutun. NOT: Epilasyon kulak kalınlığı değişikliği aşağıdaki küçük deri iltihabı neden olabilir. Bu küçük inflamasyon 3 gün sonra çözüldü, normal kulak kalınlığı tarafından teyit edilecektir. 24 saat süre ile topikal uygulama sonrası, OX-muamele edilmiş kulaklar önemli (p &lt;0.01) kıyasla araç çözeltisi, tek başına tedavi edilen kulakları şişme göstermektedir. </li></ol> pIL1-DsRed Farelerde nötrofil 3. Etiketleme Not: düşük doz f nötrofillerin in vivo etiketlenmesindeluorescence-konjuge nötrofil özgü mAb yeni geliştirilmiş bir protokol 19 izler. Retro-orbital enjeksiyonları birkaç modifikasyon 24 ile kurulmuş bir protokole göre gerçekleştirilir. <ol><li> fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), 90 ul, 0.5 mg / ml ve Alexa Fluor 647-bağlı anti-Ly6G mAb (klon 1A8) 10 ul seyreltilmesi anti-Ly6G mAb çalışma çözeltisi hazırlayın. </li><li> 28 ölçü bir iğne ile, U-100 insülin şırıngaya anti-Ly6G mAb çalışma çözeltisi (50 ug / ml) 100 ul aktarın. </li><li> daha önce tarif edilen anestezi kokteyl (2.1) IP enjeksiyonu ile bir yetişkin pIL1-DsRed fare anestezisi. Temiz bir çalışma gemide anestezi fare karın aşağı gelecek şekilde yerleştirin. </li><li> Kısmen soketten göz küresinin çıkıntı bir fare göze hafifçe aşağı doğru cilt dorsal basınç ve ventral uygulayın. </li><li> Dikkatle retroorbital medial kantus yaklaşık 30 ° &#39;lik bir açı ile aşağı konik, iğne yersinüs. NOT: Operatör sinüse iğne ekler kez baskı, nüfuz ve rahatlamış direnci hissedebilirsiniz. </li><li> Yavaş ve yumuşak fare içine solüsyonu (5 ug mAb / fare / enjeksiyon) çalışan anti-Ly6G mAb 100 ul enjekte edilir. iğneyi hızla sökün. kanama az miktarda başarılı bir enjeksiyon göstermektedir. </li><li> Hemen sağ ve sol fare kulakları üzerine% 1.25 OX ve araç çözümü uygulayın. </li><li> 8 saat sonra, aynı fareye retroorbital enjeksiyon yoluyla taze hazırlanmış anti-Ly6G mAb çalışma çözeltisi (5 ug mAb / fare / enjeksiyon) 100 ul yönetmek. </li><li> Hemen görüntüleme önce, kan damarları görselleştirmek 30 mg / ml flöresin izotiyosiyanat (FITC) ile 100 ul yönetmek için retroorbital enjeksiyon yoluyla dekstran (150 kDa) ile konjüge edilmiş. </li></ol> pIL-1 DsRed Farelerde Nötrofil Hazırlama 4. intravital Görüntüleme <ol><li> anestezik kokteyl (2.1) ip enjeksiyonu ile fare anestezisi.0; iken görüntüleme için anestezi altında kuruluğunu önlemek için fare gözlerine veteriner merhem sürün. <ol><li> PBS eşit hacimde orijinal anestezi kokteyl 500 ul seyreltilmesi ile 1 ml yarım doz anestezi kokteyli hazırlanır. </li><li> Bir kelebek 27 gauge iğne ile 1 ml şırınga yarım doz anestezik kokteyl aktarın. </li><li> intraperitoneal fare karın içine kelebeğin iğne takın ve bantlama ile karın kelebek kanat düzeltmek. </li></ol></li><li> Görüntüleme aşamasında merkezinde bir cam lamel. yerinde tutmak için lamel kenarlarında bantlayın. </li><li> Fare kulağı ventral yüzeyi üzerinde