Bu yöntem, normal nötrofillerin in vivo ve in vitro göçünü değerlendirmek için sık kullanılan üç yöntemin yanı sıra fare artriti modelinde patolojik nötrofillerin infiltrasyonlarını tanımlamaya çalışır. Bu yöntemin bu alandaki diğer araştırmacılar için yararlı olabileceğini düşünüyoruz. Bu protokol, hava kese sabunu ve adjuvan kaynaklı artrit kullanarak inflamasyon bölgelerinde nötrofillerin göç kapasitesini değerlendirmek için metodolojik ayrıntıları içerir.
Bu tekniğin etkileri tedavi grubu ile model grubu karşılaştırarak artrit tedavisi doğru uzanır. Bu yöntem inflamatuar hastalık içine fikir sağlayabilir ve inflamatuar barsak hastalığı uygulanabilir. Prosedürü gösteren Qingyi Lu ve Haixu Jiang, laboratuarımızdan lisansüstü öğrenciler olacak.
Sıfır gününde farelerin anestezisi sonrasında, beş mililitrelik şırıngaya bağlı 0,22 mikron filtre kullanarak üç mililitrelik steril hava elde edin. Cımbızla anestezili farenin arka derisini kaldırın ve sterilize havanın üç mililitresini enjekte etmek için 26 ölçülü 3/8 inç iğne kullanın. Tedaviden sonra, fareleri solunum ünitesinden çıkarın ve iyi ayarlanmış bir kafese yerleştirin.
Hareket etmeye başlayana kadar hayatta olduğundan emin olmak için fareleri izleyin. Üçüncü gün, hava kesesini sürdürmek için önceden kurulmuş hava cebine üç mililitre daha sterilize edilmiş hava enjekte edin. Altıncı günde, hava kesesine farklı tedaviler enjekte edin.
Negatif kontrol olarak bir mililitre PBS enjekte edin ve yerel inflamasyonu tetiklemek için pozitif kontrol olarak mililitre başına bir mililitre mililitre LPS enjekte edin. Altı saat sonra fareleri kurban edin. Her hava kesesi için, hava kesesini yıkamak için bir mililitre yıkama tamponu enjekte edin ve 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde inflamatuar eksüdayı toplayın.
Sonra iki kez yıkama tampon iki mililitre ile hava keseyı yıkayın ve aynı santrifüj tüpünde inflamatuar eksüda toplamak. Oda sıcaklığında 10 dakika 100 kez g santrifüj. Supernatant atın ve yıkama tampon bir mililitre hücreleri resuspend.
Otomatik hematoloji analizörü kullanarak nötrofil oranını ölçmek için hücreleri sayın. Freund'un adjuvanını en az beş saniye girdap yaparak askıya alın, sonra 100 mikrolitre süspansiyonu bir insülin enjektöre çekin. Anesteziden sonra, seçilen pençeyi işaretleyin ve enjektörden freund'un adjuvanının 20 mikrolitresini bilek eklem boşluğundaki dört periartiküler noktalara enjekte edin.
İşlenmiş fareleri yeni odaya koyun. Hareket etme yeteneğini yeniden kazanana kadar nefes aldıklarından emin olmak için fareleri izleyin. Her üç günde bir, ayak bileği eklem çapını ölçmek için bir cep kalınlığı göstergesi kullanın.
Ayrıca, artrit puanlama kriteri ile artrit şiddetini değerlendirmek. Sıfır normal. Eritem ve şişlik belirtisi yok.
Biri en hafif artrit. Eritem ve hafif şişlik tarsals veya ayak bileği eklemi sınırlı. İki orta artrit olduğunu.
Eritem ve ayak bileğinden tarsallara kadar uzanan hafif şişlik. Üç şiddetli artrit olduğunu. Ayak bileğinden metatarsal eklemlere kadar uzanan eritem ve orta derecede şişlik.
Dört en şiddetli artrit olduğunu. Eritem ve şiddetli şişlik ayak bileği, ayak ve basamak, ya da ekstremite ankiloz kapsar. Fareyi feda ettikten sonra, cımbız ve makas ile arka bacak deri ve kas parçası çıkarın.
Sprey% 70 etanol ile eklem ve bir kağıt havlu kullanarak kasların geri kalanı çıkarın. Oda sıcaklığında iki gün boyunca% 4 paraformaldehit ayak bileği eklemi düzeltin. Daha sonra oda sıcaklığında bir ay boyunca %10 EDTA'da derzi dekalsitedin ve orta haftalık değiştirin.
Bir ay sonra, yaklaşık 60 santigrat derece likit parafin belirli hacmi ile belirgin bir kalıp içinde doku gömmek için doku yerleştirin. Kısaca soğutun. Mikrotomun kalınlığını dört mikrometreye ayarlayın ve dilimleri kesin.
Daha sonra bölümleri genişletmek için kısa bir süre için 43 derece santigrat su banyosunda bölümleri yüzer. Bölümleri slaytlara monte edin ve slaytları iki saat boyunca 70 derecede fırına koyun. İleride kullanmak için, eksi 20 santigrat derece slaytlar koruyun.
