Drosophila görüntü şekil 3 c ve video el yazması için Darren Obbard teşekkür ederim; J. Marie Hardwick, Wade Gibson ve Heather M. kuzu bu el yazması değerli tartışılması için. Bu eser bir efendim Edward Youde Memorial Bursu (H.L.T. tarafından), Dr. Walter Szeto'yu Memorial Bursu (H.L.T.), desteklenen Fulbright hibe yaşam Bilim Araştırma Vakfı Bursu (H.L.T.) ve ncı K22 CA204458 (H.L.T.) 007-2009 (H.L.T.), verin. Ho Tang Lam bir Shurl ve Yaşam Bilimleri Araştırma Vakfı (2014-2017) Kay Curci Vakfı üyesi oldu.

1) CaspaseTracker Biyoalgılayıcı hazırlanması uçar
<ol><li>CO2sinekli anestezi ve sinek yiyecek ve taze Maya yapıştır ile aynı şişe içinde 7 ila 10 caspase duyarlı Gal4 (DQVD)19 bakire kadın ve 7 10 G-izleme53 Gal4 muhabir genç erkek sinek (veya tersi) aktarmak için bir fırça kullanın. Not: Çapraz Caspase duyarlı (DQVD) Gal4 ve G-izleme Sineklerin Tanrısı CaspaseTracker döl sinekler üretecek. Caspase - duyarlı (DQVA)'19 Gal4 çapraz ve G-izleme sinekler (konuya bakın) negatif kontrol uçar sağlayacaktır. Taze Maya Yapıştır o döl sayısı artar bu yüzden yumurta üretimi, geliştirmek için protein kaynağı olarak hizmet vermektedir. Bakire kadın ve genç erkek sinek onların fenotipleri54göre seçin.</li>
	<li>Sinekler, 18 santigrat derece (oC) sırasında çapraz için 3-7 gün kuluçkaya ve sonra yeni bir çapraz 18 ° C'de ayarlamak için yeni bir şişe için sinekler aktarın Döl eclose uçar kadar 18 ° C'de orijinal şişe kuluçkaya devam'i tıklatın. Not: Üst sinek özgün flakon, döl, aşırı kalabalık önlemek için yeni şişeleri aktarın. Üst sinek döl taze yiyecek ve Maya salçası ilk 2-3 anahtarları oluşturabilir ve sonra verimliliği önemli ölçüde zamanla azalacak. Sinekler yükselterek 18 ° C CaspaseTracker Biyoalgılayıcı non-spesifik sinyal azaltabilir (konuya bakın).</li>
	<li>Seçme döl ile doğru fenotipleri54 aşağıdaki deneyler için uçar. Not: Burada transgenes caspase duyarlı Gal4 ve G-izleme CyO dengeleyici ile dengeli ikinci kromozom bulunur. Her iki transgenes caspase duyarlı Gal4 ve G-izleme olan kıvırcık kanat döl (olmadan CyO) seçin.</li>
</ol>2) uygulama geçici hücre ölüm indüksiyon CaspaseTracker Biyoalgılayıcı uçar
<ol><li>10 eclosed erkek taze uçmak gıda ve taze Maya yapıştır ile yeni bir şişe için 1 gün için 18 ° C'de yumurta odası üretimi oogenesis tarafından izin vermek için uçar-20 yeni transfer. Not: Dişi erkek sinek ile tutmak yumurta odası üretimini artırmak.</li>
	<li>Soğuk şok Apoptosis geçmesi yumurta Chambers'ı ikna etmek için dişi sinekler sonra-7 ° C için 1 h yerleştirilmiş olması yeni boş şişe aktarın. Not: soğuk şok kişi yaralandı hücreler plazma zarı yırtılması55,56inducing tarafından.</li>
	<li>Apoptozis protein açlık tarafından geçmesi yumurta Chambers'ı ikna etmek için dişi sinekler 18 ° C'de % 8 sukroz ve %1 agar gıda ile yeni bir şişe 3 gün boyunca aktarın. Not: Protein açlık (protein olmayan gıda) yumurta chambers apoptosis57,58,59 ve autophagy60,61geçmesi tetikleyebilir. Sinekler sinek gıda Sükroz en iyi durumu tutmak için her gün % 8 sukroz ve %1 agar gıda ile yeni bir şişe geçin.</li>
	<li>Stresli sinekler geri yeni bir şişe taze uçmak gıda ve taze Maya yapıştır ile onları kurtarmak izin vermek için 18 ° c 3 gündür aktarın. Aç ve yumurtalıkların yumurta odalarından açıklanan62elde etmek için açlıktan kurtarılan sinekler incelemek. Not: Kopyalayabilmek Drosophila yumurtalık elde etmek için sinekler CO2, anestezi ve forseps 2 Çift sinek baş kaldırmak için kullanın ve forseps Bankası yumurtalık "Sineklerin Tanrısı" kaldırmak için karın çekmek için kullanın.</li>