hem de lamel PBS damla yerleştirin. </li><li> Pozisyon lamel üzerindeki kulak ile fare anestezi. Ayrıca bant aracılığıyla yerinde tutulan lamel ve bir cam slayt arasındaki kulak sandviç ile, aşağı kulak ucu, dorsal yüzü monte edin. </li><li> Çok lazer floresan konfokal mikroskop ve ilgili tüm e-açmaquipment. Ortam ışığı maruziyeti en aza indirmek için oda ışıkları kapatın. </li><li> görüntü elde etme yazılımını açın. Boya Listesi menüsünde floresan boyaların tespiti için lazer kanalları seçin. </li><li> Mercek aracılığıyla DsRed + hücrelerden kan damarları ve kırmızı sinyaller yeşil sinyallerin gözlem iltihaplı kulak cilt üzerinde odağı ayarlayın. </li><li> Tarama 2 us / piksel hızı ve 512 × 512 piksel çözünürlüğe sahip bir hızlı tarama gerçekleştirin. Canlı Görünüm menüsünde her kanal için bir Pseudocolor seçin. sonunu ayarlamak ve tarama konumunu başlatmak için odak düğmesini ayarlayın. </li><li> 8 mikro-sn / piksel ve 800 × 800 veya 1024 × 1024 piksel çözünürlük - tarama 4 hızı yavaş taramalar yapar. , Yüksek gerilim ayarlayın kazanç ve doygunluk (kırmızı piksel) kaçınarak sinyallerin yoğunluğunu en üst düzeye çıkarmak için her kanalda ofset. Her bir kanalda, sadece birkaç kırmızı piksel olmalıdır. </li><li> th tarayarak üç boyutlu görüntü kümeleri oluşturmae kulak cilt, 635 mikron x 635 mikron × 30 mikron (20X objektif), ya da 1270 mikron × stratum korneum yüzeysel başlayan ve x, y, 317 mikron × 30 mikron (40X objektif) × 317 mikron z hacimleri ile aşağıya doğru ilerliyor 2 mikron z-adımlarda 1270 mikron × 50 mikron (10X objektif). NOT: stratum korneum epidermisin en dış tabakası olan ve hali hazırda güçlü otofloresan sinyaline göre lokalize edilebilir. </li><li> zaman atlamalı görüntüleme deneylerde, kayıt üç boyutlu görüntüler en fazla 8 saat süre ile, her 2 ya da 4 dak. </li><li> kelebek iğne ile yarım doz anestezi kokteyl 10 ul - fare anestezi kurtarmak için başlar Aralıklı, seğirmesi bıyıkları gözleme dayalı kaydetti, 5 yönetmek. NOT: Anestezi doz dikkatli olun - aşırı doz fare ölüme neden olabilir. Seçenek olarak ise, bir kavanoza inhalasyon anestezisi kısa süreli anestezi ve farenin tatbik edilebilirburun konisi, uzun vadeli görüntüleme için kullanılabilir. </li><li> görüntüleme tamamlandığında aşamasından anestezi fareyi çıkarın. Kaseti çıkarın ve farenin karın kelebek iğne çıkarılır. hayvan barınağı tesisi ayrı bir kafes fare dönün. NOT: - 3 saat kısa süreli görüntüleme (&lt;1 saat), fareler tamamen 1 hızlı anestezi kurtarmak. 16 saat - Uzun süreli görüntüleme (~ 8 saat), fareler 12 tipik geri kazanım süresi ile yavaşça iyileşir. Böylece, oral su idaresi şiddetli su kaybını önlemek için iyileşme döneminde en az birkaç kez tavsiye edilir. </li><li> Süreç görüntüleme veri setleri, tek tek hücrelerin izlemek göç yolları üretmek ve görüntü analiz yazılımı 25 kullanılarak hücre göçü yönünü ve hızını hesaplar. </li></ol>