Daha sonra, bir rafa slaytlar yerleştirin ve oda sıcaklığında rehydrate için el yazmasına göre ksilen ve etanol yıkıntılar gerçekleştirin. Son olarak, üç dakika boyunca akan musluk suyu yıkayın. Sonra beş dakika boyunca% 0.1 hızlı yeşil çözelti leke.
10 saniye boyunca %1 asetik asit ile durulayın ve %0.1 Safranin O boyama çözeltisinde 20 dakika boylayın. Bundan sonra, yazıya göre ksilen ve etanol yıkama çözeltilerine slaytlar batırın. Doku bölümlerini nesne aşamasına monte edin ve mikroskop altındaki dokuları gözlemleyin.
Nötrofiller görselleştirmek için, ilk 78 santigrat derece parafin bölümleri iki saat pişirerek immünohistokimyasal boyama gerçekleştirin. Slaytları bir rafa yerleştirin ve oda sıcaklığında rehidratasyon için el yazmasına göre ksilen, etanol, su ve PBS yıkar gerçekleştirin. Sonra doku kapsayacak şekilde permeabilization tampon bir damla ekleyin.
Bölümleri nem kontrollü tepside 37 derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, PBS üç dakika üç kez slaytlar durulayın. Dokuyu doğrudan durulamaktan kaçının.
Daha sonra, ısı kaynaklı antijen epitop alma gerçekleştirin. Slaytları bir rafta düzenleyin. Slaytları alma arabelleğiyle dolu basınç kazanına batırın.
Mikrodalga fırına basınç kazanı koyun ve mikrodalga fırın ayarlayın 600 watt ve 10 dakika boyunca slaytlar ısı. Kaynadıktan sonra, 90 santigrat dereceye soğuması için kazanda slaytlar tutun. Slaytları çıkar ve PBS'de üç kez üç kez durulayın.
Endojen peroksidaz aktivitesini gidermek için, slaytları oda sıcaklığında 15 dakika boyunca yeni hazırlanmış %3 hidrojen peroksite batırın. PBS'deki slaytları üç dakika üç kez durulayın. Hidrofobik kalemle numunenin etrafında büyük bir daire çizin.
Örneğe dokunmaktan kaçının. Numuneye 50 ila 100 mikrolitre %3 büyükbaş serum albumini ekleyin ve numuneleri 60 dakika boyunca 37 derece lik nem kontrollü bir hazne yerleştirin. Ardından engelleme çözümlerini kaldırın.
Her bölüme 50 mikrolitre PBS seyreltilmiş primer antikor ekleyin. Bir gecede dört santigrat derece bir nem kontrollü tepside slaytlar kuluçka. İkinci gün, tepsi yi çıkarın ve oda sıcaklığında 30 dakika bekletin.
Daha sonra PBS'deki slaytları üç kez üç kez durulayın. Dokulara 50 mikrolitre PBS seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin. 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede nem kontrollü tepside slaytlar inkübed.
Daha sonra PBS'deki slaytları üç kez üç kez durulayın. Beş dakika seyreltilmiş DAB çözeltisi geliştirin. DAB aşırı tepki nedeniyle koyu renk gelişimini önlemek.
Damıtılmış suda slaytları durulayın. 10 saniye boyunca hematoksilin slaytlar karşı leke ve beş dakika musluk suyunda slaytlar durulayın. Üç saniye boyunca asit alkol süper hızlı diferansiyasyon çözeltisi durulayın, sonra 10 dakika musluk suyunda durulayın.
Etanol ve ksilen el yazmasına göre oda sıcaklığında yıkar slaytlar batırın. Montaj çözeltisi ile coverslip'i düzeltin. Bir mikroskop altında doku gözlemleyin.
Bu çalışmada, lps in vivo tarafından uyarılan nötrofil alımını araştırmak için hava kese deneyleri yapılmıştır. Hava keseuçekuçlarında bulunan lökosit alt kümeleri kontrolden çok daha yüksekti. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, adjuvan indüklenen artrit grubu pençeönemli ödem gösterdi.
Ayak bileği eklem çapı arttı ve artrit skoru sürekli yükseldi. Kıkırdak hasarı romatoid artritin temsili sendromudur. CFA mücadelesi büyük miktarda lökosit infiltrasyonu, önemli kıkırdak erozyonu ve sinovyal hiperplaziye neden oldu.
Herhangi bir ekspresyon düzeyinde MPO, eklem bölümünde önemli ölçüde güncellenen nötrofil infiltrasyonunun temsili belirteçleridir. Havanın cilde enjekte edildiğinden emin olun, ama kas içine değil. Ayrıca anti-p84 ile ayak bileği eklem dokusu bölümlerinin immünohistokimyasal boyama ile nötrofil ekstrasellüler tuzakların oluşumunu araştırabilir veya Bu yöntemler inflamatuar barsak hastalığı gibi diğer inflamatuar hastalıkları incelemek için kullanılabilir.