</ol>3) fiksasyon ve disseke yumurta odalarının görüntüleme için boyama
<ol><li>0.5 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) çevresinde disseke yumurta chambers ile birlikte 1 mL santrifüj tüpleri için transfer. Yumurta yerleşmek izin verir. Not: Plastik pipet ipuçları %1 sığır serum su veya yumurta odaları ipuçları plastik yüzeyde sopa önlemek için PBS çözünmüş albumin (BSA) ile kat. Karanlıkta photobleaching kırmızı floresan protein (RFP, DsRed olarak da bilinir) önlemek için aşağıdaki yordamları gerçekleştirin ve yeşil flüoresan protein (GFP) yumurta odalarında.</li>
	<li>Pipetting tarafından PBS kaldırın ve sonra 0.5 mL % 4 paraformaldehyde 20-30 dk için karanlık oda sıcaklığında yumurta chambers düzeltmek için PBS içinde geçerlidir. Not: Bu ve aşağıdaki kuluçka adımları nazik döndürme uygulama.</li>
	<li>Pipetting tarafından paraformaldehyde kaldırın ve sonra yumurta odası 0.5 mL PBST ile yıkanmış (PBS + %0,1 Triton X-100) için 3 kere. Not: Uzun süreli fiksasyon RFP ve GFP sinyalleri azaltmak olabilir.</li>
	<li>PBST ile yumurta salonları, oda sıcaklığında 1-2 h için kuluçkaya veya bir yumurta Chambers'ı permeabilize için nazik döndürme ile 4 ° C'de gece. Not: PBST Ayrıca BSA sigara kaplı plastik yüzey sopa yumurta chambers kaçının.</li>
	<li>Pipetting tarafından PBST kaldırın ve daha sonra mavi nükleer Höchst boya PBST 10 μg/mL 0.5 mL yumurta salonları çekirdeği için leke için oda sıcaklığında 1-2 h için geçerli. NOTE1: Bu non-spesifik sinyal artacak gibi nükleer boya ile uzun süreli kuluçka kaçının. NOT2: Çekirdeği Höchst olmadan leke için alternatif yaklaşımdır 200 eklemek μL anti-beyazlatma DAPI montaj aracıyla (malzemeleri görmek) ve protokol 3.8 açıklandığı gibi cam kapak fişinde dokular Montaj önce gecede63, kuluçkaya. NOTE3: photobleaching önlemek için karanlıkta boyama ve aşağıdaki yordamları gerçekleştirin.</li>
	<li>Pipetting tarafından nükleer boya kaldırmak ve 0.5 mL için 10-20 dk kuluçka her yıkama adım arasında nazik rotasyon ile ile 3 kere 1 mL santrifüj tüpleri yumurta odasında yıkamayı PBST uygulayın.</li>
	<li>İyi pipet ile tüm PBST kaldırmak ve sonra uygulamak 200 μL anti-beyazlatma montaj ajan (tüp altına yumurta chambers lavabo kadar yumurta odaları 3 h için oda sıcaklığında veya gecede 4 ° C'de kuluçkaya için bkz: belgeleri). Not: tam montaj Ajan absorbe doku tüpün dibine lavabo.</li>
	<li>200 μL anti-beyazlatma ile aktarmadan tarafından lekeli yumurta chambers mount Ajan pipetting tarafından görüntüleme için önceden temizlenmiş cam slayt üzerindeki montaj yumurta Odaları bir 20 x 20 mm önceden temizlenmiş cam kapak notu ile kapak ve koyarak cam kaymak kapak fişinde mühür tırnak cilası kapak notu kenarında. NOTE1: Cam slayt ve kapak kayma su ya da % 70ini etanol ile önceden temiz. NOT2: Vazelin cam slayt ve yumurta chambers tarafından overcompression yok önlemek için kapak Not arasında geçerlidir.</li>
	<li>Floresan veya 20 x NA 0,8 kullanarak confocal mikroskop kullanarak yumurta chambers görüntü planı-Apochromat amacı, nükleer boyama için uyarma ışık dalga boyu 405 nm ile (emisyon ~ 461 nm algılama), 561 nm RFP (devam eden veya son caspase aktivite) sinyal () için emisyon ~ 590 nm algılama) ve 488 nm GFP (geçmiş caspase aktivite) sinyal için (emisyon tespit ~ 518nm). Not: Yayımlanmış protokolümüze mikroskobu20,64için bkz.</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