<ol>
	<li>Nauseef, W. M., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+at+work.">Neutrophils at work.</a> Nat. Immunol. 15 (7), 602-611 (2014).</li><li>Kobayashi, S. D., Voyich, J. M., Burlak, C., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+the+innate+immune+response.">Neutrophils in the innate immune response.</a> Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 53 (6), 505-517 (2005).</li><li>Condliffe, A. M., Kitchen, E., Chilvers, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+priming:+pathophysiological+consequences+and+underlying+mechanisms.">Neutrophil priming: pathophysiological consequences and underlying mechanisms.</a> Clin. Sci. (Lond). 94 (5), 461-471 (1998).</li><li>El-Benna, J., Dang, P. M., Gougerot-Pocidalo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming+of+the+neutrophil+NADPH+oxidase+activation:+role+of+p47phox+phosphorylation+and+NOX2+mobilization+to+the+plasma+membrane.">Priming of the neutrophil NADPH oxidase activation: role of p47phox phosphorylation and NOX2 mobilization to the plasma membrane.</a> Semin. Immunopathol. 30 (3), 279-289 (2008).</li><li>Benson, R. A., McInnes, I. B., Brewer, J. M., Garside, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+imaging+in+rheumatic+diseases.">Cellular imaging in rheumatic diseases.</a> Nat. Rev. Rheumatol. 11 (6), 357-367 (2015).</li><li>Herz, J., Zinselmeyer, B. H., McGavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+microbial+immunity+in+living+tissues.">Two-photon imaging of microbial immunity in living tissues.</a> Microsc. Microanal. 18 (4), 730-741 (2012).</li><li>Tang, J., van Panhuys, N., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+immunoimaging--deeper,+bigger,+more+precise,+and+definitively+more+colorful.">The future of immunoimaging--deeper, bigger, more precise, and definitively more colorful.</a> Eur. J. Immunol. 43 (6), 1407-1412 (2013).</li><li>Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cell+biology+in+live+animals:+ready+for+prime+time.">Imaging cell biology in live animals: ready for prime time.</a> J. Cell. Biol. 201 (7), 969-979 (2013).</li><li>Ng, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+neutrophil+response+to+sterile+tissue+injury+in+mouse+dermis+reveals+a+three-phase+cascade+of+events.">Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events.</a> J. Invest. Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).</li><li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation.">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li><li>Finsterbusch, M., Voisin, M. B., Beyrau, M., Williams, T. J., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+recruited+by+chemoattractants+in+vivo+induce+microvascular+plasma+protein+leakage+through+secretion+of+TNF.">Neutrophils recruited by chemoattractants in vivo induce microvascular plasma protein leakage through secretion of TNF.</a> J. Exp. Med. 211 (7), 1307-1314 (2014).</li><li>Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptolysin+S+inhibits+neutrophil+recruitment+during+the+early+stages+of+Streptococcus+pyogenes+infection.">Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection.</a> Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).</li><li>Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+damage+the+hippocampus+during+acute+picornavirus+infection+of+the+brain.">Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain.</a> J. Neuroinflammation. 9 (50), (2012).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multi-modal+imaging+of+experimental+autoimmune+uveoretinitis+in+transgenic+reporter+mice+reveals+the+dynamic+nature+of+inflammatory+changes+during+disease+progression.">In vivo multi-modal imaging of experimental autoimmune uveoretinitis in transgenic reporter mice reveals the dynamic nature of inflammatory changes during disease progression.</a> J. Neuroinflammation. 12 (17), (2015).</li><li>Slaba, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+Dynamic+Platelet-Neutrophil+Response+in+Sterile+Liver+Injury+and+Repair+in+Mice.">Imaging the Dynamic Platelet-Neutrophil Response in Sterile Liver Injury and Repair in Mice.</a> Hepatology. , (2015).</li><li>Mizuno, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+reveals+PKA+regulation+of+ERK+activity+during+neutrophil+recruitment+to+inflamed+intestines.">In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines.</a> J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).</li><li>Hasenberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catchup:+a+mouse+model+for+imaging-based+tracking+and+modulation+of+neutrophil+granulocytes.">Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes.</a> Nat. Methods. 12 (5), 445-452 (2015).</li><li>Matsushima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+IL-1beta+production+in+skin.">Intravital imaging of IL-1beta production in skin.</a> J. Invest. Dermatol. 130 (6), 1571-1580 (2010).