CaspaseTracker çift Biyoalgılayıcı bir roman ve son olarak algılanmasını sağlayan benzersiz araç veya devam eden caspase etkinliği ve hücre ölümü ters hücre izleme işlemek ve caspase etkinlik içinde vivoettikten sonra hayatta kalmak. Caspase aktivite geleneksel apoptosis damgasını kabul ederken, apoptotik sigara caspase etkinlik düzenleme nöronal aktivite79, , gibi çeşitli normal hücre fonksiyonları potansiyel rolleri oy...

Programlanmış hücre ölümü Apoptozis gibi çok hücreli organizmalar1,2,3, yaralı, istenmeyen veya tehlikeli hücrelerde ortadan kaldırarak embriyonik geliştirme ve normal homeostazı önemli bir rol oynar. Hücre ölüm ve yaşam arasında denge kaybı kanser, kalp yetmezliği, otoimmünite ve dejenerasyon4,5,6,7,8gibi ölümcül sonuçlara yol açabilir. Caspases geleneksel olarak "dönüş yok" apoptoz9,10,11, olarak kabul edilmiştir Cellat aktivasyonu hızlı ve büyük hücresel yıkım12tetikler, 13,14,15,16. Bu genel dogma zorlu, kültürlü ölmekte olan Primer hücre ve kanser hücrelerinin değil sadece caspase harekete geçirmek, ama aynı zamanda aşağıdaki önemli hücre sonra plazma zarı blebbing, hücre büzülme de dahil olmak üzere ölüm işaretlerinden kurtarabilirsiniz gösterdi, Mitokondrial parçalanma, mitokondrial sitokrom c yayın sitozol, nükleer ve Kromatin yoğunlaşma, DNA hasarı, nükleer parçalanma, içine hücre yüzey teshir edilmesi Fosfatidilserin (PS) ve apoptotik organları oluşumu 17 , 18 , 19 , 20 , 21. ölen hücreleri hücre ölüm uyaranlara17,18,19,20, kaldırdıktan sonra kurtarabilirsiniz olarak önerdiğimiz bu anastasis bir iç hücre kurtarma olgu olduğunu 21. dönem "Anastasis" (Αναστάσης)18"için Yunanca olarak hayata yükselen" anlamına gelir, icat bu beklenmedik hücre kurtarma fenomeni açıklamak. Anastasis bizim gözlem daha sonra Fosfatidilserin dışa22,23,24, mitokondrial sınırlı da kurtarma hücre ortaya son bağımsız çalışmalar tarafından desteklenen dış membran permeabilization25, karışık soy kinaz benzeri aktivasyon (MLKL) ve hücre büzülme26.
Anastasis düzenleyen mekanizmalar karakterize paradigma kayması fizyolojik, patolojik ve tedavi edici etkileri olacaktır. Anastasis kurtarmak ya da ventrikül sol ventrikül kaldırarak önemli postmitotic hücreleri ve değiştirmek zor olan doku ve muhtemelen kalp yetmezliği tersine çevirme için hesabı korumak için daha önce bilinmeyen cytoprotective mekanizma temsil edebilir aygıtlar (LVADs)27,28, kurtarma sonra aşırı ışık29,30,31geçici pozlama veya onarım nöronların photoreceptor hücrelerinin beyin yaralanması32sonra yardımcı. Öyleyse Anastasis teşvik hücre ve doku kurtarma geliştirmek. Diğer taraftan, anastasis kanser nüks17,18neden terapi, hücre ölüm neden hayatta kalmak için kanser hücreleri tarafından kullanılan bir beklenmeyen kaçış taktik olabilir. Bu nedenle, anastasis kanser hücrelerinin sırasında ölüyor ve kanser tedavisi yanında onların nüks önleme kanser tedavisi için yeni bir tedavi stratejisi olabilir sonra bastırmak.
Anastasis işlemi sırasında biz bulduk kurtarılan bazı hücreler kalıcı genetik değişiklikler satın aldı ve oncogenic dönüşüm uygulandı, DNA hasar nedeniyle büyük olasılıkla apoptosis18,20sırasında,21 tahakkuk . DNA zarar görmüş hücreleri ölüm sürecinin tersine tumorigenesis bir mekanizma olabilir, özofagus kronik termal yaralanma indüklenen gibi potansiyel olarak doku yaralanması tekrarlanan gözlem altında yatan dokuları, çeşitli kanser riskini artırır çok sıcak içecekler33,34,35, alkolizm36,37nedeniyle karaciğer hasarı, tümör evrim tüketimi ise kanser terapisi38, sonra tarafından 39,40ve anti-kanser tedavisi41,42,43,44 döngüleri arasındaki aralıkları sırasında ortaya çıkan normal dokuların üzerinden yeni kanser gelişimi . TRUE ise, anastasis hedefleme önlemek ya da kanser gelişme ve ilerleme tutuklandı. Biz ölmekte olan germ hücreleri açlıktan kaynaklı anastasis yeniden beslenen Drosophila19geçmesi bulduk.  Germ hücreleri DNA hasarı Anastasis ortaya çıkarsa, hesap çevresel stres uzun süreli gözlem için genetik hastalıklar gelişimini destekler olabilir. Örneğin, kıtlıklar diyabet ve Koroner kalp hastalıkları45gibi transgenerational devralınabilir hastalıkların gelişmesine katkıda bulunmak. Bu nedenle, anlayış anastasis devralınabilir hastalıklar bu potansiyel mekanizması tarafından neden geliştirme önleme stratejileri neden olabilir.
Anastasis keşfi koşum ve yenilikçi tedaviler geliştirmek için doğrudan için sebep ve sonucu anastasis Canlı hayvanlarda eğitim esastır. Ancak, bu teknik olarak tanımlamak ve anastatic hücreleri vivo içindeçünkü hücre ölüm işlemi kurtarılan hücreler morfolojik normal sağlıklı hücrelerden ayırt edilemez görünür ve hiçbir biyomarker anastasis izlemek için zordur tespit henüz17,18,21. Biz son zamanlarda yeni bir in vivo caspase Biyoalgılayıcı tanımlamak ve sonra caspase harekete geçirmek19,46, Apoptozis hayatta hücreleri izlemek için "CaspaseTracker"19, Özel Sigara İçilir bu sorunları çözmek için geliştirilen Hallmark apoptosis10,14. SCAT12,47, Apoliner48, CA-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51 ve iCasper52 gibi "gerçek zamanlı" caspase biyosensörler dan ayırt devam caspase aktivite algılayan, CaspaseTracker Biyoalgılayıcı, ayrıca kalıcı olarak hücreleri bu hızlı caspase etkinliği bile geçici etiket yeteneği sahiptir. Bu nedenle, caspase-aracılı ters hücre sonra ölüm süreci içinde vivoCaspaseTracker Biyoalgılayıcı anastasis uzun vadeli izlenmesini sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1024">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">CONSUMABLES AND REAGENTS</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Vectashield mounting medium</td>
			<td style="width:229px;">Vector Products</td>
			<td style="width:225px;">H-1000</td>
			<td>Antifade mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield mounting medium (with DAPI)</td>
			<td style="width:229px;">Vector Products</td>
			<td style="width:225px;">H-1200</td>
			<td>Antifade mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td style="width:229px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:225px;">#505 (110mm, #5)</td>
			<td>Dumont tweezer biology grade, stainless steel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanging Drop Slides</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:225px;">12-565B</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">H1399</td>
			<td>DNA stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mitotracker Red CMXRos&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:225px;">M-7512</td>
			<td>Mitochondria stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody</td>
			<td style="width:229px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:225px;">#9661</td>
			<td>Stain for active fragment of caspase-3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Bovine Serum Albumin (BAS)</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:225px;">A8806</td>
			<td>Blocking agent for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:225px;">114-056-101</td>
			<td>Medium for washing and immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton&#8482; X-100</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:225px;">T8787</td>
			<td>Detergent for cell permeabilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Name</td>
			<td style="width:229px;">Company</td>
			<td style="width:225px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSM780 confocal microscope</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:225px;">N/A</td>
			<td>Drosophila dissection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W</td>
			<td style="width:229px;">AmScope</td>
			<td style="width:225px;">WBM99316&#160;</td>
			<td>Light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting anastasis in vivo by caspasetracker biosensor