</li><li>Yipp, B. G., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+against+neutrophil+LY6G+do+not+inhibit+leukocyte+recruitment+in+mice+in+vivo.">Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo.</a> Blood. 121 (1), 241-242 (2013).</li><li>Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-invasive+imaging+for+the+in+vivo+tracking+of+high-speed+vesicle+transport+in+mouse+neutrophils.">A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils.</a> Sci. Rep. 3, (1913).</li><li>Sreeramkumar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+scan+for+activated+platelets+to+initiate+inflammation.">Neutrophils scan for activated platelets to initiate inflammation.</a> Science. 346 (6214), 1234-1238 (2014).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+priming+occurs+in+a+sequential+manner+and+can+be+visualized+in+living+animals+by+monitoring+IL-1beta+promoter+activation.">Neutrophil priming occurs in a sequential manner and can be visualized in living animals by monitoring IL-1beta promoter activation.</a> J. Immunol. 194 (3), 1211-1224 (2015).</li><li>Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+simple,+and+humane+method+for+submandibular+bleeding+of+mice+using+a+lancet.">A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet.</a> Lab Anim. (NY). 34 (9), 39-43 (2005).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice).">Retro-orbital injections in mice).</a> Lab. Anim. (NY). 40 (5), 155-160 (2011).</li><li>Fotos, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+time-lapse+microscopy+and+high-resolution+tracking+of+cell+migration).">Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration).</a> Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).</li><li>Mizumoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+novel+immunostimulants+by+dendritic-cell-based+functional+screening.">Discovery of novel immunostimulants by dendritic-cell-based functional screening.</a> Blood. 106 (9), 3082-3089 (2005).</li><li>Cassatella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-derived+proteins:+selling+cytokines+by+the+pound.">Neutrophil-derived proteins: selling cytokines by the pound.</a> Adv. Immunol. 73, 369-509 (1999).</li><li>Grahames, C. B., Michel, A. D., Chessell, I. P., Humphrey, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+characterization+of+ATP-+and+LPS-induced+IL-1beta+release+in+human+monocytes.">Pharmacological characterization of ATP- and LPS-induced IL-1beta release in human monocytes.</a> Br. J. Pharmacol. 127 (8), 1915-1921 (1999).</li><li>Levin, M., Leibrecht, H., Ryan, J., Van Dolah, F., De Guise, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+effects+of+domoic+acid+differ+between+in+vivo+and+in+vitro+exposure+in+mice.">Immunomodulatory effects of domoic acid differ between in vivo and in vitro exposure in mice.</a> Mar. Drugs. 6 (4), 636-659 (2008).</li><li>Basu, S., Hodgson, G., Katz, M., Dunn, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+role+of+G-CSF+in+the+production,+survival,+and+release+of+neutrophils+from+bone+marrow+into+circulation.">Evaluation of role of G-CSF in the production, survival, and release of neutrophils from bone marrow into circulation.</a> Blood. 100 (3), 854-861 (2002).</li><li>Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focus-drift+correction+in+time-lapse+confocal+imaging.">Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1048, 321-330 (2005).</li><li>Zucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+assessment+of+confocal+microscopy+slide-based+systems:+instability.">Quality assessment of confocal microscopy slide-based systems: instability.</a> Cytometry A. 69 (7), 677-690 (2006).</li><li>Hogan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focusing+on+the+experiment.">Focusing on the experiment.</a> Biophotonics. Int. 13, 48-51 (2006).</li><li>Kabashima, K., Egawa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+multiphoton+imaging+of+cutaneous+immune+responses.">Intravital multiphoton imaging of cutaneous immune responses.</a> J. Invest. Dermatol. 134 (11), 2680-2684 (2014).</li><li>Egawa, G., Natsuaki, Y., Miyachi, Y., Kabashima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+epidermal+keratinocytes+and+dermal+vasculatures+using+two-photon+microscopy.">Three-dimensional imaging of epidermal keratinocytes and dermal vasculatures using two-photon microscopy.</a> J. Dermatol. Sci. 70 (2), 143-145 (2013).</li><li>Kedrin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+metastatic+behavior+through+a+mammary+imaging+window.">Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window.</a> Nat. Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+2-photon+imaging+of+blood+flow+in+the+neocortex+through+a+cranial+window.">A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy.">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nat. Protoc. 8 (3), 583-594 (2013).</li><li>Looney, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung.">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nat. Methods. 8 (1), 91-96 (2011).</li></ol>