Anastasis (Yunanca "hayat yükselen" için) sayede hücreler ölüyor genellikle özünde geri dönüşümsüz olarak kabul edilir son aşama hücre ölüm işlemleri tersine çevirebilirsiniz bir yeni keşfedilen hücre kurtarma olgudur. Anastasis teşvik ilke kurtarma yaralı ya da koru içinde cardiomyocytes veya nöronlar, böylece doku kurtarma kolaylaştırmak gibi değiştirmek zor olan hücreler. Diğer taraftan, kanser hücre ölümü emin olun ve nüks olasılığını azaltmak sonra anti-kanser tedavileri, Apoptozis geçiren anastasis kanser hücrelerinde bastırmak. Ancak, bu çalışmalar anastasis Canlı hayvanlarda tabi hücre kaderi izleme araçları eksikliği ile engel olmuştur. Morfolojik normal görünümlerini kurtarma sonra rağmen hücre ölüm süreci tersine çevirdin mi hücreleri tanımlamak için mücadeledir. Bu zorluk üstesinden gelmek için biz Drosophila ve tanımlamak ve kalıcı olarak anastatic hücreleri içinde vitro veya vivo içindeizlemek memeli CaspaseTracker Biyoalgılayıcı sistemleri geliştirdik. Burada, üretimi ve CaspaseTracker çift Biyoalgılayıcı sistemini algılamak ve hücre ölüm bizi canlı tutan geçici maruz kaldıktan sonra anastasis Drosophila melanogaster içinde izlemek için in vivo protokolleri mevcut. Geleneksel biyosensörler ve protokolleri hücreleri aktif olarak geçiren apoptotik hücre ölümü etiketleyebilirsiniz iken, CaspaseTracker Biyoalgılayıcı sonra caspase etkinleştirme - son aşama apoptosis, damgasını iyileşti hücreleri kalıcı olarak etiketleyebilirsiniz ve aynı anda etkin apoptotik süreçleri tanımlamak. Bu Biyoalgılayıcı da diğer formları doğrudan veya dolaylı olarak caspase etkinliği söz konusu hücre ölümü çalıştı hücre kurtarma izleyebilirsiniz. Bu nedenle, bu iletişim kuralı sürekli bu hücreler ve biyolojik işlevleri, moleküler mekanizmaları, fizyolojik ve patolojik sonuçları ve tedavi edici etkileri gelecekteki çalışmaları kolaylaştırmak onların döl kaderi takip etmemizi sağlar Anastasis. Biz de bu apoptotik sigara caspase aktivite içinde vivogörüntüleyen anastasis geçmesi hücreleri ayırt etmek için uygun kontrollerin tartışıyorlar.

Hızlandırılmış canlı cep mikroskobu yolu anastasis kültürlü hücreleri20için güvenilir bir yöntem olmakla birlikte, kurtarılan hücreleri morfolojik ayırt edilemez görüntülendiðinden hangi hücrelerin anastasis hayvanlarda, uğramıştır tanımlamak zordur hücre ölümü teşebbüs değil normal sağlıklı hücreler. Örneğin, yanıt olarak hücre ölümü Apoptozis1,2,14, hücre bü...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor at JoVE.com

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis teknik olarak hücre ölüm süreci tersine çevirdin mi hücreler morfolojik normal sağlıklı hücrelerden ayırt edilemez olabilir çünkü vivo içinde tespit etmek zordur. Burada tarif biz tespit ve yeni geliştirilen vivo içinde CaspaseTracker Biyoalgılayıcı sistemimizi kullanarak canlı hayvanlarda anastasis geçmesi hücreleri izleme için kullanılan protokol.

Anastasis Vivo içinde CaspaseTracker Biyoalgılayıcı tarafından tespit

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

detecting-anastasis-in-vivo-by-caspasetracker-biosensor

Research

JoVE Journal

Medicine

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

9.2K Görüntüleme.  Johns Hopkins University School of Medicine. Anastasis teknik olarak hücre ölüm süreci tersine çevirdin mi hücreler morfolojik normal sağlıklı hücrelerden ayırt edilemez olabilir çünkü vivo içinde tespit etmek zordur. Burada tarif biz tespit ve yeni geliştirilen vivo içinde CaspaseTracker Biyoalgılayıcı sistemimizi kullanarak canlı hayvanlarda anastasis geçmesi hücreleri izleme için kullanılan protokol.

Video: Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
contractions. The pelvic limb of an anesthetized dog is immobilized in a stereotactic frame to align the tibia at a right angle to the femur. Adhesive wrap affixes the 
paw to a pedal mounted on the shaft of a servomotor to measure torque. Percutaneous nerve stimulation activates pelvic limb muscles of the paw to either push (extend) or 
pull (flex) against the pedal to generate isometric torque. Percutaneous tibial nerve stimulation activates tibiotarsal extensor muscles. Repeated eccentric (lengthening) 
contractions are induced in the tibiotarsal flexor muscles by percutaneous peroneal nerve stimulation. The eccentric protocol consists of an initial isometric contraction 
followed by a forced stretch imposed by the servomotor. The rotation effectively lengthens the muscle while it contracts, e.g., an eccentric contraction. During 
stimulation flexor muscles are subjected to an 800 msec isometric and 200 msec eccentric contraction. This procedure is repeated every 5 sec. To avoid fatigue, 4 min rest 
follows every 10 contractions with a total of 30 contractions performed.

In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and painless method to measure canine hindlimb muscle strength and muscle response to repeated eccentric contractions.