The authors have no financial conflicts of interest.

Bu çalışmanın amacı, henüz mevcut tekniklerle yerine olmamıştır yaşayan hayvanların, nötrofil astarlama işlemi izlenmesi için bir teknoloji geliştirmektir. Bu amaca ulaşmak için, üç kurulan yöntemler gerçekleştirilir: deri iltihabı 1) İndüksiyon, IL-1β promotör-tahrikli DsRed raportör farelerde astarlama bir ölçüsü, flüoresan-konjuge anti-Ly6G düşük doz nötrofillerin 2) in vivo olarak etiketleme mAb, ve 3) intravital konfokal mikroskopi görüntüleme. Bu üç yöntemin komb...

Nötrofiller dolaşımda en bol ve kısa ömürlü lökositler bulunmaktadır. Onlar hızla de antimikrobiyal peptidler ve proteazlar 1 içeren granüller ile birlikte reaktif oksijen ve nitrojen ara serbest bırakılması yoluyla profesyonel fagositler hizmet enfeksiyon veya yaralanma sitelerine işe alınırlar. Onların işe sırasında, nötrofiller inflamasyon 2 bir yerinde girişte belirgin gelişmiş fagosit işlevselliği ile sonuçlanan mikrobiyal ürünler, chemoattractants ve inflamatuar sitokinler dahil olmak üzere çeşitli ajanlar tarafından &quot;prime&quot; vardır. Nötrofil hazırlığını mekanizmaları yoğun vitro 3,4 çalışılmıştır; Bununla birlikte, in vivo koşullarında işlemin dinamik kontrolü tarihi mümkün olmamıştır. Son zamanlarda, intravital görüntüleme görselleştirilmesi ve canlı organizmalarda biyolojik süreçlerin hücresel dinamiklerini miktarının belirlenmesi için önemli bir teknik haline gelmiştir. Intravital görüntüleme geleneksel tek foton uyarma mikroskobu ile (örneğin, konfokal) gerçekleştirilen veya multiphoton mikroskopi 5 yaklaşımlar olabilir. Zamanla, önemli gelişmeler artan görüntü çözünürlüğü, gelişmiş görüntüleme derinliği sağlayan bu teknikle elde edilmiştir, doku fotohasar ve gelişmiş görüntü sabitleme 6,7 azalmıştır. Zamanla hücresel göç ve etkileşim dinamik görselleştirme etkinleştirmek için eşsiz yeteneği göz önüne alındığında, intravital mikroskopi yoğun immünoloji 8 çalışmanın çeşitli alanlarda uygulanmıştır. Intravital görüntüleme daha iyi anlamak ve hayvan modelleri yaşayan hem hücresel ve moleküler düzeyde bağışıklık yanıtlarını contextualize İmmünologlar sağlar. Son transgenik gelişmeler de knock-in muhabiri fare gibi yaşayan hayvanlarda nötrofil dinamik davranışları izlemek için yararlı araçlar sağlamıştır. Lizozim M organizatörü odaklı gelişmiş yeşil floresan protein knock-infarenin genel ekstravazasyonu, bakteriyel enfeksiyon ve steril bir iltihap 9-15 de dahil olmak üzere çeşitli enflamatuvar süreçlerde nötrofiller, monositler ve makrofajlar hareketliliğini karakterize etmek için kullanılmaktadır. Bundan başka, bir sitoplazmik flüoresan rezonans enerji transferi biyosensör ifade eden transgenik fareler, iltihaplı bağırsak 16 içinde nötrofil hücre dışı düzenlenmiş bir mitojen kinaz ve protein kinaz A aktivitelerini inceleyerek içinde kullanılmaktadır. Nötrofillerde floresans ifadesi için yüksek bir özgüllüğü olan bir fare modeli kendisi lenfosit antijen 6G (Ly6G) 17 sentezlenmesi kuple edilir floresan protein tdTomato, hem de Cre rekombinazı üreten Catchup knock-in fare,. Bu modelde aracılığıyla Ly6G eksikliği nötrofil Görselleştirme bu hücrelerin steril ya da bulaşıcı in vivo enflamatuar bağlamlarda çeşitli normal işlevlerini uygulamak olduğunu göstermiştir. DsRed flüoresan s ifade eden transjenik fareninnötrofiller, iltihabik monositler ve aktive makrofajlar içerdiğine inanılmaktadır - - (IL-1β) promoteri (pIL1-DsRed), IL-1β üreten hücrelerin hareketsiz davranışları görselleştirmek için kullanılmıştır interleuikin-1 p fare kontrolü altında genin rotein çıkan iltihaplı cilt 18. İn vivo markalama iltihaplı dokuların nötrofil hücresel ve moleküler davranışları izlemek için alternatif bir yaklaşım olarak görev yapabilir. Anti-Gr-1 monoklonal antikoru (mAb) floresan etiketli düşük dozlarda intravenöz enjeksiyon, Gr-1 + nötrofillerin ilerlemesini kaskad sonra Staphylococcus aureus 19 ile enfekte edilmiş farenin deri lezyonlarında görselleştirilmiştir. Streptavidin içeren konjugatlarının in vivo uygulama konjuge 705 nm kuantum noktaları ve biyotinile anti-Ly6G mAb özellikle dolaşan nötrofillerin 20 etiket. neutroph bu tür konjugatların Ayrıca, endositozIL veziküller interstisyuma göç nötrofillerde yüksek hızlı vezikül taşıma izleme sağlar. in vivo P-selektin karşı floresans-konjuge antikor Branşman integrin ligand-1 (PSGL-1), L-selektin (CD62L) glikoproteini ile markalama (CD11b bir TNFa kaynaklı inflamatuar modelinde) ve kemokin (CXC motifi) reseptör 2 (CXCR2) erken inflamasyon 21 döneminde oynayan düzenleyici mekanizmalar açığa çıkartılmıştır. Polarize nötrofiller CD11b ve CXCR2, nötrofil göçünü sürücü ve inflamasyonu başlatan reseptörlerinin dağıtılması sonuçlanan aktive trombositler üzerinde CD62L mevcut ile etkileşim uropods PSGL-1-zenginleştirilmiş çıkıntı. IL-1β hazırlanmış nötrofillerin 22 yükselir imza genlerin biridir. PIL1-DsRed muhabiri farelerde, DsRed floresan sinyalleri (yani., IL-1β promotörünün aktivasyonu) olumlu mRNA ifadesi ve IL-1β protein üretimi, IL-1β ile bağlantılıdır. &lt;sup&gt; 18 nötrofil astarlama işlemi izlemek için, intravital mikroskopik bir yöntemi floresans konjuge edilmiş anti-Ly6G mAb ile nötrofillerin in vivo etiketlemeden sonra pIL1-DsRed fare modelinde oksazolon (OX) deri iltihabı indüksiyonu dahil geliştirilmiştir. Bu model ile, çeşitli hastalıkların ve rahatsızlıkların hayvan modellerinde astar nötrofillerin davranış ve işlevini incelemek mümkündür.

<table><tbody><tr><td>Heparin sodium</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>NDC 63323-540-31</td><td></td></tr><tr><td>ACK lysing buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4391</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine hydrochloride</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>LLOYD Laboratory</td><td>NADA #139-236</td><td></td></tr><tr><td>Acepromazine</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>ANADA 200-361</td><td></td></tr><tr><td>Hair-removal cream</td><td>Church &amp;amp; Dwight</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A16P4</td><td></td></tr><tr><td>Oxazolone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0753</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody</td><td>BioLegend</td><td>127610</td><td></td></tr><tr><td>U-100 insulin syringe with 28 G needle</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>FITC-CM-Dextran, 150 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74817</td><td></td></tr><tr><td>Butterfly infusion set (27 G needle)</td><td>BD</td><td>387312</td><td></td></tr><tr><td>FACSCalibur cytometer</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellQuest Pro software</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph Software</td><td>Universal Imaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

intravital imaging of neutrophil priming using il-1&#946; promoter-driven dsred reporter mice

Nötrofiller, insan kan dolaşımında en bol lökositlerdir ve hızlı bir şekilde enflamatuar sitelere alınırlar. Astar nötrofillerin fagositik işlevselliğini artıran önemli bir olaydır. Kapsamlı çalışmalar, H. pylori ve yaralanma içinde mevcut ve nötrofil priming önemini meydana gelmiş olsa da, yok olmuştur, in vivo olarak bu işlemi görselleştirme anlamına gelir. Floresan-konjuge anti-limfosit antijen enjeksiyonu ile elde 2 -) &#39;de in vivo nötrofil etiketleme emişli bir ölçüsü olarak kullanılır - 1) DsRed reporter sinyalini: Resim protokolü üç yöntemleri birleştirerek yaşayan hayvanlarda priming nötrofil dinamik işlem izlenmesini sağlar 6G (Ly6G) monoklonal antikoru (mAb) ve 3) intravital konfokal görüntüleme. Birkaç kritik adımlar bu protokol katılmaktadırlar: oksazolon kaynaklı fare kulak deri iltihabı, hayvanların uygun sedasyon, anti-Ly6G mAb&#39;nin tekrarlanan enjeksiyonları ve prevgörüntüleme sırasında odak kayması ention. Bir kaç sınırlamalar gibi bir fare sürekli görüntüleme süresi (~ 8 saat) sınırı ve floresein izotiosiyanat-dekstran inflamatuar durumda kan damarlarından sızıntısı olarak, gözlenmemiş olmasına karşın, bu protokolü intravital görüntüleme için temel bir çerçeve sağlar kolayca fare inflamasyon modellerinde diğer bağışıklık hücrelerinin incelenmesi genişletilebilir prime nötrofil davranış ve işlev.

pIL1-DsRed farelerin tarama akış sitometrisi kullanılarak periferal kan lökositleri tarafından üretilen fenotipik DsRed floresan sinyali göre gerçekleştirilir. LPS uyarımı nötrofiller, monositler ve dendritik hücreler de dahil olmak üzere 26-28 miyeloid hücrelerinde IL-1β üretimini indüklediği bilinmektedir. Bu durumda, izole edilmiş bir lökosit akış sitometri analizine önce 4 saat LPS ile inkübe edilir. Daha sonra, yolluk bu kapı popülasyonda ölç?...