Vivo Köpek Kas Fonksiyon Testi

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

Tıp

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

Hücre Takip için vivo 19 F MRG

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Detecting Abnormalities in Choroidal Vasculature in a Mouse Model of Age-related Macular Degeneration by Time-course Indocyanine Green Angiography

Indocyanine Green&#160;Angiography (or ICGA) is a technique performed by ophthalmologists to diagnose abnormalities of the choroidal and retinal vasculature of various eye diseases such as age-related macular degeneration (AMD). ICGA is especially useful to image the posterior choroidal vasculature of the eye due to its capability of penetrating through the pigmented layer with its infrared spectrum. ICGA time course can be divided into early, middle, and late phases. The three phases provide valuable information on the pathology of eye problems. Although time-course ICGA by intravenous (IV) injection is widely used in the clinic for the diagnosis and management of choroid problems, ICGA by intraperitoneal injection (IP) is commonly used in animal research. Here we demonstrated the technique to obtain high-resolution ICGA time-course images in mice by tail-vein injection and confocal scanning laser ophthalmoscopy. We used this technique to image the choroidal lesions in a mouse model of age-related macular degeneration. Although it is much easier to introduce ICG to the mouse vasculature by IP, our data indicate that it is difficult to obtain reproducible ICGA time course images by IP-ICGA. In contrast, ICGA via tail vein injection provides high quality ICGA time-course images comparable to human studies. In addition, we showed that ICGA performed on albino mice gives clearer pictures of choroidal vessels than that performed on pigmented mice. We suggest that time-course IV-ICGA should become a standard practice in AMD research based on animal models.

Indocyanine Green Angiography (or ICGA) performed by tail vein injection provides high quality ICGA time course images to characterize abnormalities in mouse choroid.

Zaman kurs Indocyanine Yeşil Anjiyografi ile Yaşa Bağlı Makula Dejenerasyonu Fare Modeli Koroid vaskülatürüne anormallikleri tespit

Indocyanine Green&#160;Angiography (or ICGA) is a technique performed by ophthalmologists to diagnose abnormalities of the choroidal and retinal ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

Rahim içi Telemetri Fare Kontraktil Basıncını Ölçmek<em&gt; İn Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel. 
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

Konfokal Optik Görüntüleme ile Rose Bengal Fototromboz<em&gt; In Vivo</em&gt;: Tek Gemi İnme Bir Model

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury

Following injury to the CNS, astrocytes undergo a broad range of biochemical, morphological, and molecular changes collectively referred to as reactive astrogliosis. Reactive astrocytes exert both inflammatory and protective effects that inhibit and promote, respectively, neural repair. The mechanisms underlying the diverse functional properties of reactive astrogliosis are not well understood. Achieving a greater understanding of these mechanisms is critical to developing therapeutic strategies to treat the injured CNS. Here we demonstrate a method to trigger reactive astrogliosis in the adult mouse forebrain using a forebrain stab lesion. This lesion model is simple, reliable, and requires only a stereotaxic device and a scalpel blade to produce the injury. The use of stab lesions as an injury model in the forebrain is well established and amenable to studies addressing a broad range of neuropathological outcomes, such as neuronal degeneration, neuroinflammation, and disruptions in the blood brain barrier (BBB). Thus, the forebrain stab injury model serves as a powerful tool that can be applied for a broad range of studies on the CNS response to trauma.

Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury

This article describes a detailed protocol to produce a forebrain stab injury in adult mice. The stab injury induces severe reactive gliosis and glial scar formation which can be subsequently examined by standard immunohistochemistry methods.

Reaktif gliozis Tetikleme<em&gt; In Vivo</em&gt; Bir Önbeyin Stab Yaralanma tarafından

Following injury to the CNS, astrocytes undergo a broad range of biochemical, morphological, and molecular changes collectively referred to as reactive ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

Kinomic Profil Yöntemi ve İlaç Tepki Testi için 3D İnsan BIOGEL Kültür Sisteminin Kullanılması Microtumors ve Hasta kaynaklı Glioblastom Hücreleri Üretimi

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

İnsan Tümör ksenogratflarının gelen Fare Hücrelerinin tükenmesi Anlamlı Hedef Hücre Alt Analizi geliştirir

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Regenerative Therapy by Suprachoroidal Cell Autograft in Dry Age-related Macular Degeneration: Preliminary In Vivo Report