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1Î² Promoter-driven DsRed Reporter Mice at JoVE.com

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

IL-1β Promoter odaklı DsRed Muhabir Fare kullanma Nötrofil Hazırlama intravital Görüntüleme

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

intravital-imaging-neutrophil-priming-using-il-1-promoter-driven

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.5K Görüntüleme.  University of Toledo College of Medicine and Life Sciences. This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals. 

Video: Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1β Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Lökosit Homing Göç ve non-invaziv Görüntüleme In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

Takip Nötrofil Lumen Crawling, intravital video Mikroskopi Doku transendoteliyal Göç ve Kemotaksis

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Real Time Anestetize Farelerde Intravital Mikroskopi Mezenterik Damarlardaki nötrofiller ve monositler Görüntüleme

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Iltihaplı Dermisinde içinde görüntüleme CD4 + T hücre Geçiş Göç

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new transgenic reporter mouse model. We chose to visualize interleukin (IL) 22 gene expression because this cytokine has important activities in the intestine, where it contributes to repair tissues damaged by inflammation. Reporter systems offer considerable advantages over other methods of identifying products in vivo. In the case of IL-22, other studies had first isolated cells from tissues and then re-stimulated the cells in vitro. IL-22, which is normally secreted, was trapped inside cells using a drug, and intracellular staining was used to visualize it. This method identifies cells capable of producing IL-22, but it does not determine whether they were doing so in vivo. The reporter design includes inserting a gene for a fluorescent protein (tdTomato) into the IL-22 gene in such a way that the fluorescent protein cannot be secreted and therefore remains trapped inside the producing cells in vivo. Fluorescent producers can then be visualized in tissue sections or by ex vivo analysis through flow cytometry. The actual construction process for the reporter included recombineering a bacterial artificial chromosome that contained the IL-22 gene. This engineered chromosome was then introduced into the mouse genome. Homeostatic IL-22 reporter expression was observed in different mouse tissues, including the spleen, thymus, lymph nodes, Peyer&#39;s patch, and intestine, by flow cytometry analysis. Colitis was induced by T-cell (CD4+CD45RBhigh) transfer, and reporter expression was visualized. Positive T cells were first present in the mesenteric lymph nodes, and then they accumulated inside the lamina propria of the distal small intestine and colon tissues. The strategy using BACs gave good-fidelity reporter expression compared to IL-22 expression, and it is simpler than knock-in procedures.

We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.

Raportör fareler kullanılarak IL-22 eksprese eden lenfositlerin Görselleştirme

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

Bir IL-8 Geçici Transgenize Edilmiş Fare Modeli<emIn vivo</em&gt; İnflamatuvar Yanıtların Uzun Vadeli İzlenmesi

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The current protocol represents a practical and reproducible method to visualize the leukocyte endothelium interaction leading to leukocyte recruitment in skeletal muscle derived tissue within the intact organism of the mouse. The model is applicable to all fields of research that focus on granulocyte activation and their role in disease.
We provide a step by step protocol to guide through the method and to highlight potential pitfalls and technical difficulties. The protocol covers the following aspects: experimental settings and required material, anesthesia of the mouse, dissection of the cremaster muscle as well as tracheal and carotid cannulation, IVM recordings and offline analysis. Data formats like adherent leukocytes, rolling flux (RF) and rolling flux fraction (RFF) are explained in detail and appropriate applications are discussed. Representative results from dystrophin deficient mdx mice are provided in the results section.
IVM is a powerful tool to assess leukocyte recruitment in an in vivo setting; however, delineating for example endothelial and leukocyte function may require a combination with ex vivo setups like flow chamber experiments. Furthermore, the genetic background of animals of interest may greatly influence baseline recruitment, requiring individual fine tuning of the protocol provided. Despite its limitations, IVM may serve as a platform to readily translate in vitro findings into a living vertebrate organism.

Here, we show how to perform intravital microscopy on post-capillary venules of the mouse cremaster muscle. Commonly applied to different models of inflammation and sepsis, particularly those induced by chemokines and cytokines, we highlight its relevance in the study of muscolopathies involving exaggerated muscular leukocyte infiltration.

İntravital Mikroskopi Ile Değerlendirilen Farelerde Cremaster Kasın Lökosit İnfiltrasyonu

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The ...

Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. Although studying these cells in isolation in vitro or together ex vivo provides useful physiological information; salient features of neural cell physiology will be missed in such contexts. Therefore, there is a need for studying neural cells in their native in vivo environment. The protocol detailed here describes repetitive in vivo two-photon imaging of neural cells in the rodent cortex as a tool to visualize and study specific cells over extended periods of time from hours to months. We describe in detail the use of the grossly stable brain vasculature as a coarse map or fluorescently labeled dendrites as a fine map of select brain regions of interest. Using these maps as a visual key, we show how neural cells can be precisely relocated for subsequent repetitive in vivo imaging. Using examples of in vivo imaging of fluorescently-labeled microglia, neurons, and NG2+ cells, this protocol demonstrates the ability of this technique to allow repetitive visualization of cellular dynamics in the same brain location over extended time periods, that can further aid in understanding the structural and functional responses of these cells in normal physiology or following pathological insults. Where necessary, this approach can be coupled to functional imaging of neural cells, e.g., with calcium imaging. This approach is especially a powerful technique to visualize the physical interaction between different cell types of the CNS in vivo when genetic mouse models or specific dyes with distinct fluorescent tags to label the cells of interest are available.

This protocol describes a chronic cranial window implantation technique that can be used for longitudinal imaging of neuro-glio-vascular structures, interactions, and function in both healthy and diseased conditions. It serves as a complementary alternative to the transcranial imaging approach that, while often preferred, possesses some critical limitations.

Farelerde Nöro-İmmün Dinamiğin Vivo Görüntülemesinde Tekrarlayan Performans için Hassas Beyin Haritalaması

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...

Imaging Neutrophil Migration in the Mouse Skin to Investigate Subcellular Membrane Remodeling Under Physiological Conditions

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first immune cells to reach the site of inflammation and to participate in the innate immune response during infection or tissue damage. So far, neutrophil migration has been successfully visualized using various in vitro experimental systems based on uniform stimulation, or confined migration under agarose, or micro-fluidic channels. However, these models do not recapitulate the complex microenvironment that neutrophils encounter in vivo. The development of multiphoton microscopy (MPM)-based techniques, such as intravital subcellular microscopy (ISMic), offer a unique tool to visualize and investigate neutrophil dynamics at subcellular resolutions under physiological conditions. In particular, the ear of a live anesthetized mouse provides an experimental advantage to follow neutrophil interstitial migration in real-time due to its ease of accessibility and lack of surgical exposure. ISMic provides the optical resolution, speed, and depth of acquisition necessary to track both cellular and, more importantly, subcellular processes in 3D over time (4D). Moreover, multi-modal imaging of the interstitial microenvironment (i.e., blood vessels, resident cells, extracellular matrix) can be readily accomplished using a combination of transgenic mice expressing select fluorescent markers, exogenous labeling via fluorescent probes, tissue intrinsic fluorescence, and second/third harmonic generated signals. This protocol describes 1) the preparation of neutrophils for adoptive transfer into the mouse ear, 2) different settings for optimal sub-cellular imaging, 3) strategies to minimize motion artifacts while maintaining a physiological response, 4) examples of membrane remodeling observed in neutrophils using ISMic, and 5) a workflow for the quantitative analysis of membrane remodeling in migrating neutrophils in vivo.

Neutrophil migration relies on the rapid and continuous remodeling of the plasma membrane in response to chemoattractant and its interactions with the extracellular microenvironment. Described herein is a procedure based on Intravital Subcellular Microscopy to investigate the dynamic of membrane remodeling in neutrophils injected in the ear of anesthetized mice.

Fizyolojik Koşullar Altında Hücre Altı Membran Yeniden Şekillenmesini Araştırmak için Fare Derisinde Nötrofil Migrasyonunun Görüntülenmesi

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first ...

Biyoloji

Monitoring Neutrophil Recruitment Dynamics and Bacterial Burden at the Infection Site in a Murine Model

Source: Anderson, L. S., et al. <a href="https://app.jove.com/v/59015">A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates in vivo imaging to study the neutrophil recruitment dynamics at an infection site in an immunocompromised, transgenic mouse with GFP-expressing neutrophils. It involves injecting luminescent bacteria to cause an infection. This leads to neutrophil recruitment to the infection site, whose tracking is done by imaging.

IL-1β Promoter odaklı DsRed Muhabir Fare kullanma Nötrofil Hazırlama intravital Görüntüleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Lökosit Homing Göç ve non-invaziv Görüntüleme In vivo