This study is aimed at examining whether a suprachoroidal graft of autologous cells can improve best corrected visual acuity (BCVA) and responses to microperimetry (MY) in eyes affected by dry Age-related Macular Degeneration (AMD) over time through the production and secretion of growth factors (GFs) on surrounding tissue. Patients were randomly assigned to each study group. All patients were diagnosed with dry AMD and with BCVA equal to or greater than 1 logarithm of the minimum angle of resolution (logMAR). A suprachoroidal autologous graft by Limoli Retinal Restoration Technique (LRRT) was carried out on group A, which included 11 eyes from 11 patients. The technique was performed by implanting adipocytes, adipose-derived stem cells obtained from the stromal vascular fraction, and platelets from platelet-rich plasma in the suprachoroidal space. Conversely, group B, including 14 eyes of 14 patients, was used as a control group. For each patient, diagnosis was verified by confocal scanning laser ophthalmoscope and spectral domain-optical coherence tomography (SD-OCT). In group A, BCVA improved by 0.581 to 0.504 at 90 days and to 0.376 logMAR at 180 days (+32.20%) postoperatively. Furthermore, MY test increased by 11.44 dB to 12.59 dB at 180 days. The different cell types grafted behind the choroid were able to ensure constant GF secretion in the choroidal flow. Consequently, the results indicate that visual acuity (VA) in the grafted group can increase more than in the control group after six months.

Regenerative Therapy by Suprachoroidal Cell Autograft in Dry Age-related Macular Degeneration: Preliminary In Vivo Report

The goal of this study is to assess whether the suprachoroidal graft of adipose-derived stem cells included in the stromal vascular fraction and platelets derived from platelet-rich plasma by the Limoli Retinal Restoration Technique can improve visual acuity and retinal sensitivity responses in eyes affected by dry age-related macular degeneration.

Rejeneratif tedavisi ile Suprachoroidal hücre otogrefti içinde Kuru yaşa bağlı makula dejenerasyonu: ön Vivo içinde rapor

This study is aimed at examining whether a suprachoroidal graft of autologous cells can improve best corrected visual acuity (BCVA) and responses to ...

Preparation of Naringenin Solution for In Vivo Application

The preparation of a compound (phytochemical) solution is an overlooked but critical step prior to its application in studies such as drug screening. The complete solubilization of the compound is necessary for its safe use and relatively stable results. Here, a protocol for preparing naringenin solution and its intraperitoneal administration in a high-fat diet and streptozotocin (STZ)-induced diabetic model is demonstrated as an example. A small amount of naringenin (3.52-6.69 mg) was used to test its solubilization in solvents, including ethanol, dimethylsulfoxide (DMSO), and DMSO plus Tween 80 reconstituted in physiological saline (PS), respectively. Complete solubilization of the compound is determined by observing the color of the solution, the presence of precipitates after centrifugation (2000 x g for 30 s), or allowing the solution to stand for 2 h at room temperature (RT). After obtaining a stable compound/phytochemical solution, the final concentration/amount of the compound required for in vivo studies can be prepared in a solvent-only (no PS) stock solution, and then diluted/mixed with PS as desired. The antidiabetic osteoporotic effects of naringenin in mice (intraperitoneal administration at 20 mg/kg b.w., 2 mg/mL) were assessed by measuring blood glucose, bone mass (micro-CT), and bone resorption rate (TRAP staining and ELISA). Researchers looking for detailed organic/phytochemical solution preparations will benefit from this technique.

Preparation of Naringenin Solution for In Vivo Application

Here, the protocol presents the preparation of naringenin solution for in vivo intraperitoneal administration. Naringenin is fully dissolved in a mixture of dimethylsulfoxide, Tween 80, and saline. The antidiabetic osteoporotic effects of naringenin were assessed by blood glucose testing, tartrate-resistant acid phosphatase staining, and enzyme-linked immunosorbent assay.

In Vivo Uygulama için Naringenin Solüsyonunun Hazırlanması

The preparation of a compound (phytochemical) solution is an overlooked but critical step prior to its application in studies such as drug screening. The ...